环境科学  2014, Vol. 35 Issue (1): 279-285   PDF    
引用本文
姜东生, 石小荣, 崔益斌, 李梅. 3种典型污染物对水生生物的急性毒性效应及其水质基准比较[J]. 环境科学, 2014, 35(1): 279-285.
JIANG Dong-sheng, SHI Xiao-rong, CUI Yi-bin, LI Mei. Acute Toxicity of Three Typical Pollutants to Aquatic Organisms and Their Water Quality Criteria[J]. Environmental Science, 2014, 35(1): 279-285.
3种典型污染物对水生生物的急性毒性效应及其水质基准比较
姜东生, 石小荣, 崔益斌, 李梅    
南京大学环境学院, 污染控制与资源化研究国家重点实验室, 南京 210023
收稿日期: 2013-4-16; 修订日期: 2013-6-3.
基金项目： 国家水体污染控制与治理科技重大专项（2012ZX07501-003-002）；国家自然科学基金项目（21077052）；江苏省科技支撑项目（BE2012737）
作者简介：姜东生（1987~），男，硕士研究生，主要研究方向为环境毒理学，E-mail：jiangds1@163.com
通讯联系人,E-mail:meili@nju.edu.cn
摘要：我国本土水生生物急性毒性数据较少，通过研究Cr（Ⅵ）、2，4，6-三氯酚和硝基苯对蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、斜生栅藻（Scenedesmus obliqnus）和摇蚊幼虫（Chironomidae larvae）的急性毒性效应，为制定和完善我国水质基准提供本土数据支持. 结果表明，Cr（Ⅵ）、2，4，6-三氯酚和硝基苯对蛋白核小球藻的96 h半抑制效应浓度（96 h-EC50）依次为1.34、4.55和86.58 mg·L-1；对斜生栅藻的96 h-EC50依次为19.52、3.71和74.15 mg·L-1；当Cr（Ⅵ）达到1500 mg·L-1时，摇蚊幼虫48 h死亡率仅为15%，2，4，6-三氯酚和硝基苯对摇蚊幼虫的48 h半致死效应浓度（48 h-LC50）分别为9.29 mg·L-1和98.34 mg·L-1. 3种典型污染物的毒性评估结果显示，Cr（Ⅵ）对小球藻为高等毒性、对斜生栅藻为中等毒性，2，4，6-三氯酚对两种微藻均为高等毒性，硝基苯对两种微藻均为中等毒性；3种污染物对摇蚊幼虫的毒性顺序为：2，4，6-三氯酚>硝基苯>Cr（Ⅵ）.
关键词： 六价铬     2,4,6-三氯酚     硝基苯     水生生物     急性毒性     水质基准    
Acute Toxicity of Three Typical Pollutants to Aquatic Organisms and Their Water Quality Criteria
JIANG Dong-sheng, SHI Xiao-rong, CUI Yi-bin, LI Mei     
State Key Laboratory of Pollution Control & Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China
Abstract: Two species of microalgae Chlorella pyrenoidosa, Scenedesmus obliqnus and a red worm Chironomidae larvae were selected as test organisms in determining the acute toxicity effects of Cr(Ⅵ), 2,4,6-trichlorophenol and nitrobenzene. The results were able to provide more information on water quality criteria and more data on their toxicity to indigenous aquatic organisms in China. The 96 h-EC50 values of Cr(Ⅵ), TCP and nitrobenzene on C. pyrenoidosa were 1.34 mg·L-1, 4.55 mg·L-1 and 86.58 mg·L-1, respectively, while those of S. obliqnus were 19.52 mg·L-1, 3.71 mg·L-1 and 74.15 mg·L-1, respectively. The mortality of C. larvae was 15% when the concentration of Cr(Ⅵ) was increased to 1500 mg·L-1. The 48 h-LC50 values of TCP and nitrobenzene on C. larvae were 9.29 mg·L-1and 98.34 mg·L-1,respectively. These results indicated that Cr(Ⅵ) showed higher toxicity to C. pyrenoidosa, while only moderate toxicity to S. obliqnus; TCP had higher toxicity to C. pyrenoidosa and S. obliqnus; while nitrobenzene was only moderately toxic to both species of microalgae. The toxicity among the three pollutants to C. larvae was in the order of TCP>nitrobenzene>Cr(Ⅵ).
Key words: hexavalent chromium     2,4,6-trichlorophenol     nitrobenzene     aquatic organisms     acute toxicity effect     water quality criteria    

随着工农业的快速发展，各种污染物的排放量与日俱增. 有研究证实，工业废水成分复杂，含有多种对人体具有潜在危害的可导致生物细胞遗传损伤作用的化学物质[1, 2]，如重金属、 多环芳烃、 硝基苯、 酚类和苯系化合物等，不仅对水生生物造成直接损害，而且还对其生长发育产生不可逆的影响，最终通过食物链的迁移和富集危及人体健康[3, 4]. 重金属铬[Cr(Ⅵ)]、 2，4，6-三氯酚(TCP)和硝基苯作为中国水环境优先控制污染物黑名单中的3种典型污染物[5]，对水质、 水生生物以及人体造成一定程度的潜在影响和危害. 已有研究显示，Cr(Ⅵ)在细胞内参与氧化还原过程，影响细胞正常的新陈代谢，其化合物具有致癌、 致畸作用[6, 7]; TCP和硝基苯则易通过脂溶作用进入细胞体内，形成活性氧自由基类物质，引发脂质过氧化反应，导致自由基对生物体的损伤并使生物膜变性，致使组织破坏和老化、 脂肪代谢异常等[8, 9].

重金属铬、 TCP和硝基苯作为我国水域中重要的污染物，相关污染事件时有发生，如云南曲靖铬污染事件[10]、 松花江硝基苯泄漏事件[11]等，这些污染事件均对环境和社会造成巨大影响. 研究上述污染物的生态毒性，对于制定相关安全阈值、 开展水生态风险评估以及突发事件处理都具有重要意义.

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)隶属于绿藻门(Chlorophyta)小球藻属(Chlorella)，斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)隶属于绿藻门(Chlorophyta)栅藻属(Scenedesmus)，摇蚊幼虫(Chironomidae larvae)隶属于双翅目(Diptra)摇蚊科(Chironmidae)昆虫，三者均为我国常见淡水生物，作为水生生态系统中的初级生产者和初级消费者，是我国水环境监测的优良指示生物[12]. 本研究以这3种本土水生物种作为受试生物，通过急性毒性实验研究Cr(Ⅵ)、TCP和硝基苯的毒性效应，以期为我国水质基准研究提供一定参考.

1 材料与方法
1.1 实验材料

蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)和斜生栅藻(S. obliqnus)由中国科学院水生生物研究所淡水藻类藻种库(FACHB)提供，采用SE培养基在光照培养箱中扩大培养[13]; 摇蚊幼虫(C. larvae)购自南京市夫子庙花鸟虫鱼市场，实验室驯养后进行实验. 化学试剂K2Cr2O7、 TCP和硝基苯均为分析纯.

1.2 实验方法
1.2.1 微藻培养及染毒

取处于对数生长期的蛋白核小球藻和斜生栅藻，接种光密度值(D680)为0.1左右，密度约为2×105~6×105 ind ·mL-1，分别添加Cr(Ⅵ)母液，使其终浓度分别为0.05、 0.1、 1、 5 mg ·L-1和0.1、 1、 10、 50 mg ·L-1; 添加TCP母液，终浓度均为0.1、 1、 5、 10 mg ·L-1; 添加硝基苯母液，终浓度均为1、 10、 50、 100 mg ·L-1. 每个浓度 3 个平行，并设空白对照组，其中TCP和硝基苯暴露组中另设助溶剂(DMSO)对照组. 培养温度为25℃±1℃、 光照强度为80~90 μmol ·(m-2 ·s)-1，光暗周期为12 h ∶12 h，连续培养96 h. 每天定时摇动并随机更换位置，以减少实验误差.

1.2.2 微藻生长及毒性测定

通过血球计数板计数蛋白核小球藻和斜生栅藻细胞数，确定微藻细胞密度与培养液D680值之间的线性关系，结果见表 1，其中y为细胞密度(ind ·mL-1). 通过D680值反映染毒后藻细胞密度的变化，从而反映污染物对微藻的毒性强度.

表 1 微藻细胞密度y与光密度值(D680)之间的线性关系 Table 1 Linear relationship between number of algae and optical density
1.2.3 摇蚊幼虫培养及毒性测定

选取四龄期摇蚊幼虫，置于曝气24 h自来水中驯养48 h后，挑选活动正常、 反应灵敏、 大小基本一致的摇蚊幼虫随机分组于玻璃器皿中(20 cm×15 cm×20 cm)进行实验，每组10只. 同时随机挑选10只摇蚊幼虫进行测量，其平均体长为1.47 cm，平均体重为25.6 mg. Cr(Ⅵ)采用静态实验，TCP和硝基苯采用半静态实验，每24 h更换溶液. 每天观察中毒症状和死亡情况，并将死亡摇蚊幼虫及时取出. 死亡标准为用玻璃棒轻压摇蚊幼虫的尾部没有反应.

预实验以10为公比做间隔设置浓度，以求出24 h的100％死亡浓度和48 h无死亡浓度. 正式实验以几何级数做间距，选择5个浓度[Cr(Ⅵ)、 TCP和硝基苯对应浓度组分别为500、 650、 850、 1 100、 1 500 mg ·L-1，7.2、 8.6、 10.4、 12.4、 15 mg ·L-1和90、 100、 112、 125、 140 mg ·L-1]，在3个依次的几何系列浓度中测得20％~80％的死亡率以估算LC50值. 每个实验组设置3个平行样，并设空白对照.

1.3 数据处理

各实验至少设3个平行，使用每组实验3个平行数据，取其平均值与标准差进行统计分析. 统计用Origin 7.5 软件进行ANOVA分析，将实验组与对照组进行显著性t检验，以P<0.05作为显著性依据. 根据微藻毒性实验数据，求出线性回归方程，计算96 h-EC50，并对剂量反应方程进行χ2检验，以验证其可靠性[14]. 摇蚊幼虫实验中自然死亡率采用Abbott公式加以校正，并用新复方极差法进行方差分析，48 h-LC50采用直线回归法计算[15].

2 结果与分析
2.1 3种污染物对微藻生长的影响

由图1和图2结果可见，与空白对照相比，溶剂对照组(DMSO)对藻类生长的影响很小，差异不显著. 低浓度Cr(Ⅵ)(<0.05 mg ·L-1)和硝基苯(<10 mg ·L-1)具有刺激微藻生长的作用，96 h后栅藻和小球藻的细胞密度均有一定增加，而低浓度TCP(<0.1 mg ·L-1)对两种微藻生长无明显影响; 高浓度Cr(Ⅵ)(>1.0 mg ·L-1)、 TCP(>1 mg ·L-1)和硝基苯(>10 mg ·L-1)则均能显著抑制微藻生长，96 h后细胞密度随污染物浓度增加而明显下降，且呈现较好的剂量-效应关系.

图1 3种污染物对蛋白核小球藻生长的影响 Fig. 1 Effects of Cr, TCP and nitrobenzene
on the growth of C. pyrenoidosa

图2 3种污染物对斜生栅藻生长的影响 Fig. 2 Effects of Cr, TCP and nitrobenzene on the growth of S. obliqnus
2.2 3种污染物作用下微藻的EC50及回归方程

3种典型污染物对两种微藻的剂量反应关系分别见表 2和表 3，其反应方程符合精度要求，Cr(Ⅵ)、 TCP和硝基苯对蛋白核小球藻的96 h-EC50分别为1.34、 4.55和86.58 mg ·L-1，对斜生栅藻的96 h-EC50分别为19.52、 3.71和74.15 mg ·L-1. 根据国家环境保护总局《新化学物质危害评估导则》(HJ/T 154-2004)中的分级标准[16]，得出Cr(Ⅵ)和TCP对蛋白核小球藻属高等毒性，硝基苯属中等毒性，毒性大小依次为：Cr(Ⅵ)>TCP>硝基苯; Cr(Ⅵ)和硝基苯对斜生栅藻属中等毒性，TCP属高等毒性，毒性大小依次为：TCP>Cr(Ⅵ)>硝基苯.

表 2 3种污染物作用下蛋白核小球藻的96 h-EC50及回归方程 Table 2 EC50 and regression equations for the three typical pollutants on C. pyrenoidosa in 96 hours

表 3 3种污染物作用下斜生栅藻的96 h-EC50及回归方程

Table 3 EC50 and regression equations for the three typical pollutants on S. obliqnus in 96 hours
2.3 3种污染物对摇蚊幼虫的急性毒性

通过3种污染物对摇蚊幼虫的毒性实验数据分析，得出各时间段浓度对数与概率单位的回归方程以及LC50的95%置信区间(表 4). 根据文献[16]，由表 4可以看出，3种典型污染物对摇蚊幼虫有不同的毒性作用. 其中(在24 h或48 h)Cr(Ⅵ)对摇蚊幼虫表现为低等毒性，TCP在24 h和48 h对摇蚊幼虫分别表现为中等毒性和高等毒性，硝基苯在24 h和48 h对摇蚊幼虫分别表现为低等毒性和中等毒性. 在48 h时，3种污染物对摇蚊幼虫的毒性大小依次为：TCP>硝基苯>Cr(Ⅵ).

表 4 3种污染物对摇蚊幼虫LC50的线性回归方程和95%置信区间 Table 4 Regression equations and 95% confidence interval for LC50 of the three typical compounds for C. larvae
2.4 3种污染物急性毒性数据及其水质基准比较

在水生生物基准方面，美国EPA 1985年发布了《确定国家保护水生生物水质基准定值及其应用的指南》，并于2003年提出了水生生物基准方法学修改建议，指出基准中要为每个化合物制定两个值：基准最大值(criteria maximum concentration，CMC)，又称急性基准值，是为了防止高浓度的污染物短期作用对水生生物造成急性毒性效应; 基准连续浓度(criteria continuous concentration，CCC)，又称为慢性基准值，是为了防止低浓度的污染物长期作用对水生生物造成的慢性毒性效应. 本研究中的3种典型污染物国内外水质基准与标准值如表 5所示，吴丰昌等[17]使用物种敏感度分布法推导Cr(Ⅵ)水质基准过程中，选取了81个生物物种的毒性数据，经计算其急性毒性数据平均值为7.34 mg ·L-1，而本研究通过计算得到的Cr(Ⅵ)对蛋白核小球藻和斜生栅藻的96 h-EC50分别为1.34 mg ·L-1和19.52 mg ·L-1，其中蛋白核小球藻的96 h-EC50小于7.34 mg ·L-1，表明其对Cr(Ⅵ)较为敏感. 雷炳莉等[18]探讨太湖流域TCP水质基准时，采用毒性百分数排序法和物种敏感度分布法推导其水质基准时，筛选了29个生物急性毒性数据，计算得到急性毒性平均值为3.68 mg ·L-1，与本研究中TCP对蛋白核小球藻和斜生栅藻的EC50值(分别为4.55 mg ·L-1和3.71 mg ·L-1)较为接近. 本研究中硝基苯对两种微藻的EC50分别为86.58 mg ·L-1和74.15 mg ·L-1，吴丰昌等[17]在使用急性物种敏感度分布法推导硝基苯水质基准时，14个物种急性毒性数据的平均值为47.09 mg ·L-1，使用毒性百分数排序法分析硝基苯对中国物种的急性毒性数据时，筛选的最敏感4个属包括栅藻属[19].

表 5 3种典型污染物质的水质基准或标准值 1)/μg ·L-1

Table 5 Aquatic criteria or standards of three typical pollutants/μg ·L-1

TCP和硝基苯对摇蚊幼虫的48 h-LC50分别为9.29 mg ·L-1和98.34 mg ·L-1，摇蚊幼虫对上述3种典型污染物不太敏感. 但是作为我国淡水水域广泛存在的生物物种，摇蚊幼虫的急性毒性数据也将在水质基准的推导过程中发挥重要作用.

3 讨论

作为一种常见的重金属污染物，铬对水生生物的毒性效应已有许多报道[20,21,22,23]. 有文献报道Cr(Ⅵ)对中国林蛙(Rana chensinensis)幼体、 孔雀鱼(Poecilia reticulata)和河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)的96 h-LC50分别为28.81、 43.40和111.24 mg ·L-1[24, 25, 26]. 耿宝荣等[27]及梁峰等[28]分别探讨了Cr(Ⅵ)对无尾两栖类蝌蚪和黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)的急性毒性影响. 铬对水生生物的毒性效应研究多涉及鱼类、 两栖类和甲壳类，国内针对藻类的研究相对较少[7, 14]. 本研究结果显示在Cr(Ⅵ)作用下，蛋白核小球藻的96 h-EC50为1.34 mg ·L-1，与文献报道的Cr(Ⅵ)对其96 h-EC50(4.96 mg ·L-1)基本一致[14]. 另外，本研究中斜生栅藻96 h-EC50为19.52 mg ·L-1，相比蛋白核小球藻对Cr(Ⅵ)的耐受性更强，研究结果与魏群等[7]的报道一致，其原因可能与小球藻的细胞个体更小且为球状有关. 摇蚊幼虫对各类污染物的耐受能力不同，如摇蚊属(Chironomus)的种类耐有机污染，而前突摇蚊属(Procladius)的种类耐重金属污染[29]. 本实验所用摇蚊幼虫对Cr(Ⅵ)耐受能力很强，即使当Cr(Ⅵ)浓度为1 500 mg ·L-1时，摇蚊幼虫48 h的死亡率仅为15%，实验所用材料可能为前突摇蚊属. 通过比较上述毒性数据，Cr(Ⅵ)对微藻的毒性效应要高于其他水生动物，表明重金属通过各种途径进入水体后，首当其冲的受害者是初级生产者藻类，相比细菌或水生动物而言，微藻对毒物更敏感，研究结果与文献[30, 31]的结果一致.

本研究中，TCP对蛋白核小球藻和斜生栅藻的96 h-EC50分别为4.55 mg ·L-1和3.71 mg ·L-1，对摇蚊幼虫的48 h-LC50为9.29 mg ·L-1. 张亚辉等[32]的研究结果显示pH为6.0、 7.8和9.0时TCP对大型溞(Daphnia magna)的48 h-LC50分别为0.75、 1.76和1.16 mg ·L-1; 杨永滨等[33]研究发现TCP对斑马鱼(Danio rerio)48 h-LC50为1.63 mg ·L-1; Yin等[34]测定了部分水生动物和浮游植物对TCP的毒性数据，其急性毒性(LC50)范围是1.46~9.29 mg ·L-1，与本研究结果基本一致. 但金小伟等[35]研究发现，TCP对河蚬(Corbicula fluminea)的96 h-LC50为41.98 mg ·L-1，相比鱼类和其他水生生物，TCP对河蚬的毒性较低，可能是因为河蚬具有坚硬的外壳保护，使其身体未完全暴露于污染物之中，从而降低了污染物对其的毒害作用.

2005年松花江水污染事件发生后，硝基苯成为环境工作者的研究热点. 周群芳等[36]研究发现硝基苯对日本青鳉(Oryzias latipes)和稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)的48 h-LC50分别为141.4 mg ·L-1和133.0 mg ·L-1，刘祎男等[37]报道了硝基苯对霍甫水丝蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)的48 h-LC50为96.77 μL ·L-1(116.61 mg ·L-1). 本研究中硝基苯对蛋白核小球藻(86.58 mg ·L-1)、 斜生栅藻(74.15 mg ·L-1)和摇蚊幼虫(98.34 mg ·L-1)的EC50(LC50)值，与其他研究中泥鳅(Misgurnus bipartitus)(96.04 mg ·L-1)、 中国林蛙(Rana chensinensis)蝌蚪(117.04 mg ·L-1)和中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)(104.23 mg ·L-1)的毒性响应值基本接近[38, 39]. 赵志刚等[39]、 李铁军等[40]对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的研究结果显示，硝基苯对其96 h-LC50分别为7.60 mg ·L-1和0.033 7 mg ·L-1，表明这两种水生生物对硝基苯更为敏感. 硝基苯对浮游植物的毒性效应在我国研究较少，王宏等[41]研究发现，硝基苯对斜生栅藻的96 h-EC50为16.50 mg ·L-1，本实验研究结果(74.15 mg ·L-1)与之相当，且均表现为中等毒性.

蛋白核小球藻和斜生栅藻是我国河流、 湖泊中的重要生物物种[12]，且对上述污染物质比较敏感，因此水质基准的推导过程中，藻类毒性数据的搜集、 筛选和应用，将会使我国水质基准值更加客观. 本研究中TCP和硝基苯对摇蚊幼虫的48 h-LC50分别为9.29 mg ·L-1和98.34 mg ·L-1，与雷炳莉等[18]在推导TCP水质基准过程中得到的摇蚊幼虫急性毒性几何平均值(2 060 μg ·L-1)较为接近; 吴丰昌等[19]在推导硝基苯水质基准时，采用的节肢动物门蚊科库蚊属数据为国外数据，这可能会对我国水质基准值产生影响. 因此，本研究数据对上述3种典型污染物基准的完善和修订有着重要意义.

4 结论

(1)低浓度的3种污染物能够促进微藻生长，浓度升高则抑制其生长，且浓度越高，生长抑制效应越强; Cr(Ⅵ)对摇蚊幼虫作用不显著，TCP和硝基苯对其有明显的剂量-效应关系.

(2)参考国家环境保护总局《新化学物质危害评估导则》(HJ/T 154-2004)中的分级标准，染毒96 h后，Cr(Ⅵ)、 TCP和硝基苯对蛋白核小球藻分别属高等毒性、 高等毒性和中等毒性，对斜生栅藻分别属中等毒性、 高等毒性和中等毒性; 染毒48 h后，3种污染物对摇蚊幼虫分别属低等毒性、 高等毒性和中等毒性.

(3)蛋白核小球藻对Cr(Ⅵ)较为敏感，TCP对2种微藻均较为敏感，硝基苯对上述3种水生生物敏感性较差.

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