2026, Vol. 47
2. 粤港澳污染物暴露与健康联合实验室，广州 510006;
3. 环境健康与污染控制研究院，广州 510006;
4. 环境催化与健康风险控制重点实验室，广州 510006
2. Guangdong-Hong Kong-Macao Joint Laboratory for Contaminants Exposure and Health, Guangzhou 510006, China;
3. Institute of Environmental Health and Pollution Control, Guangzhou 510006, China;
4. Guangdong Key Laboratory of Environmental Catalysis and Health Risk Control, Guangzhou 510006, China
近年来，随着医药行业的发展和人们对健康的重视，抗病毒药物的使用日益广泛. 特别是由冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的COVID-19大流行，使得抗病毒药物在环境中释放和残留的问题受到广泛关注[1，2]. 目前，已经在不同地区的水体、沉积物甚至是土壤中均检测到了抗病毒药物的显著残留. 例如，在瑞士、中国、日本、德国等不同的污水处理厂的污水中检测到了苯海拉明、可待因和阿昔洛韦等抗病毒药物[3，4]. 在南非，研究人员发现高浓度的利托那韦（1 600~3 200 ng·L-1）和洛匹那韦（130~3 800 ng·L-1）残留于二级污水中，并且在环境水域中持续存在[5]. 利托那韦与洛匹那韦是临床常见的抗病毒药物，作为HIV蛋白酶抑制剂，二者通过竞争性结合HIV-1蛋白酶活性位点，阻断病毒前体蛋白的切割与成熟，从而抑制病毒的组装与复制[6]. 同时，它们也是世界卫生组织推荐的治疗新冠病毒感染的药物[7]. 但是，由于人体对该类药物的代谢不完全，该类药物及其活性代谢物会通过医疗废水、生活污水等进入自然水体、土壤等环境介质中[8]. 环境中持久存在的抗病毒药物暴露可能对微生物群落、水生生物乃至人类健康产生潜在影响，亟需纳入环境风险评估体系[9].
微生物在长期进化过程中形成了复杂的环境适应机制. 例如，在环境压力下，微生物可进入一种特殊的低活性状态——活的不可培养（viable but nonculturable，VBNC）状态. 这一适应策略最早于1982年由Xu等[10]在霍乱弧菌中发现，随后被证实是多种病原微生物，如大肠杆菌（E. coli）[11]、沙门氏菌[12]和铜绿假单胞菌[13]等应对低温[14]、饥饿[15]、高渗透压[16]和抗菌剂[17]暴露等不利环境压力的普遍性适应策略. 处于VBNC状态的微生物无法在常规培养基上形成可见菌落，使得传统培养法难以检测，因此可能导致在食品污染、水源安全及临床感染上的漏诊[18]. 此外，处于VBNC状态的微生物仍保持较低的代谢活性、致病潜能以及基因传递的能力[11]. 因此，VBNC状态的微生物对公共卫生和环境安全构成了巨大的潜在威胁. 然而，抗病毒药物是否会诱导微生物进入VBNC状态，目前尚未见详细报道.
E. coli是一种广泛存在于人和动物肠道中的重要细菌，在水体、食品等环境中也常被用作指示菌来评估卫生状况[19]. 作为典型模式菌与条件致病菌，其VBNC状态的研究对评估环境风险具有重要参考价值. 因此，本研究聚焦利托那韦与洛匹那韦对E. coli进入VBNC状态的诱导能力（浓度-效应关系），分析抗病毒药物诱导过程中E. coli的生长能力、细胞形态和胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的变化，探究其中的分子机制. 本文通过揭示抗病毒药物残留与微生物存活策略的关联，旨在为评估抗病毒药物的环境风险和更好地保障环境安全与公共卫生提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 菌株及抗病毒药物模型菌E. coli DH5α购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心. 挑取单菌落于50 mL营养肉汤培养基，在37℃恒温摇床（NRY-2 102，上海）中过夜培养至对数生长期. 菌液于转速8 000 r·min-1离心2 min，弃上清. 使用0.9%无菌生理盐水进行清洗和重悬，使细菌终浓度为108 CFU·mL-1.
利托那韦（98%，AR）购买自上海麦克林生化科技有限公司，洛匹那韦（99%，AR）购买自大连美仑生物技术有限公司. 分别将利托那韦和洛匹那韦溶于无水乙醇（AR，天津大茂），制成浓度为5 120 mg·L-1和12 800 mg·L-1的储备液，避光置于-20℃保存.
1.2 VBNC状态细菌的诱导将制备的初始浓度为108 CFU·mL-1的E. coli DH5α悬浮液分别与药物（0、16、32、64、128、256和640 mg·L-1）以1∶9的体积比混合于10 mL无菌棕色样品瓶中，在25~30℃下充分搅拌. 随后，分别在混合的第0、2、4、8、24 h取500 μL样品，离心后去除上清液. 使用0.9%无菌生理盐水洗涤3次并重悬. 取100 μL悬浮液进行10倍梯度稀释，均匀涂布于营养琼脂培养基并置于37℃恒温培养箱中培养，用于观察细菌可培养数量的变化情况. 每个浓度至少设置3个平行实验. 培养24 h后，对菌落进行计数. 同时设置空白组（只含有乙醇溶剂）和溶剂对照组（不含乙醇）作为阴性对照.
使用流式细胞术观察药物暴露前后细菌的活/死比例，与平板培养计数法联合，以确定VBNC细菌的比例：取100 μL细菌重悬液，分别加入10 μL SYTO 9和2 μL PI染色工作液（Thermo Fisher，美国），涡旋混合后，避光孵育10 min. 使用流式细胞仪FACS Aria Ⅲ（BD，美国）进行观测. VBNC细菌数量等于活细菌总数减去可培养细菌数量.
1.3 生长曲线测定使用全自动微生物生长监测仪（Logphase 600，BioTek，USA）记录药物处理前后E. coli DH5α的生长曲线. 取样后用无菌生理盐水洗涤以去除药品残留，随后使用营养肉汤培养基将菌液稀释至108 CFU·mL-1. 在96孔板依次加入20 μL洛匹那韦和利托那韦不同浓度的工作液，每个浓度设置3个重复. 分别往含有药物工作液的检测孔中加入180 μL菌液悬浮液并混匀. 随后，将混合物在37℃下培养48 h. 培养过程中，仪器转速为500 r·min-1，每20 min自动记录一次数据.
1.4 表型观测使用场发射扫描电子显微镜（ZEISS Ultra 55，Carl ZEISS，德国）观察诱导前后E. coli DH5α细胞的形态变化. 将3 μL菌液均匀涂抹在单面抛光硅片上，用1×PBS溶液洗涤3次. 随后，用2.5%的戊二醛溶液覆盖细胞，置于4℃避光冷藏12 h以固定细胞形态. 紧接着依次使用30%、50%、70%、90%和100%的乙醇溶液对细菌细胞脱水15 min. 然后，将覆盖有细菌的硅片放入真空泵中冷冻干燥4 h. 最后，对样品进行喷金处理后进行SEM电镜观察.
1.5 ROS水平测定使用DCFH-DA荧光探针（Beyotime，China）检测诱导前后E. coli DH5α的胞内ROS水平. 实验根据说明书进行. 取1 mL用1×PBS溶液洗涤3次并重悬至108 CFU·mL-1的菌液，加入1 µL 1 mmol·L-1 DCFH-DA溶液，涡旋混匀后置于37℃孵育30 min，每5 min颠倒混匀一次. 混合液于8 000 r·min-1离心2 min，弃上清. 洗涤3次后立即用多功能酶标仪（Thermo Scientific Varioskan Flash，Thermo Fisher，USA）测定荧光强度，激发光波长488 nm，发射光波长525 nm. 测试过程在避光条件下进行.
1.6 基因表达水平测定取1 mL细菌样品用1×PBS洗涤3次后重悬至109 CFU·mL-1. 随后使用柱式细菌RNA抽提纯化试剂盒（Sangon Biotech，China）提取细菌RNA，并进行浓度及纯度的测定. 使用逆转录试剂盒（莫纳生物）将RNA逆转录为cDNA，并测定cDNA的浓度及纯度. 16S rRNA作为内参基因，使用MonAMP TM ChemoHS qPCR Mix试剂盒（莫纳生物）对不同抗病毒药物刺激下细菌基因的表达进行qPCR测定. 其中荧光定量PCR仪的热循环参数设置为：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s. 最后，使用双ΔCT法计算目标基因的相对表达量.
1.7 数据分析本研究相关实验均已进行3次重复，实验数据使用Origin软件进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示，变异系数（CV=标准差/均值） < 15%的数据被认为是有效的. 采用IBM SPSS Statistics 27.0进行统计学分析，以P < 0.05表示具有显著性差异.
2 结果与讨论 2.1 典型抗病毒药物作用下大肠杆菌可培养能力的变化为了系统评估抗病毒药物对细菌可培养能力的胁迫效应，本研究将E. coli DH5α置于梯度浓度的利托那韦与洛匹那韦暴露体系中，采用标准平板培养计数法测定暴露24 h后的可培养细菌数. 如图 1（a）所示，较低浓度的利托那韦暴露即可对E. coli DH5α的可培养能力造成影响. 其中，暴露24 h时，低浓度利托那韦（16 mg·L-1）已表现出微弱抑制效应，但可培养活菌数较空白组（0 mg·L-1）仅轻微下降. 当浓度升至64 mg·L-1时，抑制效应明显增强，可培养活菌数量与空白组相比下降约2.5个数量级；128 mg·L-1时抑制达到峰值，可培养活菌数锐减约3个数量级，降幅达99.2%，与空白组差异极显著. 说明利托那韦与细菌的结合能力较好，低浓度的利托那韦即可在细胞内发生作用. 过往的一项研究表明利托那韦分子疏水性较强，可以很好地穿透细菌细胞膜[20]，进一步证明了这个观点. 利托那韦是一种蛋白酶抑制剂[21]，这使得E. coli中的Clp蛋白可能成为了利托那韦药物的潜在靶点. 利托那韦进入细胞后，与细胞质中的Clp蛋白酶结合，抑制了其对错误折叠蛋白的降解功能[22]. 这进一步抑制了E. coli的正常生长，从而影响了它的可培养性. 此外，当药物浓度超过靶点的最大结合能力时，多余的药物可能无法进一步抑制靶点，且高浓度药物可能引发非特异性毒性，导致部分细菌直接死亡. 因此，当利托那韦的浓度进一步升高至256 mg·L-1和640 mg·L-1时，抑制效应反而减弱，可培养活菌数仅较空白组分别减少2.5和1个数量级[图 1（a）]. 表明利托那韦对E. coli DH5α的可培养能力的抑制作用随药物浓度的升高，呈现先增强后减弱的特点，并在128 mg·L-1时达到最大.
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图 1 不同浓度典型抗病毒药物暴露下大肠杆菌的可培养细菌数量 Fig. 1 Culturable number of Escherichia coli exposed to typical antiviral agents at different concentrations |
洛匹那韦的作用靶点与利托那韦相似. 但洛匹那韦对E. coli DH5α可培养能力的抑制呈现出浓度依赖性. 如图 1（b）所示，当洛匹那韦浓度升至256 mg·L-1时，暴露24 h后E. coli DH5α可培养细菌数量较空白组骤降97.2%. 而洛匹那韦浓度在16~128 mg·L-1浓度范围时，E. coli DH5α的可培养细菌数与空白组没有明显差异. 说明与利托那韦相比，洛匹那韦更难进入细菌细胞，需要较高浓度的暴露才能对E. coli的可培养能力产生抑制. 过去的一项研究曾提到：洛匹那韦分子体积较大，亲脂性略低，穿透细菌外膜的效率较低[23]. 这进一步佐证了这个观点. 以上现象表明，典型抗病毒药物利托那韦与洛匹那韦的暴露可通过不同强度的抑制效应，影响细菌的可培养能力. 同时，与洛匹那韦相比，E. coli DH5α对利托那韦的敏感性更高.
2.2 典型抗病毒药物作用下大肠杆菌VBNC的生成 2.2.1 细菌生长能力变化对不同浓度利托那韦和洛匹那韦分别暴露24 h后的E. coli DH5α进行了生长曲线的测定，旨在探究典型抗病毒药物胁迫条件下细菌的生长能力变化. 如图 2所示，空白对照组E. coli DH5α生长正常，约6 h后进入生长稳定期，此时细菌数量约为109 CFU·mL-1. 相较之下，利托那韦暴露组的E. coli DH5α的增殖活动受到显著抑制[图 2（a）]，未观测到明显的对数生长期. 类似地，不同浓度洛匹那韦暴露组的E. coli DH5α亦表现出增殖停滞现象[图 2（b）]. 值得关注的是，鉴于128 mg·L-1利托那韦与256 mg·L-1洛匹那韦暴露24 h的E. coli DH5α的可培养性受损程度最为显著，因此，进一步采用流式细胞术对这两个处理组样品进行细菌的活/死比例分析. 如图 3所示，两种药物暴露条件下仍存在较高比例的活菌. 其中，128 mg·L-1利托那韦暴露组中活性细菌比例为73%，256 mg·L-1洛匹那韦暴露组中活性细菌比例为79%. VBNC状态细菌的典型特征在于其保持代谢活性但无法在常规培养基中恢复增殖能力[18]. 因此，结合上述生长曲线与流式检测结果可推断，经利托那韦与洛匹那韦分别暴露24 h后的E. coli DH5α已进入VBNC状态. COVID-19大流行导致环境中残留了大量的抗病毒药物[24]. 因此，关注环境中的致病菌被残留的抗病毒药物诱导进入VBNC状态是有必要的.
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图 2 典型抗病毒药物暴露24 h后大肠杆菌的生长曲线 Fig. 2 Growth curve of Escherichia coli after 24 h exposure of typical antiviral agents |
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图 3 典型抗病毒药物暴露24 h后大肠杆菌的活/死比例 Fig. 3 Live/dead percentage of Escherichia coli after 24 h exposure of typical antiviral agents |
为探究典型抗病毒药物胁迫下E. coli的形态学响应特征，对利托那韦和洛匹那韦分别暴露24 h后的E. coli DH5α进行了SEM测定. 如图 4所示，相较于未暴露组大肠杆菌的典型长杆状结构，暴露后的细胞逐渐缩短，细胞体积减小，部分细胞表面凹陷，最终表现为短杆状或圆球状. 这是因为细胞壁的合成和维持需要消耗能量和物质[25]. 当细菌进入VBNC状态时，细菌的代谢活动减缓，细胞壁的合成可能受到抑制，这会导致细胞形状出现不规则变化，体积缩小. 从而可以减少细胞的营养需求，避免细胞在不利环境中过度消耗能量，同时可以减少细胞内外物质的交换，维持细胞内环境的稳定[26]. 这种形态学变化表明，抗病毒药物胁迫可以通过诱导大肠杆菌进入VBNC状态，使其发生形态上适应性重构.
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图 4 典型抗病毒药物暴露24 h前后大肠杆菌的SEM图像 Fig. 4 SEM morphology of Escherichia coli after 24 h exposure of typical antiviral agents |
通过联合平板培养计数法与流式细胞术，系统分析了不同浓度典型抗病毒药物暴露24 h条件下，VBNC状态大肠杆菌的生成规律. 如图 5（a）所示，当利托那韦质量浓度为0 mg·L-1（空白对照组）时，VBNC状态细菌占比为0%，随着质量浓度升高至128 mg·L-1，VBNC占比显著提升至73%. 当质量浓度继续升高至640 mg·L-1时，VBNC状态细菌的占比虽略有下降（57%），但仍维持较高水平. 与此同时，如图 5（b）所示，洛匹那韦暴露组的VBNC状态细菌的占比呈现随药物浓度增加而持续递增的特点. 当暴露于32 mg·L-1洛匹那韦时，产生了15%的VBNC细胞；洛匹那韦质量浓度从32 mg·L-1增加到128 mg·L-1过程中，VBNC的占比也随之轻微增加. 当质量浓度为128 mg·L-1时，VBNC占比仅为18%，随着质量浓度升至256 mg·L-1，占比显著提升至77%. 这与利托那韦与洛匹那韦对大肠杆菌的可培养能力造成损伤的结果相互印证. 该结果进一步说明，相较于洛匹那韦，环境中利托那韦的残留对大肠杆菌VBNC状态的诱导效应会更为显著.
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***表示P < 0.001 图 5 不同浓度典型抗病毒药物暴露24 h后大肠杆菌的VBNC状态细菌的占比 Fig. 5 Proportion of Escherichia coli VBNC after 24 h exposure of typical antiviral agents in different concentrations |
由于VBNC状态的细菌在环境条件改善后可以恢复致病性[27]. 因此，环境中利托那韦的残留可能具有更高的潜在环境风险. 这是因为尽管目前大多研究观测到的环境中药物残留的质量浓度通常在痕量水平（ng·mL-1）[5]，但有研究表明水蚤暴露于0.001 µg·mL-1利托那韦溶液时即可观察到DNA损伤[24]. 这表明抗病毒药物即使在ng·mL-1的质量浓度下也可能对细菌产生影响. 此外，有研究指出新冠疫情期间城市污水中抗病毒药物浓度增加了70%以上，阿奇霉素残留浓度更是达到了往年的217倍[28]. 这表明污水处理厂目前的处理工艺并未能有效去除抗病毒药物，尤其是在一些重大公共卫生事件之后. 这会导致较高浓度药物残留通过出水口进入环境水体. 同时，环境中残留的药物可能会受到其他环境因素（如光照等）的影响，导致药物作用效应增强[29]. 并且，在水生环境中，同时存在多种复杂的药物及其代谢物混合物，它们的协同作用可能会导致混合药物的毒性高于单一药物[30]. 这些都可能导致环境中残留的抗病毒药物实现对VBNC状态细菌的诱导. 但是，未来研究仍需要在更接近真实环境的条件下开展，以验证和补充目前的研究成果，从而更准确地评估药物在实际环境中的影响和意义.
2.3 典型抗病毒药物作用下细菌进入VBNC状态的形成机制 2.3.1 细菌胞内ROS的积累为了明晰抗病毒药物作用下细菌进入VBNC状态的机制，本研究还对不同浓度利托那韦和洛匹那韦暴露下E. coli DH5α胞内ROS的含量进行了测定. 如图 6（a）所示，利托那韦暴露24 h后，64 mg·L-1处理组中E. coli DH5α的胞内ROS水平较对照组显著升高（约3倍）. 表明利托那韦的暴露促进了胞内ROS的产生. 128 mg·L-1处理组中胞内ROS水平降为了对照组的1/3[图 6（a）]. 这是因为随着外界刺激的增强，细菌的抗氧化防御系统会被逐步激活，加速胞内ROS的清除，降低胞内ROS水平[31]. 此外，当利托那韦质量浓度增加到640 mg·L-1时，胞内ROS水平显著上升，比对照组高了3倍[图 6（a）]. 这则是因为当产生的ROS超过了抗氧化防御系统的处理能力时，抗氧化防御系统失去作用，导致胞内ROS大量累积[32]. 值得注意的是，洛匹那韦暴露下胞内ROS水平的变化趋势与利托那韦组之间存在显著差异. 如图 6（b）所示，洛匹那韦暴露24 h时，胞内ROS水平则呈现浓度正相关特征. 其中，32 mg·L-1与64 mg·L-1洛匹那韦暴露组的细菌胞内ROS含量相近，约为对照组的1.5倍；但128 mg·L-1和256 mg·L-1洛匹那韦处理组的ROS水平分别较对照组显著升高约4倍与5倍. 这可能是因为利托那韦和洛匹那韦都是蛋白酶抑制剂，但相较于利托那韦，洛匹那韦与细菌蛋白酶靶点的亲和力更低[23]. 因此，随着质量浓度由0 mg·L-1增加至256 mg·L-1，洛匹那韦与细菌蛋白酶的结合量可能持续上升. 同时，与洛匹那韦相比，利托那韦分子结构中含有更多的疏水性基团，如长链烷基或芳香环，这使得利托那韦的疏水性更强（lgKow=6.27），而洛匹那韦的疏水性稍弱（lgKow=5.94）[5]. 疏水性较弱的化合物通常具有较低的脂溶性，会缓慢积累在生物体内，进而产生胁迫作用[33]. 这也导致了洛匹那韦对细菌抗氧化酶的抑制作用在此过程中逐渐增强. 因此细菌胞内ROS清除能力持续下降，最终表现为ROS的累积效应. 综上，两种抗病毒药物暴露下大肠杆菌胞内ROS水平的差异化变化，本质上是药物质量浓度、靶点作用模式及细菌抗氧化系统之间共同作用的结果. 同时，胞内ROS的积累会触发细菌的适应性策略，促进细菌进入休眠的VBNC状态[34]. 因为ROS积累可以通过影响提高胞内鸟苷四/五磷酸[（p）ppGpp]等第二信使的水平间接诱导VBNC状态的细菌的生成[35].（p）ppGpp的积累会消耗细胞内用于核糖体生物发生、组装和蛋白质翻译的GTP酶，促使细胞进入休眠状态[36]. 因此，利托那韦和洛匹那韦暴露下胞内ROS的积累可能是诱导E. coli DH5α进入VBNC状态的原因.
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***表示P < 0.001；相对荧光强度（relative fluorescence units，RFU）用来反映胞内ROS的含量 图 6 不同浓度典型抗病毒药物暴露24 h后大肠杆菌胞内ROS的相对荧光强度 Fig. 6 Intracellular ROS of Escherichia coli after 24 h exposure of typical antiviral agents in different concentrations |
此外，有研究表明高疏水性物质在水中的溶解度低，在水体中的迁移和扩散速度较慢，导致它们可能会在固定环境中富集和持久性残留[1]. 而抗病毒药物较长的半衰期给它们创造了产生毒性比母体更强的有毒中间体的时间窗口[37，38]. 这可能会进一步给处于同一环境的细菌带来生存压力，进而诱导VBNC的生成. 因此，环境中残留的高疏水性及半衰期长的抗病毒药物是抗病毒药物在环境中残留的检测过程中需要重点关注的对象.
2.3.2 细菌胞内基因的差异表达进一步，通过对利托那韦和洛匹那韦暴露24 h前后的E. coli DH5α的基因表达进行比较，探究细菌在典型抗病毒药物暴露下的存活策略和VBNC状态细菌形成的机制. 涉及到的基因参与了包括细胞氧化应激响应（katG、rpoS、oxyR）、严谨反应（spoT、relA）、细胞周期调控（obg）、蛋白质稳态维持（lon、clpB）、细胞膜合成与修复（ompA、basS）和毒素表达（hipA）等过程.
结果如图 7所示，不同浓度的利托那韦暴露时，E. coli中与抗氧化系统相关的基因katG表达下调. 这会导致胞内ROS累积[39]. spoT和relA基因表达上调，进一步说明利托那韦暴露可能会导致（p）ppGpp积累. spoT和relA可以调控（p）ppGpp代谢，参与处理环境胁迫信号感知和激活细胞的应激反应[40]. ppGpp是细菌严谨反应的核心信号分子，它们的产生可以激活细菌的严谨反应过程并抑制DNA复制和蛋白质合成，促使细菌进入VBNC状态[41]. 此外，rpoS和obg基因表达上调，且在128 mg·L-1时表达水平最高. 这可能驱动了细菌进入VBNC状态. 因为rpoS编码σ因子，obg基因编码GTP结合蛋白，它们参与了细胞应激响应、核糖体合成、DNA复制和细胞周期的停滞等过程[35，42]. 另外，利托那韦暴露后，lon和clpB基因表达上调. 它们编码的Lon和ClpB是蛋白酶，均已被证明参与了错误折叠蛋白的降解[43]. 因此，上调lon和clpB基因的表达，有助于清除损伤蛋白，维持细胞内环境稳定，促进VBNC的存活. 128 mg·L-1利托那韦暴露时这些基因协同作用达到峰值，VBNC诱导效率最高. 特别是，利托那韦质量浓度升高至256 mg·L-1时，spoT、relA、obg、rpoS、lon和clpB等基因的表达都下调. 表明高浓度药物可能导致蛋白酶系统过载，同时抑制了细菌的严谨反应，从而影响VBNC状态的生成和维持. 这与256 mg·L-1利托那韦暴露时VBNC细菌的占比下降结果一致.
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（a）利托那韦，（b）洛匹那韦；棕色和绿色分别表示基因下调和上调的表达 图 7 不同浓度典型抗病毒药物暴露24 h大肠杆菌基因的表达情况 Fig. 7 Gene expression of Escherichia coli after 24 h exposure of typical antiviral agents in different concentrations |
此外，洛匹那韦暴露时，大肠杆菌通过下调表达oxyR和katG基因，阻断抗氧化系统的激活，导致ROS积累. 随后，spoT和relA基因的表达上调，促使ppGpp合成增加，抑制细菌的代谢活性，驱动细胞进入VBNC状态. 接着，编码编码GTP结合蛋白的obg基因表达上调. 这可能会抑制细胞分裂[44]. 同时，lon和clpB基因表达上调，可以帮助清除损伤蛋白，保证VBNC细菌的存活. 这反映了洛匹那韦通过多通路协同调控，从而诱导细菌进入休眠状态以应对药物胁迫的适应性策略. ompA和basS是细胞膜合成与修复相关的基因[32，45]，它们的表达随着抗病毒药物浓度的增加而下调，反映了在抗病毒药物暴露的过程中，细菌细胞膜的合成与修复受到抑制. 这可能是导致诱导生成的VBNC细胞外膜凹陷且体积缩小的原因. 另外，值得注意的是，在利托那韦和洛匹那韦诱导生成的VBNC状态细菌中均观察到毒素产生相关的基因hipA表达下调. 说明进入VBNC状态后，细菌毒素表达能力降低. 这与在VBNC状态的哈维氏弧菌和军团菌中观察到的现象相似[34，46]. 有研究指出，VBNC状态细菌复苏后，可以恢复毒力[47]. 因此，监测抗病毒药物残留诱导VBNC状态细菌的生成对维护公众健康具有重要意义.
综上，利托那韦和洛匹那韦都是通过抑制细菌的氧化应激，激活细菌的严谨反应，减缓或暂停细胞分裂，最后维持细菌胞内蛋白质稳态的方式诱导生成并维持VBNC状态. 并且，尽管基因表达略有差异，但这些过程都是通过多种基因的协同作用实现的.
3 结论（1）利托那韦和洛匹那韦对大肠杆菌的可培养能力的抑制存在差异，较低质量浓度的利托那韦暴露即可明显抑制细菌的可培养能力，而洛匹那韦则需较高质量浓度的暴露才可以较好地抑制细菌的可培养能力.
（2）利托那韦和洛匹那韦均可诱导细菌进入VBNC状态，其中暴露组VBNC状态细菌的生成随利托那韦暴露浓度的增加而呈现先升后降的趋势，而与洛匹那韦存在浓度依赖性效应关系.
（3）典型抗病毒药物（利托那韦和洛匹那韦）诱导生成的VBNC状态细菌生长停滞，但流式细胞术检测仍显示较高活性占比；同时，SEM观察到VBNC状态细菌细胞缩短、体积减小.
（4）机制研究表明，利托那韦与洛匹那韦通过差异化的多通路调控机制诱导细菌进入VBNC状态，其中，胞内ROS积累与抗氧化防御系统的动态调控是关键. 而利托那韦因更强的靶点结合能力和VBNC诱导效率，使其比洛匹那韦拥有更高的潜在环境风险.
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