2025, Vol. 46
2. 陕西省灾害监测与机理模拟重点实验室，宝鸡 721013
2. Shaanxi Key Laboratory of Disasters Monitoring and Mechanism Simulation, Baoji 721013, China
在全球工业化进程迅猛推进的浪潮下，经济与社会实现了高速发展，然而，一系列生态环境问题也随之而来，土壤环境问题便是其中不容忽视的一环，尤其是土壤重金属污染问题日益突出[1，2]. 目前，我国受重金属污染的土壤面积占耕地总面积的1/5[3]，由此引发的耕地面积缩减以及粮食安全隐患，已成为亟待解决的重大问题[4]. 土壤重金属污染具有隐蔽性、危害巨大、修复难度高的特点. 传统的物理、化学等修复方法，虽能在一定程度上降低重金属在土壤中的活性与迁移性，阻断其在食物链中的迁移和富集，实现阶段性的修复目标，但重金属依然残留在土壤环境中. 随着时间的推移，土壤生态环境的变化、风化作用、雨水侵蚀以及土壤微生物的活动等因素，都可能使重金属在若干年后再次被激活并释放，潜在风险与危害始终存在.
近年来，国际上兴起的植物修复技术，作为一种绿色、环保的原位修复手段[5，6]，备受关注. 该技术在不破坏土壤原有结构和理化性质的前提下，通过种植高富集或超富集植物，将土壤的重金属转移富集到植物的地上部分，定期收割植物地上部分，从而实现将重金属从土壤中彻底“拿出来”的目的，为解决重金属污染问题提供了一种经济可行的绿色方案.
在植物修复技术中，重金属超富集或高富集植物的筛选是关键所在[7，8]. 截至目前，国际上已成功筛选出500多种重金属超富集植物，如羽叶鬼针草、紫花苜蓿、香根草、宝山堇菜、龙葵、蓖麻、向日葵、东南景天、印度芥菜、天竺葵、黑麦草等[9~18]. 然而，以上超富集植物大多存在适应性欠佳、生物量较小、对重金属选择性过强等缺陷，极大地限制了其推广应用. 适宜超富集植物种植资源的匮乏，成为制约植物修复技术推广和应用的主要瓶颈，使得重金属超富集植物的筛选工作显得尤为紧迫和重要.
目前，重金属超富集或高富集植物的筛选方法主要包括野外污染区域优势植物分析筛选法和室内盆栽富集能力观测法. 其中，室内水培盆栽观测实验凭借周期短、易调控、受外部因素干扰小等显著优势，成为重金属高富集或超富集植物筛选过程中不可或缺的研究方法和关键环节，也是深入探究植物对重金属耐受性以及生物与生理响应特征的有效手段.
聚合草作为一种多年生草本植物，具有根系发达、再生能力强、环境适应性广泛等特点. 前期野外筛选研究已证实，聚合草对Pb、Zn和Cd复合重金属具有较强的富集能力，是一种优势植物[19]. 然而，目前关于该植物对重金属的耐受性、生物与生理响应特征等方面的研究仍较为匮乏. 本文以聚合草为研究对象，采用水培法，设置不同梯度的Pb、Zn和Cd单一胁迫及复合胁迫处理，系统研究聚合草的生长状态、生理响应以及对Pb、Zn和Cd的耐性、吸收、转移和富集能力，旨在揭示聚合草对Pb、Zn和Cd的耐受性机制、富集性能及富集机制，为聚合草在Pb、Zn和Cd污染土壤修复中的应用提供理论依据和基础参考.
1 材料与方法 1.1 试验材料聚合草是一种依靠根系繁殖的草本植物. 本次试验所采用的根系，源自于在本地野外采集后，于农田中进行培植繁殖并备用的根系. 水培过程中所添加的营养液，是购置的霍格兰营养液. 供试重金属溶液由Pb（Ac）2·3H2O、Zn（Ac）2·2H2O、Cd（Ac）2·2H2O固体化学纯试剂配制而成. 本试验中重金属浓度梯度的设计，综合参考了GB 15618-2018《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》[20]中三级标准，以及野外矿区的实际污染状况. 具体的梯度设置，详见表 1.
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表 1 试验梯度设置/mg·L-1 Table 1 Test gradient setting/mg·L-1 |
1.2 试验设计
本研究于2022年9月，在宝鸡文理学院实验室开展了室内水培盆栽试验. 考虑到聚合草切根繁殖的特性，挑选粗细均匀且直径不小于0.5 cm的根，将其切成约3 cm长的根段. 首先运用土培法进行促芽育苗，待聚合草根段发芽出苗，长出2~3片叶片，植株高度达到15~20 cm左右时，便可进行移植. 为便于后续的观测操作，选用了带定植篮的透明塑料花盆. 此款花盆口径为100 mm，胸径135 mm，高度175 mm，内部定植篮高度68.5 mm，内口径78 mm，花盆与定植篮的总重量约87 g. 挑选大小一致的聚合草幼苗，用蒸馏水反复冲洗后，放置于花瓶的定植篮内，每个定植篮中均匀放入3株幼苗. 先用霍格兰营养液培育一周，让幼苗充分适应环境. 适应期结束后，每隔5d添加20 mL重金属溶液. 在整个培育期间，针对因植株吸收和自然蒸发而减少的培养液，及时用营养液进行补充. 经过75 d的水培生长后，对相关指标进行测定.
1.3 样品采集与处理在实验检测环节，为防止酶活性丧失，酶的测定必须采集新鲜的植物叶片，即从试验各梯度中的植物活体上随机采集新鲜叶片，采集过程中要注意避开新生叶和老化叶；采集完成后，应迅速对叶片进行称重，然后立即将其放入冰盒内预先冷冻的研钵中剪碎，同时快速加入液氮并立即进行研磨，待研碎后，加入提取液继续迅速研磨，直至成为匀浆状态；最后，将研磨好的匀浆转移至容量瓶中进行定容，待测定. 称量鲜重时，需将最终收获的植株地上部分与根系小心剪切分离，用蒸馏水仔细洗净，滤干表面多余水分后，迅速称取鲜重. 完成鲜重称量的样品，放置于烘箱中，先在105℃的高温下杀青1 h，随后调至80℃下烘干至恒重，用作植物干重的测定. 将称完干重的样品，用研钵研碎，过0.425 mm筛，装入试样袋，逐一编号妥善保存，用作重金属含量等指标的测定.
1.4 测定项目及方法根系长度用交叉法（或叫直接截获法）测定[9]. 在测量植物叶片长度、宽度及茎长时，随机选取成熟完整的叶片，运用游标卡尺精确测量. 而测量根系长度，只需轻轻提起水培定植篮，使植物根系自然下垂，随后测量其长度. 叶绿素用80%丙酮法测定[21]. 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑法；过氧化氢酶（CAT）活性通过紫外吸收法测定；过氧化物酶（POD）活性利用愈创木酚法测定；丙二醛（MDA）含量使用硫代巴比妥酸法测定；脯氨酸（Pro）含量则采用茚三酮比色法测定[21].
叶绿素含量计算方法如下：
| $ \begin{gathered} C_{\mathrm{a}}=13.95 \times A_{665}-6.88 \times A_{649} \\ C_{\mathrm{b}}=24.96 \times A_{649}-7.32 \times A_{665} \\ C_{\mathrm{x} \cdot \mathrm{c}}=\left(1000 \times A_{470}-2.05 \times C_{\mathrm{a}}-114.8 \times C_{\mathrm{b}}\right) / 245 \\ C_{\mathrm{t}}=C_{\mathrm{a}}+C_{\mathrm{b}}=6.63 \times A_{665}+18.08 \times A_{649} \end{gathered} $ |
式中，Ca为叶绿素a浓度；Cb为叶绿素b浓度；Cx·c为类胡萝卜素浓度；Ct为叶绿素总浓度.
各色素含量（以鲜重计，mg·g-1）计算公式如下：
| $ \text { 叶绿体色素含量 }=\left(C \times V_{\mathrm{T}}\right) /(\mathrm{FW} \times 1000) \times n $ |
式中，C为色素浓度（mg·L-1）；FW为鲜重（g）；VT为提取液总体积（mL）；n为稀释倍数.
植物样品中重金属含量利用岛津AA6800型原子吸收分光光度法测定，并计算富集量、转运系数和富集系数.
根系耐性指数（root tolerance index，RTI）=各胁迫浓度下根系长度/对照组根系长度
耐性指数（tolerance index，TI）=处理组植物地上部干重/对照组植物地上部干重[22]
植物对重金属（Pb、Zn和Cd）的富集量=植物中Pb、Zn和Cd的含量×生物量
转移系数（translocation factor，TF）=植物地上部重金属含量/植物根系中同种重金属含量[23]
1.5 数据处理测定结果用Excel 2010软件对数据进行处理，用Origin 2021软件对数据进行绘图，用SPSS 25.0软件对数据进行单因素方差分析.
2 结果与分析 2.1 重金属胁迫对聚合草生长特征的影响 2.1.1 重金属胁迫对聚合草生物量的影响由表 2可知，聚合草根系生物量与CK相比，Pb、Zn和Cd单独胁迫和复合胁迫，其根系生物量与浓度均呈反比；Pb、Zn和Cd单独胁迫时，其最大胁迫浓度下生物量（以干重计）与CK相比较，分别下降了218.63%、207.08%和139.47%；复合胁迫时，与CK相比，生物量差异显著（P < 0.05），且下降了63.24%~77.02%；这说明了单独和复合胁迫，均会抑制根系的发育和生长，浓度越大，抑制越强，因为植物根系最先与重金属接触，重金属首先积累存储于根系中，是植物的第一道防御工具和保护屏障. 对地上部分，不同重金属、不同胁迫方式及不同胁迫浓度，对生物量的影响不同：Pb胁迫下，与CK相比，对聚合草的叶片和茎秆生物量呈现出“低促高抑”的特征，即低胁迫浓度Pb对聚合草的叶片和茎秆的生长均具有促进作用，但随着胁迫浓度增加，转移至植物叶片和茎秆中的Pb量也在不断地增加，对植物叶片和茎秆逐渐呈现越来越明显的抑制作用，导致生物量下降；随着Zn胁迫浓度的增加，聚合草叶片和茎秆的生物量呈下降趋势，生物量分别降低了33.81%~75.14%和35.07%~54.76%，这主要是由于随着Zn胁迫浓度增加，转移富集至叶片和茎秆中的Zn也会增加，毒性逐渐增强，对聚合草叶片和茎秆的生长抑制增强，说明了聚合草对Zn的抗胁迫能力弱；Cd对聚合草地上部分的胁迫与Pb相似，对聚合草的叶片和茎秆生物量同样呈现出“低促高抑”的特征，说明低浓度Cd对聚合草生长具有促进作用，但随着Cd胁迫浓度的增加，转移至植物叶片和茎秆中的Cd量增加，毒性增强，逐渐抑制了其生长，导致生物量下降，由此可知，聚合草对Cd有一定的抗逆能力；对于Pb+Zn+Cd复合胁迫，聚合草叶片生物量呈现“低促高抑”，而对茎秆生物量呈现逐渐降低趋势，同时复合胁迫要比单一胁迫强对聚合草叶片和茎秆生物量抑制要强，说明了复合胁迫Pb、Zn和Cd对聚合草的胁迫具有协同作用，毒性要比单一强，大大降低了聚合草的生物量.
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表 2 重金属胁迫对聚合草生物量的影响1）/g Table 2 Effect of heavy metals on biomass of Symphytum officinale L./g |
2.1.2 重金属胁迫对聚合草表观特征的影响
由表 3可知，在Pb、Zn和Cd单一胁迫以及Pb+Zn+Cd复合胁迫下，聚合草的叶长、叶宽和茎秆长均呈现出随着胁迫浓度的增加，逐渐降低趋势. 与CK相比，Pb胁迫下，聚合草的叶长、叶宽和茎秆长分别显著降低了30.58~47.93%、31.75%~46.03%和42.91%~40.31%（P < 0.05）；Zn胁迫下分别降低了17.36%~31.41%、17.46%~36.51%和25.61%~60.21%；Cd胁迫下分别降低了2.84%~35.54%、14.29%~42.86%和26.47%~51.56%；Pb+Zn+Cd复合胁迫下，分别显著降低了35.37%~56.20%、4.44%~425.40%和31.66%~62.80%（P < 0.05）. 此外，复合胁迫对聚合草叶长、叶宽和茎秆长的抑制作用要比单一胁迫更强，这主要是因为随着Pb、Zn、Cd和Pb+Zn+Cd胁迫浓度的增加，植物地上组织中转移富集的重金属量也随之增加，毒性逐渐增强（复合重金属之间由于协同作用，使得毒性更强），破坏了植物内部的生长因子，抑制了植物的正常生长，导致其生物量降低，这与胁迫下聚合草生物量的表现特征吻合.
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表 3 重金属胁迫对聚合草表观特征的影响/cm Table 3 Effect of heavy metals on growth status of Symphytum officinale L./cm |
2.1.3 重金属胁迫下聚合草的耐性特征
植物耐性指数（TI）和根系耐性指数（RTI）是衡量植物对重金属胁迫耐受性的重要指标. 通常来说，当TI大于0.5时，意味着植物在相应条件下长势良好，对胁迫具备较强的耐受性；而RTI大于0.9时，则表明植物根系未受到明显抑制作用[22，24].
从图 1可以看出，在Pb胁迫条件下，试验浓度梯度范围内，聚合草的TI始终大于0.5，这体现出聚合草对Pb胁迫具有良好的耐受性. 然而，其RTI在低浓度梯度Pb50和Pb100时小于0.9，在高浓度梯度Pb200和Pb300时大于0.9，这表明聚合草的根系在低浓度Pb胁迫时会受到一定程度的抑制. 在Zn胁迫条件下，试验浓度梯度范围内，聚合草的TI均大于0.5，RTI均大于0.9，这清晰地表明聚合草对Zn胁迫耐受性良好，且对其根系的抑制作用较小. 不过，随着Zn浓度梯度的递增，对根系的抑制作用逐渐显著. 当受到Cd胁迫时，在试验浓度梯度范围内，聚合草的TI均大于0.5；其RTI在中低浓度Cd5、Cd10和Cd20时大于0.9，但当浓度增加到Cd30时小于0.9. 这说明聚合草对Cd胁迫耐受性良好，在中低浓度梯度下根系不受抑制，而高浓度时根系会受到明显抑制. 在Pb+Zn+Cd复合胁迫下，于试验浓度梯度范围内，聚合草的TI均大于0.5，且随着浓度梯度上升，TI值呈下降趋势；RTI在浓度梯度为F1时小于0.9，随后随着浓度梯度增大，RTI值先上升后下降，但均大于0.9. 这表明聚合草对Pb、Zn和Cd复合胁迫耐受性良好，低浓度时根系受到明显抑制，不过随着浓度增加，根系抑制作用减弱，推测是由于浓度增加使得Pb、Zn和Cd之间产生了拮抗作用.
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不同处理之间不同小写字母表示各处理间差异显著（P < 0.05），相同字母表示不显著，下同 图 1 重金属胁迫下聚合草耐性特征和根系耐性特征 Fig. 1 Tolerance characteristics of aggregated Symphytum officinale L. under heavy metal stress |
根据图 2所示，在Pb、Zn和Cd单一胁迫以及Pb+Zn+Cd复合胁迫下，对聚合草叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素含量的影响呈现出以下特征：
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图 2 重金属胁迫下对聚合草叶绿素含量的影响 Fig. 2 Effect of heavy metal stress on chlorophyll content of Symphytum officinale L. |
Pb胁迫时，与对照组（CK）相比，各浓度梯度胁迫下叶绿素含量均显著降低（P < 0.05），叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量相分别下降了43.92%~56.59%、48.15%~88.02%和45.32%~57.89%，说明Pb对植物叶绿素的合成具有明显抑制作用. 但随着植物体内Pb转移积累量的逐渐增多，植物会启动内部解毒机制，缓解对植物叶绿素合成的抑制. 因此，尽管在整体趋势上叶绿素含量随Pb浓度增加而降低，但在部分高浓度阶段，植物启动了内部解毒机制而缓解了对植物叶绿合成系统的抑制，表现出略微升高的现象. 说明了聚合草对Pb具有一定的抗逆性和耐性.
Zn胁迫时，各叶绿素指标与CK相比，差异显著（P < 0.05），且整体表现为抑制而趋于下降. 通常，适量的Zn会促进叶绿素的合成；但当Zn过量时，会引起叶绿素降解、光合作用抑制，甚至产生毒害作用，本研究说明，试验设置的Zn浓度梯度，导致聚合草体内Zn积累量较高，引起叶绿素降解. 但当浓度梯度提升至Zn400时，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量又呈现升高特征，推测可能是激发了植物体内的解毒机制，减缓了Zn对叶绿素合成系统的毒害作用. 这充分说明，聚合草对重金属Zn同样具有一定的抗逆性.
Cd胁迫时，对聚合草的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素的合成同样具有抑制作用. 当浓度梯度达到Cd20时，叶绿素a和总叶绿素下降幅度最大，与CK相比，分别降低了60.55%和61.14%. 但当浓度梯度达到Cd30时，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素含量均表现增加现象，推测可能是激发了植物体内的解毒防御机制，减缓了Cd对聚合草叶绿素合成系统的伤害. 说明聚合草对Cd的正常耐性极限为20 mg·L-1.
当Pb+Zn+Cd复合胁迫时，叶绿素a与总叶绿素含量随浓度梯度的增加而下降，与CK相比，复合浓度为F4时，叶绿素a与总叶绿素含量分别下降了73.57%和72.30%. 而叶绿素b，呈现出“低促高抑”趋势. 在低复合浓度F1时，类胡萝卜素的合成受到抑制；随着复合浓度进一步增加，其含量则呈现出“先升后降”趋势. 综合比较，Pb、Zn和Cd单一胁迫和Pb+Zn+Cd复合胁迫对聚合草叶绿素的含量影响基本相近，说明Pb、Zn和Cd重金属的复合对聚合草的叶绿素影响较小.
另外，纵观胁迫对叶绿素的影响，叶绿素a受重金属胁迫影响的程度更大，因为其在光合作用的光反应中起关键作用，故更容易受到重金属胁迫的干扰；而叶绿素b，在一定程度上对重金属的胁迫有相对较强的耐受性.
2.2.2 重金属胁迫下对聚合草抗氧化酶及其他指标的影响（1）对SOD酶活性的影响 结果如图 3所示，水培条件下，不同浓度Pb、Zn和Cd单一和Pb+Zn+Cd复合胁迫，对SOD酶活性的影响呈现出各异的特征. Pb胁迫时，聚合草SOD酶活性整体呈现抑制而降低的特征；当浓度增加到Pb200时，SOD活性降幅最大，与CK相比，降低了52.20%；随后浓度增加到Pb300时，SOD酶活性又上升，推测这可能是聚合草体内Pb转移富集到一定程度，毒性达到了植物的正常耐受极限，激发了聚合草体内的应急解毒机制，从而降低了Pb对SOD酶系统的抑制. Zn胁迫时，随着胁迫浓度的增加，SOD酶活性总体呈下降趋势；当浓度增加到Zn200，SOD酶活性降到最低，此时聚合草SOD酶的抗逆性达到极限，启动了体内解毒应急机制，缓解了Zn对SOD酶活性的抑制；但随着Zn浓度的继续增加，毒性越来越强，超越了植物体内的抗逆能力，SOD活性受到抑制；此外，除浓度梯度为Zn100外，其余各浓度梯度下的SOD酶活性与CK相比均存在显著差异（P < 0.05）. Cd胁迫时，情况有所不同，仅在浓度梯度为Cd10时，SOD酶活性较CK，降低了48.14%，其余浓度梯度均使聚合草SOD酶活性提高，相较于CK分别增加了3.29%、77.69%和41.21%；说明聚合草受到低浓度Cd的胁迫时，会抵御其毒害作用；随着Cd浓度的增加，到一定程度，会干扰植物细胞的正常代谢过程，导致SOD酶的合成、活性中心结构受到影响，使SOD酶活性降低；但当浓度继续增加，毒性增强，植物会调动体内其他防御系统，减缓对SOD酶活性中心结构的影响，但这种缓解能力是有限的，若浓度继续增加，抗逆能力就会逐渐失效. 与单一胁迫相比，Pb+Zn+Cd复合胁迫下聚合草SOD酶活性下降最为显著，与CK相比降低了69.71%~82.73%（P < 0.05）；复合胁迫对聚合草SOD酶活性的抑制作用比单一胁迫更为严重，这说明了复合胁迫时，Pb、Zn和Cd之间的协同作用，对SOD酶的合成和活性中心结构的影响更为严重.
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图 3 重金属胁迫下聚合草SOD酶活性 Fig. 3 Activity of SOD in Symphytum officinale L. under heavy metal stress |
（2）对POD酶活性的影响 结果如图 4所示，水培条件下，不同浓度Pb、Zn和Cd单一胁迫和Pb+Zn+Cd复合胁迫对聚合草POD酶活性的影响呈现出明显的差异. Pb胁迫下，聚合草POD酶活性随Pb浓度的升高而降低；当浓度梯度增加为Pb200和Pb300时，POD酶活性相较于对照组（CK）分别下降了76.56%和72.23%，是因为Pb会干扰聚合草细胞内的代谢平衡，影响POD酶的合成和活性中心结构或其在细胞内的定位等，导致POD酶活性下降，使聚合草清除活性氧的能力减弱. 适量的Zn是植物生长必须的微量元素，理应能协助POD酶维持其结构稳定性和活性；然而，在本研究的Zn胁迫过程中，当浓度梯度为Zn100时，相对于CK，聚合草体内的POD酶已经受到了抑制，这表明当Zn浓度梯度达到100 mg·L-1时，积累到聚合草体内的Zn已经超出其需求量，干扰到聚合草细胞内的代谢平衡，导致POD酶活性下降；随着Zn胁迫浓度的增加（Zn200和Zn300），积累到聚合草体内的Zn量超出正常耐受极限，植物会启动防御机制，POD作为一种重要的抗氧化酶，活性增强以清除体内过多的活性氧；但当Zn浓度继续增加（Zn400），体内积累的Zn量会严重干扰植物细胞内离子平衡，破坏POD酶的活性中心或改变了其空间结构，阻碍了酶的正常功能. 在低浓度Cd的胁迫下（Cd5）下，聚合草体内POD酶活性被激活升高，是因为植物感知到低水平的Cd胁迫后，POD酶活性增强，以清除体内因Cd胁迫而产生的过量活性氧，维持细胞内的氧化还原平衡；当浓度继续增加到Cd10时，会破坏植物正常的细胞结构和功能，导致POD酶活性下降；当浓度继续增加（Cd20和Cd30），进一步激发了聚合草体内更复杂的自我保护机制，重新调整了代谢途径，再次增强了POD抗氧化酶的活性；因此，POD酶活性呈现出升高⁃降低⁃升高的特征. 当受到Pb+Zn+Cd复合胁迫时，聚合草POD酶活性整体被抑制，与CK相比降低了51.65%~86.26%；而且，抑制作用比Pb、Zn和Cd各自单一胁迫时更为严重，这表明Pb、Zn和Cd复合胁迫对POD酶具有协同效应，对POD酶系统的抑制作用更强.
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图 4 重金属胁迫下聚合草POD酶活性 Fig. 4 POD activity of Symphytum officinale L. under heavy metal stress |
（3）对CAT酶活性的影响 从图 5可以看出，在水培条件下，不同重金属对聚合草CAT酶活性的影响各有特点. 单一Pb胁迫时，低浓度的Pb会促进聚合草体内的CAT酶活性，使其呈上升趋势；当Pb浓度增加到100时，聚合草CAT活性增幅最大，与对照组（CK）相比增加了317.91%；但当胁迫浓度梯度增加到Pb200、Pb300时，植物体内的Pb浓度超过植物的正常耐受能力，就会干扰聚合草细胞的正常代谢，导致CAT酶活性下降，使植物清除活性氧的能力下降. Zn作为植物必须的微量元素，适量的Zn对聚合草体内CAT酶活性具有促进作用，故使聚合草CAT酶活性整体呈上升趋势；但当其浓度增加到Zn200时，聚合草体内的Zn积累超过了其正常的耐受能力，可能由于离子的毒害作用，导致聚合草细胞生理功能紊乱，对CAT酶活性产生了一定的抑制作用；而当浓度增加到Zn400时，进一步激发了聚合草体内更复杂的自我保护机制，减缓了Zn的毒害对CAT酶活性的影响，使得CAT酶活性增强，与CK相比，活性增加了36.92%. Cd胁迫对聚合草CAT酶活性具有抑制作用；但当胁迫浓度为Cd10时，激发了CAT酶的活性，植物通过增加CAT酶的活性来减轻氧化损伤，保护植物细胞结构和功能的完整性；当浓度继续增加到Cd20和Cd30时，植物体内的Cd积累量超过了植物的耐性阈值，严重干扰甚至破坏了植物的正常代谢，破坏了植物CAT酶的合成系统，致使CAT酶活性逐渐下降. 值得注意的是，Pb、Zn和Cd多种重金属的共同作用时，可能存在拮抗作用，在一定程度上缓解了单一重金属对CAT酶活性的影响，也可能激发了聚合草更强的应激反应，调动更多的资源来增强CAT酶的活性，以应对复合胁迫带来的氧化压力；但随着复合浓度的增强（F2、F3和F4），这种应激能力有限，而毒害所造成的抑制作用在增强，表现出CAT酶活性下降趋势；因此，Pb+Zn+Cd复合胁迫时，聚合草CAT酶活性呈现低促高拟的特征，与CK相比增加了191.04%~354.23%.
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图 5 重金属胁迫下聚合草CAT酶活性 Fig. 5 Activity of CAT in Symphytum officinale L. under heavy metal stress |
（4）对MDA质量摩尔浓度的影响 如图 6所示，在水培条件下，当Pb浓度的梯度为Pb50时，聚合草体内积累的Pb会激活植物MDA酶，通过提高MDA酶活性来增强自身的抗氧化防御能力；但当浓度增加到Pb100时，体内积累的Pb会大量进入植物细胞，影响MDA酶的结构或活性中心，导致MDA酶活性降低；当浓度达到Pb200时，植物体内Pb浓度积累到一定程度，超过其阈值，植物启动了其他更为复杂的自我保护机制，重新调整了代谢途径，MDA酶活性进一步提高，以此应对降低Pb对植物代谢系统的损害；然而，当胁迫浓度增加到Pb300时，体内积累的Pb对植物MDA酶的抑制作用超越了自我保护能力时，使得MDA酶活性下降. 对于植物MDA酶而言，Zn可能参与到其活性中心，使得MDA的产生量较少，相应的MDA酶活性也能保持在一个较为稳定的水平；因此，聚合草叶片中的MDA质量摩尔浓度与对照组（CK）相比无显著差异，变化幅度较小. 在低浓度Cd（Cd5）胁迫下，聚合草中MDA酶降低，说明聚合草对Cd较为敏感，即使较低浓度的Cd，也能导致其MDA酶活性降低；但当Cd浓度继续增加（Cd10、Cd20和Cd30），会导致植物体内活性氧的积累，进而引发脂质过氧化，致使植物体内MDA质量摩尔浓度升高；在浓度梯度为Cd20时，聚合草的MDA质量摩尔浓度达到最大值，与对照组（CK）相比，增加了42.13%. 在Pb+Zn+Cd复合胁迫中，Zn可能会与Pb和Cd竞争植物根系表面的吸收点位，减少植物对Pb和Cd的吸收，从而在一定程度上（F1、F2和F3）缓解了Pb和Cd对MDA酶活性的抑制作用，使MDA酶活性相对单一Pb或Cd胁迫时有所提高；但如果Zn过高（F4），会与其他重金属产生协同毒性，抑制MDA酶活性.
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图 6 重金属胁迫下聚合草MDA质量摩尔浓度 Fig. 6 Molality of MDA in Symphytum officinale L. under heavy metal stress |
（5）对Pro含量的影响 从图 7分析可以看出，在水培条件下，当低浓度的Pb和Zn（Pb50和Zn100）单独胁迫时，聚合草体内积累的Pb或Zn均会导致Pro合成途径的抑制，Pro含量会下降；然而，当Pb或Zn的胁迫浓度继续增加，植物体内Pb或Zn的积累量增加，毒性增强，会刺激植物启动保护机制，通过积累Pro来应对胁迫，表现植物Pro含量增加. 受到Cd胁迫时，低浓度（Cd5、Cd10和Cd20）胁迫下，植物体内的Pro含量逐渐增加，主要是因为植物将Pro作为一种渗透压调节物质来应对Cd胁迫带来的细胞内环境变化；Pro的积累有助于维持细胞的渗透压，防止细胞因水分流失而受损，同时还能起到稳定生物大分子结构、清除活性氧等作用，增强植物的抗逆性；但当浓度梯度增加到Cd30时，超过了聚合草的耐受阈值，其Pro含量出现降低，这是由于高浓度Cd对聚合草造成了严重的毒害作用，影响了Pro的合成或者导致Pro的分解加速. 当受到Pb+Zn+Cd复合胁迫时，低浓度（F1和F2）情况下，植物感知到Pb、Zn和Cd存在后，会启动应激反应，激活Pro的合成代谢途径，使Pro含量上升，增强植物对复合重金属胁迫的抵抗能力；这表明此3种重金属可能存在一定的协同促进植物积累Pro的作用；但当复合重金属浓度过高时（F3和F4），高浓度的Pb、Zn和Cd会破坏聚合草体内的激素平衡、干扰酶的活性和代谢过程，抑制Pro的合成，同时促进Pro的分解，导致Pro含量下降；而且，3种重金属之间可能存在竞争和拮抗作用，如Zn在高浓度时可能会与Pb、Cd竞争吸收位点和转运载体，影响植物对Pb、Cd的吸收和积累，从而间接影响Pro含量的变化，使Pro含量的变化趋势更加复杂.
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图 7 重金属胁迫下聚合草Pro含量 Fig. 7 Pro content of Symphytum officinale L. under heavy metal stress |
根据表 4数据，水培条件下，当受到Pb胁迫时，聚合草地上部ω（Pb）范围为27.02~55.04 mg·kg-1，根系中则在68.85~502.74 mg·kg-1之间；在Zn胁迫下，地上部分ω（Zn）为228.72~459.16 mg·kg-1，根系含量为606.96~2 718.84 mg·kg-1；而Cd胁迫时，地上部ω（Cd）为6.16~33.42 mg·kg-1之间波动，根系含量处于41.96~280.55 mg·kg-1区间；整体来看，单一重金属胁迫时，聚合草根系中Pb、Zn和Cd的含量均显著高于地上部分. 在Pb+Zn+Cd复合胁迫下，聚合草地上部ω（Pb）范围是4.46~9.43 mg·kg-1之间，ω（Zn）处于152.49~340.95 mg·kg-1区间，ω（Cd）范围为8.28~37.88 mg·kg-1；根系中，ω（Pb）范围为59.36~354.77 mg·kg-1，ω（Zn）介于1 085.29~2 107.69 mg·kg-1之间，ω（Cd）则处于50.86~204.79 mg·kg-1. Pb+Zn+Cd复合胁迫时，聚合草地上和根系中Pb的含量均低于单一Pb处理，地上部分Zn含量也低于单一Zn处理；不过，在低浓度复合胁迫时，根系中Zn含量高于单一Zn胁迫，但高浓度时，根系Zn含量低于单一Zn胁迫；地上部Cd含量高于单一Cd胁迫，低浓度复合胁迫时，根系中Cd含量也高于单一Cd胁迫，其余复合胁迫浓度下，根系中Cd含量与单一胁迫相比不稳定，推测是复合胁迫的毒害作用超过了植物的耐受限度，致使植物生理功能紊乱.
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表 4 聚合草体内重金属的含量、富集量及转运系数 Table 4 Heavy metal content, accumulation, and transport coefficient in plant of the Symphytum officinale L. |
2.3.2 聚合草地上部和根系对重金属的富集量
根据表 4数据可得，聚合草地上部分对Pb、Zn和Cd的富集量范围分别为652.00~1 288.10、3 210.50~8 991.98和161.48~765.82 μg·plant-1；其根系对Pb、Zn和Cd的富集量，随着重金属胁迫浓度梯度的上升而增加，最高富集量分别可达8 121.74、29 934.85和5 891.38 μg·plant-1. 在Pb+Zn+Cd复合重金属胁迫条件下，地上部对Pb、Zn和Cd的富集量范围依次为91.71~151.35、2 918.00~5 936.6和170.17~607.80 μg·plant-1；根系对这3种重金属的富集量范围分别是685.65~3 470.37、13 484.58~20 617.42和631.98~2 003.33 μg·plant-1. 综合本研究结果可知，聚合草根系对Pb、Zn和Cd的富集量高于地上部分；并且，在单一重金属胁迫下，聚合草对Pb、Zn和Cd的富集能力强于复合胁迫情况.
2.3.3 聚合草对重金属的TF从研究结果可知（表 4），在水培条件下，整体而言聚合草对重金属的转运效果（TF）表现一般. 在单一Pb胁迫时，其对Pb的转运效果优于复合重金属胁迫下对Pb的转运效果. 在低浓度梯度Zn100胁迫时，聚合草对重金属Zn的转移系数TF大于0.5，而在其余胁迫条件下，聚合草对Zn的转移系数TF均小于0.5. 此外，无论是单一重金属胁迫还是复合重金属胁迫，聚合草对Cd的转移能力基本保持一致.
3 讨论 3.1 重金属胁迫对聚合草生物量及生长特征的影响植物的生物量常被视作评估植物对重金属耐性的间接指标，同时也是衡量重金属超/高富集植物是否具备应用潜力的关键要素[25]. Papoyan [26]指出，植物生物量越大，就越能更多地富集土壤中的重金属污染物，进而发挥更为有效的修复作用. 不过，大量研究表明，当植物遭受重金属胁迫时，体内重金属量富集到一定程度后，会抑制植物的发育进程和生长速度，最终导致生物量减小[27~29]. 也有研究表明，低浓度的重金属在一定程度上会促进植物生长，而高浓度的重金属则会对植物的生长产生抑制作用，呈现出对植物生物量的“低促高抑”的效应 [30，31]. 在本研究中，聚合草根系生物量随Pb、Zn和Cd的浓度梯度的增加而降低，地上部生物量在低浓度胁迫下增加，在高浓度胁迫下受到抑制而降低，表现出“低促高抑”的特征. 这主要是因为植物根系首先与重金属溶液直接接触，重金属离子通过根系吸收进入植物体内并富集，随后才借助运输机制转移到植物的其他部位. 所以，根系的重金属富集量最易超过植物自身的耐受能力，率先表现出抑制或毒害效应，进而导致根系生理代谢失调，生长受到抑制. 而植物地上的茎和叶组织，一方面从根系转移富集过来的重金属相对较少；另一方面，地上组织中的一些抗逆性酶能够对植物起到保护作用，所以地上部分表现出“低促高拟”特征.
重金属对植物生理与生长影响是多维度的，包括抑制植物的生长发育、导致株高变矮、叶面积减小等，最终体现为植物生物量的降低. 因此，植株大小可以作为评估植物受重金属胁迫的表观指标. 张迦得等[32]的研究发现，水培条件下，不同浓度Cd胁迫会使3种药用甘草的株高、根长、叶片数和生物量显著下降. 段晓清等[33]的研究表明，复合重金属（Cd+Pb+Cu+Zn）胁迫会对辣木株高、地径、根长和根粗的生长均产生显著抑制，并且随着胁迫程度的加剧，抑制作用逐渐增强. 以上研究结果与本研究基本一致. 在本研究中，复合重金属（Pb+Zn+Cd）胁迫对聚合草生长状况具有显著的抑制作用（P < 0.05）；在单一胁迫时，植物在低浓度胁迫下仅表现出叶片面积减小；而在高浓度胁迫下，植物不仅表现出植株矮小，还出现叶片卷曲，根系颜色变褐发黑的现象. 这表明重金属干扰了植物体内正常的生理生化活动，尤其是复合（Pb+Zn+Cd）胁迫时，严重妨碍了植物的正常生长，充分说明复合胁迫对聚合草的毒性及危害程度强于单一胁迫.
3.2 重金属胁迫对聚合草耐性的影响植物耐性指数（TI）和根系耐性指数（RTI）能够直观反映植物在重金属环境下的生长态势以及根系受影响程度[34~36]. 对这两个指标的深入研究，不仅可以揭示植物应对重金属胁迫的内在机制，还能为评估植物在污染环境中的适应能力提供量化依据. 本研究中，Pb、Zn和Cd单一胁迫和Pb+Zn+Cd复合胁迫下，TI均大于0.5，表示聚合草对Pb、Zn和Cd单一胁迫和复合胁迫均表现出良好的耐受性，有较强的适应能力，仍能维持基本生长态势. 但根系对不同重金属及浓度的响应各有特点. 低浓度Pb抑制聚合草根系生长，是由于低浓度时，植物需投入大量能量应对胁迫，限制根系发育；而高浓度下抑制却减弱，这可能源于植物的适应性调节，激活了特殊的保护机制，如合成更多金属螯合肽或抗氧化酶，减轻对根系的损伤. 对于Zn胁迫，虽然聚合草整体表现出良好的耐受性，低浓度下根系几乎不受抑制（RTI均大于0.9），但随着浓度升高，根系抑制逐渐明显，这可能是因为高浓度Zn破坏了根系细胞内的离子稳态，干扰了正常代谢活动，影响根系生长. 在Cd胁迫下，中低浓度时聚合草根系不受抑制，高浓度才出现明显抑制，这说明聚合草对Cd有一定缓冲能力，或许是通过根系细胞壁吸附、液泡区隔化等方式降低Cd毒性；但高浓度下，以上防御机制可能被突破，导致根系受损. 复合胁迫下，低浓度时根系受明显抑制，随着浓度升高抑制减弱，推测是重金属间的拮抗作用所致，这种拮抗可能发生在吸收、转运等环节，比如竞争了根系表面的吸附位点、离子通道或转运蛋白，改变了各重金属在植物体内的积累和分布，进而影响根系生长.
光合色素作为植物光合作用的物质基础，其含量高低对植物光合作用进程以及三磷酸腺苷（ATP）的产生起着关键作用[37]. 重金属往往会破坏植物叶绿素的稳定性，导致叶绿素在光照下更易分解，进而造成叶绿素含量减少，对植物光合作用产生负面的影响. 所以，植物体内叶绿素含量的变化可作为研究其抗性的关键参考指标[38]. 在本研究中，Pb、Zn和Cd的单一胁迫和Pb+Zn+Cd复合胁迫，均对其叶绿素含量产生了不同程度影响. 具体而言，Pb干扰了关键酶的合成或过程，显著抑制了其叶绿素的合成. 然而，随着植物体内Pb积累的增加，聚合草启动了解毒机制，在部分高浓度阶段缓解了这种抑制作用，这充分体现出聚合草对Pb胁迫具备一定的自我调节和适应能力. 受Zn胁迫时，聚合草叶绿素含量整体呈下降趋势. 结合其他相关指标推测，这可能是由于试验设置浓度过高，导致植物体内Zn过量积累，从而引发叶绿素降解或抑制了光合作用. 不过，在Zn400时，叶绿素含量升高现象，这一结果有力地证明了聚合草对Zn胁迫有抗逆性. 当处于低浓度Cd胁迫时，聚合草叶绿素的合成便开始受到抑制；当ρ（Cd）达到20 mg·L-1时，对其光合系统破坏最严重，由此便可推测聚合草的忍耐极限为20 mg·L-1；而当ρ（Cd）升高至30 mg·L-1时，叶绿素含量反而增加，这是因为其激发了强大的解毒防御机制. 在Pb+Zn+Cd复合胁迫下，3种重金属之间并未产生明显的协同或拮抗效应，它们对聚合草叶绿素含量的影响相对独立. 总之，从叶绿素种类差异来看，叶绿素a在光反应中起关键作用，因此更容易受到重金属胁迫干扰，受影响程度较大；而叶绿素b对重金属胁迫耐受性则相对更强，这可能与它在光合作用中的功能和结构特点相关[39]. 本研究中的重金属胁迫下的叶绿素的表现特征，这与李欣航等[40]和张莉等[41]研究的结果一致.
在重金属胁迫下，植物生长受到抑制，此时植物内部首先激发抗逆性酶发挥作用，这是植物做出的相应自我保护机制[42]. 植物体内的SOD酶、POD酶及CAT酶是参与淬灭活性氧过程的重要活性酶[43]，其活性变化状况与植物体内氧化胁迫直接相关. 这3种酶在植物生长过程中相互协调，使生物体内活性氧自由基维持在平衡状态，是植物细胞内清除活性氧、抵御各种逆境胁迫的重要保护酶类[44]. 在本研究中，Pb+Zn+Cd复合胁迫下，聚合草SOD酶活性均低于CK；但在单独Cd处理下，SOD酶活性呈上升-下降-上升的趋势，这与牟祚民等[16]的研究结果一致，说明较高浓度的Cd会破坏植物体内的酶活性，但当Cd离子浓度过高时又会刺激植物对超氧阴离子的分解. 而无论单一还是复合胁迫，聚合草POD酶活性普遍低于CK. 除了Pb胁迫外，聚合草CAT酶活性普遍高于对照，尤其是在Pb+Zn+Cd复合胁迫下，CAT酶活性显著高于CK（P < 0.05），这表明本试验的胁迫浓度尚在聚合草的耐受范围内. 总体而言，在本水培试验中，Pb、Zn和Cd的单一胁迫以及Pb+Zn+Cd复合胁迫，均对聚合草的酶系统产生了不同程度的影响. 然而，聚合草能够通过自身调节抗氧化系统机制，减少逆境对自身的伤害，以适应环境. 这主要依赖于SOD、CAT和POD酶的相互协调、共同抵抗，从而保护聚合草免受外来重金属的毒害，使其能够正常生长[45].
丙二醛（MDA）是膜脂氧化降解的主要产物，是检测膜损伤程度的一个公认指标. 在单一Pb和Zn各自胁迫时，聚合草MDA质量摩尔浓度与对照相比无显著差异；而在Cd胁迫下，MDA质量摩尔浓度呈下降-上升-下降的趋势，这说明在中低浓度下，Cd刺激了MDA的合成，而高浓度的重金属对聚合草膜系统造成了伤害. 与之相反，在复合处理下，MDA质量摩尔浓度呈现先上升后下降的趋势，这表明在低浓度处理时，植物可能通过抗氧化酶和渗透调节对胁迫做出响应并抵御了伤害，但在高浓度胁迫下，超过了植物自身调节的极限，从而造成了损伤.
Pro作为植物体内至关重要的渗透调节物质，在植物活性氧清除、细胞渗透压与胞质酸度调节以及维持细胞膜、核酸和蛋白结构稳定等方面发挥着不可或缺的作用，同时，它对外界不良环境胁迫具备一定的指示功能. 在本试验中，聚合草体内的Pro呈现出两种不同的变化特征. 在受到Cd胁迫以及Pb+Zn+Cd复合胁迫时，聚合草体内的Pro含量表现出先上升后下降的趋势，其中在Cd处理下，这种变化具有显著差异性（P < 0.05）. 这一现象表明，在Cd胁迫初期，Cd刺激植物细胞内产生大量的活性氧，以上过量积累的活性氧影响了细胞内与Pro合成相关酶的合成过程，促使细胞合成更多的Pro以应对胁迫；然而，当Cd浓度持续升高并超过植物自身的耐受限度时，过高浓度的Cd会抑制酶的活性中心，导致酶系统功能紊乱，进而造成Pro含量下降. 而在Pb和Zn各自单一胁迫下，聚合草Pro含量呈现出先下降后上升的趋势. 这意味着在胁迫初期，较低浓度的Pb或Zn可能对植物细胞造成一定程度的损伤，使得Pro含量有所下降；但当胁迫浓度达到一定程度时，植物细胞会启动自我保护策略，通过一系列生理调节机制，促使植物体内Pro含量增加，以增强植物对逆境胁迫的抵抗能力.
3.3 聚合草对重金属的吸收积累效果植物对重金属的吸收与积累，会因植物种类、部位以及重金属种类的差异而有所不同[46]. 在本试验的单一胁迫条件下，聚合草地下部对重金属的富集量随着胁迫浓度梯度的增加而上升. 而且聚合草体内对Pb、Zn和Cd的富集量远远超过普通植物. 这不仅表明重金属能够在聚合草体内富集，且其富集量已超出普通植物的毒性标准，同时也意味着聚合草或许具备内部解毒机制[47，48]. 时萌等[49]的研究指出，大多数植物对镉的吸收主要集中在根部，地上部分的含量相对较低. Gadd[50]发现印度芥菜根部对镉的富集量显著高于地上部分，纪美辰等[51]的研究也证实，在水培条件下，几种水生植物地下部分对Pb的富集量远大于地上部分，这充分说明Pb进入植物体后，主要聚集在植物根部[52]. 本研究结果同样显示，聚合草根系对Pb、Zn和Cd的富集量远超地上部分. Brewin等[53]和Deng等[54]均认为，植物从土壤中吸收重金属后，将其固定在根部，限制重金属向地上部分迁移，以此减少对地上部分的毒害，这是植物对重金属的一种排斥机制. 这表明在重金属胁迫下，植物能够平衡自身对重金属的吸收与转移过程，具备适应逆境污染胁迫的能力. 在本研究中，可能由于水培周期较短，导致植物体内重金属转运时间不足. 此外，水培试验培养液中的重金属均以离子状态存在，活性高且毒性强. 因此，从转移系数来看，聚合草对Pb、Zn和Cd的转移能力并不理想，仅在ρ（Zn）为100 mg·L-1处理下，TF > 0.5，其余浓度梯度以及复合浓度梯度下，对Zn和Cd的转移效果均不佳. 同时，单个Pb处理下的转移效果优于复合胁迫下对Pb的转移效果. 陆琳等[55]研究发现，高浓度的Pb（≥500 mg·L-1）会促进油白菜根部的Cd向地上部转运，而高浓度的Cd则会抑制油白菜根部的Pb向地上部转运，致使更多的Pb滞留在油白菜地下部. 本研究还发现，聚合草根系对Pb、Zn和Cd的吸收含量，会因重金属种类及胁迫浓度的不同而变化. 与单一胁迫相比，在复合胁迫下，聚合草根系对Zn的吸收量差异不明显，对Pb的吸收量显著降低，对Cd的吸收量显著增加. 这表明聚合草对Pb和Cd的吸收富集可能存在竞争拮抗作用，这一结论与刘家女等[56]和郭雄昌等[57]的研究结果相符.
4 结论（1）随着Pb、Zn和Cd浓度梯度增加，聚合草根系生物量逐渐降低，地上部生物量呈现“低促高抑”现象. 高浓度处理显著抑制植物叶片面积和植株大小，对叶绿素含量也产生不同程度的抑制，表明重金属胁迫对聚合草的生长发育和光合作用产生负面影响.
（2）聚合草对Pb、Zn、Cd单一胁迫及Pb+Zn+Cd复合胁迫均具有良好耐受性，但不同重金属及浓度对其根系抑制作用有差异. 单一胁迫下，低浓度Pb、高浓度Cd对根系有明显抑制，Zn胁迫对根系抑制作用随浓度递增逐渐显著，复合胁迫下低浓度时根系受明显抑制，但随浓度增加抑制作用减弱.
（3）面对Pb、Zn和Cd单一及复合胁迫，聚合草体内的SOD、POD和CAT这3种酶活性呈现出不同变化特征，这是3种氧化还原酶与MDA、Pro协同作用抵御重金属胁迫的结果，保障了聚合草在逆境中仍能维持正常生长.
（4）聚合草对Pb、Zn和Cd的富集量随胁迫浓度升高而增加，且根系的富集量远大于地上部分. 除ρ（Zn）为100 mg·L-1胁迫时转移系数TF > 0.5外，其余浓度梯度下聚合草对重金属的转运与富集效果欠佳.
（5）与单一胁迫相比，Pb+Zn+Cd复合胁迫时，聚合草根系对Pb的富集能力显著降低，对Cd的富集能力显著增加，表明聚合草对Pb和Cd的吸收富集存在竞争拮抗作用.
（6）水培条件下，虽然聚合草尚未达到超富集植物的指标限值，但其根系发达、生长迅速、再生能力强，对Pb、Zn和Cd具备一定的耐性和解毒能力，是一种理想的Pb、Zn和Cd污染修复优选植物，作为超富集植物种质资源，在修复Pb、Zn和Cd重金属污染土壤方面极具价值.
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