细菌内毒素，又称热原，是革兰氏阴性菌和部分蓝藻细胞壁的脂多糖复合物，主要由菌体死亡解体释放.内毒素是常见的外源性致热原，属于强免疫刺激因子，进入机体后能导致严重的炎症级联反应，引起一系列的病理生理反应.机体对内毒素反应极为敏感，Elin等^[1]报道将0.1～0.5 ng ·kg^-1内毒素进行体内注射即可引起人体发热.为了保障患者安全，与血液接触的药品和医疗器械都需要严格控制内毒素水平，与血液接触的水如透析用水、 制药用水等的内毒素污染也受到关注和严格控制^[2].

近年来，饮用水和水环境的内毒素所致健康风险开始受到关注.当水体环境发生微生物增殖或者蓝藻暴发时，菌体死亡释放的内毒素可通过血液、 呼吸、 胃肠等暴露途径引发潜在的健康风险.虽然目前国内外尚未将细菌内毒素列入饮用水和再生水水质标准，但是近年来国外有关地表水、 地下水、 饮用水、 再生水和污水处理厂出水等内毒素污染的研究逐年增多.如日本淀川的内毒素活性为311～2430 EU ·mL^{-1 [3]}； 加拿大蒙特利尔的13个地表水源的内毒素活性为32～1188 EU ·mL^{-1 [4]}； 芬兰的水源在蓝藻暴发后内毒素活性达到20～38000 EU ·mL^{-1 [5]}； 科威特的自来水(海水淡化)内毒素活性为2.4～33.8 EU ·mL^{-1 [6]}. 2013年，笔者调查北京市城区12个管网末梢水的内毒素范围为0.1～9.2 EU ·mL^-1, 市售的9种瓶装饮用水内毒素范围为<0.004～16.0 EU ·mL^-1； 自来水厂混凝沉淀等传统工艺对内毒素去除率达63%，而活性炭吸附池和氯消毒工艺都促进了内毒素的释放^{[7, 8]}.相比之下，饮用水和水环境内毒素污染研究的国内报道较少，应该得到更多的关注. 1 细菌内毒素的特性

内毒素具有广泛生物活性，与人类多种疾病相关.内毒素进入机体后，并非直接引起机体反应，而是与机体靶细胞作用诱导产生一系列炎症介质和细胞因子，如白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、 干扰素(interferon, IFN)等.这些细胞因子相互诱导和调节，导致更多的炎症细胞因子释放，形成一种“瀑布效应”的恶性循环，迅速活化不同组织器官的细胞，从而引发机体严重的病理生理反应，导致机体代谢、 激素水平和神经内分泌的改变，造成细胞功能异常，导致出现发热、 低血压、 心动过速、 休克、 多器官功能衰竭甚至死亡等.此外，细菌内毒素具有极强的耐热性(100℃高温下加热1 h仍无法灭活)，160℃条件下加热2～4 h，或用强碱、 强酸或强氧化剂加温煮沸30 min才能破坏它的生物活性，因此常规消毒和处理措施不易将其去除.

细菌内毒素主要由O—特异性链、 核心多糖、 类脂A三部分组成(见图1).类脂A由氨基葡萄糖、 磷酸和脂肪酸组成，是脂多糖不可缺少的组成部分，几乎参与内毒素介导的所有生物活性.类脂A的结构差异会导致内毒素生物活性的不同.不同种属细菌的类脂A部分的脂肪酸排列不同，也会导致内毒素活性的差异； 同一种属的不同菌株的细菌，其内毒素的类脂A所含脂肪酸数目及种类不同； 处于不同生长期的细菌，其类脂A所含的脂肪酸种类及数目可能不同，这都会导致内毒素活性有所差异.来源于革兰氏阴性菌的内毒素与蓝藻内毒素具有结构差异，其生物活性比蓝藻内毒素高10倍以上^[5,9,10].70年代以前，国内外都采用质量单位纳克(ng)来计量内毒素，但是这种计量方法并不科学.因为相同质量的内毒素，由于菌株来源不同，提取方法不同以及所加赋形剂不同，因此其生物活性相差很大. 80年代以后内毒素计量单位改为活性单位(endotoxin units, EU)，目前国内外对EU与ng的转换系数并未统一，一般按1 ng=5～10 EU换算.

图1

Fig. 1

图1 内毒素的典型结构示意 [11] Fig.1 Schematic diagram of endotoxin structure

家兔法是最原始的内毒素检测方法，1923年由Seibert首次提出，1942年美国药典首先将家兔法作为药品的热原检查方法，1953年中国药典开始收录该方法^[12].家兔法是将一定剂量的待测样品经静脉途径注入家兔体内，在规定的时间内观察家兔体温升高情况，以判定样品中所含内毒素的限量是否符合规定.家兔法能够反映出热原物质引起的哺乳动物升温过程，既能进行内毒素的检测，也能进行非内毒素致热原的检测.由于家兔的种属差异和个体差异大，家兔法检测结果重复性差，而且实验价格昂贵、 时间长.目前鲎试验已经取代家兔法成为法定的内毒素检查方法，但是家兔法仍是药典认可的内毒素检测方法，对鲎试验不能检测的样品仍需要以家兔法检测. 2.2 现行的法定内毒素检测方法——鲎试验

鲎试验是目前药典规定的内毒素检测方法.鲎又称马蹄蟹，是栖生于海洋中的一种古老的节肢动物，已存在大约3.5亿年，有“活化石”之称.1963～1964年Levin等^[13]首次对细菌引起鲎血凝聚的机制进行报道，认为鲎血中阿米巴细胞与内毒素发生一系列酶促反应导致凝集反应.内毒素可以启动鲎试剂中的C因子使其成为活化C因子，活化C因子继而启动B因子使其成为活化B因子，活化的B因子再激活凝固酶原，使凝固酶原活化成凝固酶； 凝固酶能切断凝固蛋白原中特定的精氨肽链，形成凝固蛋白产生凝胶(见图2).鲎试验中最重要的试剂是鲎试剂，是鲎血的阿米巴细胞(即变形细胞)溶解物的冷冻干燥品.目前常用的鲎试剂有美洲鲎试剂(Limulus amebocyte lysate，LAL)和东方鲎试剂(Tachypleus amebocyte lysate，TAL)等，我国多采用TAL试剂，其反应机制基本相同.目前鲎试验主要有3种方法：凝胶法、 浊度法和显色法，其机制如图2所示.凝胶法是基于判断凝胶形成的检测方法，较快速，经济方便，但只能用于定性和半定量检测.浊度法是采用分光光度计检测凝胶形成过程中浊度的变化.显色法是利用凝固酶水解显色底物产生的显色基团，使吸光度发生变化.浊度法和显色法两种又统称光度法，根据检测过程的不同分为终点浊度法/动态浊度法和终点比色法/动态比色法.与凝胶法相比，浊度法和显色法所得数据更精确，可以用于定量检测，而且快速、 简便、 重复性好、 灵敏度高、 易推广和标准化、 能进行大量样品的分析.

图2

Fig. 2

图2 鲎试剂与内毒素的反应机制 Fig.2 Mechanism of reaction between endotoxin and LAL/TAL reagent

鲎试验的灵敏度远远高于家兔法，操作简单、 成本低廉、 标准化程度高、 重复性好.自从1980年《美国药典》第20版收录鲎试验以来，各国药典等相继收录该方法.1993年中国药典第二增补本开始收录鲎试验用于检测内毒素，2005年版中国药典正式将光度法(浊度法和显色法)收录作为内毒素的定量测试方法^[14]. 2.3 气相色谱-质谱检测内毒素分子的3-羟基脂肪酸

Binding等^[15]和Saraf等^[16]利用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)检测内毒素分子的3-羟基脂肪酸来表征内毒素含量，但是检测结果显示3-羟基脂肪酸的含量与内毒素的生物活性无均一的关联性.由于3-羟基脂肪酸是内毒素分子中类脂A的一个典型结构，并非活性基团，因此GC-MS检测内毒素分子的3-羟基脂肪酸不能反映内毒素生物学活性，因此限制了该方法的进一步应用. 2.4 凝胶过滤色谱-质谱检测内毒素分子的KDO成分

内毒素的核心多糖含有特殊的酮糖(3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖，KDO)，KDO成分与类脂A的氨基葡萄糖连接.Rybka等^[17]利用凝胶过滤色谱-质谱(gel permeation chromatography-mass spectrometry, GLC-MS)检测内毒素的KDO成分，结果表明该方法适用于测定人体体液样品，但对于含有多种细菌的实际环境样品，该方法却不能准确检测内毒素水平.KDO成分是内毒素分子中核心多糖的一个典型结构，不是活性基团，因此GLC-MS检测内毒素的KDO成分也不能准确表征内毒素生物学活性. 2.5 重组C因子方法 在鲎试验中，内毒素激活C因子并启动整个鲎血的血凝级联系统，其中C因子是对内毒素敏感的丝氨酸蛋白酶.目前有研究采用重组C因子方法进行内毒素检测^[18]，重组C因子方法克服了鲎试剂的生产批次不同而导致的检测结果差异.重组C因子方法不涉及引起鲎试验中旁路反应的G因子，避免因葡聚糖产生假阳性结果. Alwis等^[19]采用重组C因子方法对居室空气内毒素进行检测，与鲎试验的检测结果相比，两种方法的相关系数为0.86. Gehr等^[4]采用重组C因子和鲎试验两种方法检测相同水样，发现此两种检测方法虽然机制相似，但是检测结果差异较大，相关系数为0.137～0.966. 2.6 酶联免疫测定法

目前报道的基于酶联免疫测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA方法)的内毒素检测方法，主要有以下两种方法：一种是基于ELISA方法与鲎试验的结合，用酶联免疫吸附的方法以抗凝固酶原的单克隆抗体，测定经鲎试验后样品中残存的凝固酶原量，得到内毒素与吸附呈反比的曲线，通过标准曲线检测样品内毒素^[20].另一种是基于内毒素的致热原理，即外加内毒素刺激巨噬细胞后产生内热原物质，如肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素1(IL-1)等，采用ELISA方法对内毒素进行定量测定^[21].从目前研究看，基于ELISA方法的内毒素检测还有待于进一步提高精确度和加强验证. 2.7 生物传感器

国内外有采用生物传感器用于内毒素检测的报道，较多见的是压电生物传感器.Muramatsu等^[22]根据内毒素与鲎试剂发生凝集反应后溶液黏度的变化，建立一种基于镀钯9MHz AT切割石英晶体的压电传感器，最低检测限能达到1 pg ·mL^-1.熊兴良等^[23]研制了一种基于石英晶体的液体阻尼效应压电生物传感器，该传感器能灵敏地响应内毒素与LAL凝胶反应过程引起液体流变学性质(黏度和密度)变化，虽然检测限和检测时间有较大的提高，但样品的黏滞度、 浑浊度和密度对结果仍有影响. 3 水体环境样品内毒素检测的干扰因素分析

目前，现有研究中水体环境样品的内毒素检测大多数都采用鲎试验.鲎试验属于生物毒性测试方法，不是精确的分析方法.一些非内毒素分子也能引起相似的凝集现象，如β-葡聚糖及其类似物存在着G因子反应旁路(如图2)，使鲎试剂发生凝聚反应，引起假阳性结果.由于鲎试验的本质是一系列的酶促反应，影响酶促反应的因素如络合物、 生化试剂、 抗生素、 消毒剂、 某些无机离子等均会干扰鲎试验中凝胶的形成.此外，鲎试剂属于生物试剂，样品中的化学物质、 蛋白和其他试剂也容易引起鲎试剂的变性.能够引起内毒素分子吸附、 屏蔽、 聚集作用的因素会引起鲎试验的严重干扰，例如高浓度的阴阳离子、 特异性离子、 C因子(即丝氨酸蛋白)的抑制剂等.在光度法鲎试验中，可能影响光密度值的因素，如某些溶液的色度或者浊度较高等，都会干扰检测结果.药典规定，只有收录的药品和医疗器械才可以采用鲎试验检测内毒素，如美国药典24版共收录579种药品适于细菌内毒素检查，中国药典2005版规定168个品种适合以鲎试验进行内毒素检测.

为了确定样品的干扰情况和保证数据可靠性，鲎试验之前必须先做样品的干扰试验，以加标回收率来分析样品对鲎试验的抑制/增强效果^[14].中国药典2005版规定鲎试验的加标回收率控制在50%～200%之间^[14].目前，最常用的去除干扰方法是对样品多倍稀释，但是对于干扰严重的样品，多倍稀释后内毒素活性可能会极低，甚至不能达到最低检测限，这样仍难以保证合适的加标回收率.由于内毒素分子的耐热性强、 不易挥发，也可以采取氮吹或加热的方法对挥发性、 不耐热的干扰成分进行排除.采用鲎试验检测组分复杂的水环境样品，会有更多的干扰因素.例如，水样的pH值严重干扰鲎试验，样品必须保证在pH 6.0～8.0范围内进行，采用TAL试剂时最好将样品调节pH 6.5～7.5^[24].对于过酸或者过碱的水样，需要采用多倍稀释或者无热原缓冲溶液调节pH值.水样中添加高浓度的盐类物质，也会干扰鲎试验的准确性，主要原因是蛋白质的盐析作用破坏了鲎试剂的酶活性，降低酶促反应速度； 其次，盐类引起水样过酸过碱也会干扰鲎试验的检测.水中盐类浓度高时，必须多倍稀释后才能进行鲎试验，如果仍达不到合格的回收率，则不适于进行内毒素检测.此外，水样的添加剂或者使用的试验器材可能会影响鲎试验结果，例如水中的螯合剂EDTA可以干扰鲎试验的凝集反应； 滤纸或者过滤材料中含有葡聚糖，会引起鲎试验的旁路反应，从而引起检测结果的假阳性. 4 结论

随着人们对内毒素所致健康风险的关注，内毒素的研究领域已由原来的生物医药领域逐渐向外扩展.近年来，饮用水和水环境领域的内毒素污染已经成为国外研究的热点.鲎试验是药典规定的内毒素检测方法，被称为现行内毒素检测的“金标准”，但是鲎试验属于生物毒性测试方法，复杂样品尤其是环境样品中会存在多种干扰因素.此外，鲎试剂的制备需要捕杀大量鲎，随着人类对鲎的保护越来越重视，鲎资源的利用也逐渐受到限制.目前，随着现代分析测试技术发展和交融，出现了多种新型的内毒素检测方法，但是都没有得到认可，需要进一步改进和验证.因此，开发新型理化检测技术替代传统的鲎试验，并探索将之用于检测复杂组分的样品(如实际水体样品)，是内毒素检测方法研究的重要任务，也是水环境微生物学安全研究的重要内容.