2025, Vol. 46
2. 河北省污染防治生物技术实验室, 石家庄 050018
, GAO Sai1 , WANG Lin-jing1 , ZHAO Bo1 , LU Meng-qi1 , SONG Yuan-meng1 , CUI Jian-sheng1,2 , ZHANG Lu-lu1,2
2. Hebei Key Laboratory of Pollution Prevention Biotechnology, Shijiazhuang 050018, China
自1928年Alexander Fleming发现青霉素以来, 抗生素在医药、畜牧业和水产养殖业等行业得到广泛应用[1]. 在2000~2018年间, 全球抗生素消费量增加了46%, 中国成为最大的抗生素生产国和消费国[2]. 有研究显示, 大约30%~90%的抗生素通过尿液或粪便排泄, 以原药或其代谢产物的方式进入环境[3], 最终流入污水处理厂[4]. 然而, 传统污水处理技术对抗生素等新兴污染物处理能力不足, 导致这些物质未能被有效去除[5]. 据估算, 我国河流每年接收超过5万t抗生素[6]. 低浓度抗生素在环境中可诱导微生物产生抗性和耐药性. 世卫组织估算, 到2050年抗生素耐药性可能每年导致全球1 000万人死亡, 并造成高达100万亿美元的经济损失[7]. 因此, 解决抗生素耐药性问题已成为当今最紧迫的环境挑战之一.
近年来, 环境中抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）问题日益严重[8]. ARGs的形成与传播是一个涉及多重生物学机制的复杂过程, 其中包括基因突变、基因水平选择和水平基因转移等[9]. 尤其是由可移动遗传元件（mobile genetic elements, MGEs）介导的水平基因转移, 这一机制对于ARGs在多种细菌之间的广泛传播起到了关键作用. 转座元件、整合子和插入序列等[10 ~ 12]作为基因组内可自主移动或跳跃的DNA片段, 它们具有携带和传递包括ARGs在内的多种功能基因的能力[13]. 因此, MGEs的普遍存在与多样性, 在细菌ARGs的变异、适应性增强及演化过程中起着至关重要的作用[14]. 宏基因组学、高通量定量PCR等是重要的分子生物技术, 常用于精确量化特定抗性基因和可移动遗传元件, 为理解它们在环境中的行为提供重要工具[15, 16]. 随着对ARGs及MGEs在水环境中的分布、演化动态及其生态效应研究的深入, 该领域已成为环境科学研究的重点[17 ~ 20]. 当前研究重点主要集中在人类活动（如污水处理、农业和养殖业）以及环境因素（如抗生素浓度和重金属污染）对ARGs的时空分布及传播模式的影响[21 ~ 23]. 以上研究结果表明, 人类活动和环境因素对ARGs的分布与动态产生了深远的影响. 然而, 对于不同河流中MGEs的时空分布的差异性以及驱动MGEs分布差异的主要影响因素, 目前的认识仍有限. 鉴于此, 本研究将系统地比较城市和郊区河流中MGEs的时空分布规律, 并识别不同河流中MGEs的主要影响因素.
作为中国重要的药品生产基地之一, 石家庄汇集了多家大型制药企业, 包括华北制药、以岭药业和石药等[24]. 据估算, 华北制药集团的抗生素原料总产量约占全国总产量的15%, 且在青霉素和半合成青霉素等中间体产量方面位居亚洲首位[25]. 然而, 随着制药业的迅速发展, 大量的制药废水、生活污水和畜禽养殖废水排放至河流中, 导致石家庄城市河流抗生素污染问题日益严重[26], 对人类健康和生态环境带来了潜在的威胁. 鉴于MGEs对ARGs的传播具有重要作用, 而目前有关石家庄城市和郊区河流中MGEs的研究仍未开展. 因此, 本文选择石家庄的3条城市河流和2条郊区河流作为研究对象, 收集沉积物样品, 深入探讨MGEs在河流沉积物中的分布和动态. 研究主要采用宏基因组测序技术, 比较不同河流中MGEs的时空分布特征, 识别城市和郊区河流MGEs的主要影响因素, 旨在为不同河流中的抗生素抗性风险管控提供依据和数据支持.
1 材料与方法 1.1 样品采集为了进行城郊河流全面的分析, 本文选择石家庄地区3条城市河流滹沱河（HTH）、汪洋沟河（WYG）和洨河（XH）, 以及两条郊区河流磁河（CH）和郜河（HH）作为研究对象（图 1）. 其中, 磁河（CH1、CH2、CH3）和郜河（HH1、HH2、HH3）流经石家庄郊区, 主要受到农业和水产养殖活动的影响；滹沱河（HTH1、HTH2、HTH3）、洨河（XH1、XH2、XH3）和汪洋沟河（WYG1、WYG2、WYG3）位于市区, 其污染物浓度较高, 主要来源于工业废水、生活污水和城市化影响. 样本采集分别在2020年12月和2021年4月以明晰时间变化；选择了城郊河流的代表性采样点以捕捉空间变化.
|
图 1 石家庄城郊河流采样点示意 Fig. 1 Schematic of river sampling sites in urban and suburban areas of Shijiazhuang City |
采用彼得森采泥器在每个监测点收集3个沉积物样本, 深度范围为0~3 cm. 去除样本中的石块、植物残骸和其他杂质, 随后将样本密封在无菌的聚乙烯袋中, 并低温保存运送至实验室后, 将样本放置在玻璃盘中, 在-80℃下冷冻干燥3~4 d. 之后对样本进行粉碎和研磨处理, 并通过40目筛进行筛选, 再将其装入袋中冷冻存储. 最后, 取出不少于1 g的样本置于无菌管中, 保存在-20℃的环境中, 用于后续的DNA提取工作.
1.2 典型喹诺酮类抗生素分析 1.2.1 样品预处理准确称取4 g样品, 与适量干燥的硅藻土充分混合, 使用乙腈-磷酸盐缓冲液（pH=3）作为萃取液. 采用ASE 350快速溶剂萃取仪进行萃取, 循环2次, 使用平行浓缩蒸发仪将萃取液浓缩至不足1 mL, 转移至锥形瓶, 并用超纯水稀释至200 mL. HLB柱由6 mL甲醇、3 mL盐酸0.5 mol·L-1和6 mL超纯水活化, 然后以2~5 mL·min-1的流速通过HLB小柱进行萃取. 上样后, 用10 mL超纯水淋洗并弃去淋洗液, 负压下抽空干燥30 min. 最后, 依次用6 mL体积比为2%氨水/甲醇溶液和6 mL纯甲醇溶液洗脱. 洗脱液在40℃下经氮吹至近干, 再用甲醇∶水=1∶1水溶液定容至1 mL, 过0.22 μm滤膜后转移至棕色瓶中, 待分析[27].
1.2.2 喹诺酮类抗生素测定本研究采用Agilent 1200系列HPLC系统, 配备Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus-C18柱（2.1 mm×50 mm, 1.8 μm）, 并结合安捷伦6470三重四极杆质谱系统进行分析. 流动相A为0.1%甲酸水溶液, B为0.1%甲酸-甲醇溶液, 流速设置为0.3 mL·min-1. 样品进样量为5 μL, 干燥气体温度为350℃. 质谱分析采用电喷雾离子化源和多重反应监测模式, 离子源流速为11 L·min-1, 雾化器压力为310 275 Pa, 毛细管电压为±3 500 V, 加速电压为4 V[28].
目标抗生素包括14种喹诺酮类（quinolones, QNs）：喹酸（oxolinic acid, OXO）、氧氟沙星（ofloxaci, OFL）、恩诺沙星（enrofloxacin, ENR）、司帕沙星（sparfloxacin, SPA）、氟甲喹（flumequine, FLU）、氟罗沙星（fleroxacin, FLE）、依诺沙星（enoxacin, ENO）、达氟沙星（difloxacin, DIF）、诺氟沙星（norfloxacin, NOR）、沙氟沙星（sarafloxacin, SAR）、奥比沙星（orbifloxacin, ORB）、环丙沙星（ciprofloxacin, CIP）、吡哌酸（pipemidic Acid, PIP）和马波沙星（marbofloxacin, MAR）. 以上标准品均购自Sigma-Aldrich（Steinheim, 德国）, 确保分析纯度 > 95%.
1.2.3 质量控制利用外标法定量分析QNs, 通过使用甲醇水溶液（1∶1）从1 μg·mL-1的储备液中准备出稀释后的浓度样本, 具体包括0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0 ng·mL-1. 利用HPLC-MS进行分析, 建立质量浓度与峰面积之间的标准曲线, 相关系数均达到或超过0.99. 在样品分析中, QNs的回收率为72.5%~104.4%.
1.3 宏基因组分析 1.3.1 DNA提取在DNA提取过程中, 采用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit（Omega Bio-tek, 美国）从沉积物样本中提取基因组DNA. 使用TBS-380和NanoDrop200仪器测定DNA的浓度与纯度, 用1%琼脂糖凝胶电泳检验DNA的完整性. Covaris M220对DNA进行片段化处理, 选取约400bp的片段进行双端测序文库的构建, 确保每个样本的DNA量不少于0.25 µg.
1.3.2 构建PE文库在双端测序文库的构建过程中, 使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq（Bioo Scientific, 美国）. 该流程包括接头的添加、磁珠清除自连片段、利用PCR方法增强文库的模板丰度, 并通过磁珠技术收集PCR产物, 最终完成文库的制备.
1.3.3 桥式PCR和测序在桥式PCR和测序阶段, 采用Illumina NovaSeq6000（Illumina, 美国）执行宏基因组测序. 每组15个样品的总数据量约为210 Gb, 单个样本数据量位于12~16 Gb之间. 在这一过程中, 文库分子与引物碱基在芯片上互补配对并形成桥式结构. 在PCR扩增阶段, DNA簇被生成并线性化为单链. 随后, 引入改造过的DNA聚合酶和4种荧光标记的dNTPs进行测序. 最终, 通过激光扫描技术读取模板序列, 利用荧光信号分析来确定DNA片段的具体序列.
1.3.4 测序序列统计与质控经过质量控制, 使用fastp工具（https://github.com/OpenGene/fastp, version 0.20.0）处理原始序列, 质量剪切读段的3'端和5'端接头序列, 并移除长度 < 50 bp、平均碱基质量低于20或含有N碱基的读段, 以保留高质量的配对端和单端读数. 采用MEGAHIT（https://github.com/vouten/megahit, version 1.1.2）进行序列的拼接, 选取长度 > 300 bp的contigs作为最终组装结果. 利用MetaGene（http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/）对contigs进行开放阅读框预测, 选择核酸长度≥100 bp的核酸序列, 并将其翻译成氨基酸序列. 使用CD-HIT（http://www.bioinformatics.org/cd-hit/, version 4.6.1）以90%的同一性和覆盖率参数对所有样品预测的基因序列进行聚类, 构建一个非冗余的基因集, 其中每一类选取最长的基因作为代表序列. 读段与已建立的非冗余基因集进行匹配, 采用RPKM（reads per kilobase million）准确统计每个样本中基因的丰度信息. 与ISFinder、INTEGRALL和ICEberg数据库进行比对（比对长度≥25、序列同一性≥50%、E≤1e-5）, 获得基因对应的注释信息, 研究中所使用的测序数据已经上传至NCBI的SRA数据库, 具体登录号为PRJNA1001998.
1.4 数据分析通过查阅石家庄2020~2021年统计年鉴并从中收集了以下信息：总人口（TP）、每年污水排放量（Sew）、工业企业数量（IE）、水产养殖GDP（AGDP）和畜牧业GDP（LGDP）. 利用ArcMap 10.8软件绘制了采样位置的地图, 以直观展示各采样点的分布. 在进行单变量方差分析和Pearson相关性分析前, 对数据集进行了正态性检验, 使用IBM SPSS Statistics 26中的Shapiro-Wilk测试以确认数据的正态分布假设. 此外, 采用Gephi 0.10.1软件绘制聚类分析图. 运用RStudio 4.2.2进行主成分分析（PCA）, 并利用美吉生信云平台完成非度量多维尺度分析（NMDS）、冗余分析（RDA）和相关性热图的制作. 使用Origin pro 2021绘制MGEs丰度的柱状图.
2 结果与分析 2.1 不同河流沉积物中MGEs空间分布特征两个月份城市和郊区河流共检出1 853种MGEs. 其中, 城市河流检出1 839种, 郊区河流检出1 438种. 城市河流中MGEs包括531种转座元件、112种整合子和1 210种插入序列；郊区河流中MGEs包括461种转座元件、48种整合子和929种插入序列. 城市河流中MGEs的种类明显多于郊区河流.
就城市河流中MGEs丰度而言（图 2）, 3条城市河流中MGEs两个月份平均丰度呈：汪洋沟（8 829 RPKM） > 洨河（7 755 RPKM） > 滹沱河（5 902 RPKM）. 所有城市样点中, WYG1两个月份平均MGEs丰度最高（9 732 RPKM）, 这可能与其附近有两座污水处理厂有关. 此外, WYG2和WYG3位于人类活动强度较高的石家庄经济开发区, 因此汪洋沟的MGEs丰度最高.
|
（a）2020年12月城市和郊区河流沉积物中MGEs丰度, （b）2021年4月城市和郊区河流沉积物中MGEs丰度；XH表示洨河, WYG表示汪洋沟, HTH表示滹沱河, HH表示郜河, CH表示磁河 图 2 城市和郊区河流沉积物中MGEs丰度 Fig. 2 MGEs abundance in urban and suburban river sediment |
就郊区河流中MGEs丰度而言（图 2）, 2条郊区河流中MGEs两个月份平均丰度呈：磁河（5 201 RPKM） > 郜河（4 628 RPKM）. 在郊区河流所有样点中, HH1两个月份平均MGEs丰度最高（6 790 RPKM）. 这可能是由于磁河上游有横山岭水库, 受到养殖业长期影响和养殖废水排放使得磁河MGEs丰度增加.
PCoA分析结果显示, PCo1轴和PCo2轴分别解释38%和24.49%的变异, 城市河流与郊区河流的样本在PCo1和PCo2轴上呈现出明显的分离趋势（图 3）, 两类河流在MGEs的空间分布上存在显著差异.
|
图 3 城市和郊区河流沉积物MGEs PCoA分析 Fig. 3 PCoA analysis of urban and suburban river sediment MGEs |
2020年12月, 共检测到1 764种MGEs. 其中, 城市河流中检出1 738种, 郊区河流中检出1 604种. 12月包括520种转座元件、108种整合子和1 136种插入序列；2021年4月, 检出的MGEs种类增至1 824种, 城市河流中检出1 790种, 郊区河流中检出1 631种, 4月包括541种转座元件、103种整合子和1 180种插入序列. 4月的河流中MGEs种类多于12月.
就MGEs的丰度而言, 12月的河流中MGEs的丰度为87 488 RPKM, 而4月增加到106 416 RPKM. 具体而言, 12月城市河流MGEs的丰度为60 572 RPKM, 郊区河流为26 916 RPKM；到了4月, 城市河流的MGEs丰度增至74 354 RPKM, 郊区河流增至32 062 RPKM. 4月河流中MGEs的丰度高于12月河流.
ANOVA分析显示12月和4月沉积物样本间的MGEs组成差异极为显著（P < 0.01, r=0.723）. 对城市和郊区河流中MGEs进行NMDS分析（图 4）, 结果表明城市和郊区河流中MGEs组成时间差异显著[图4（a）和4（d）]. 城市河流的较高stress值反映了其MGEs组成的高异质性, 这可能是由于接收多种污染物（如工业废水和生活污水）的影响, 污染物携带不同的MGEs, 增加了组成的多样性. 相比之下, 郊区河流的较低stress值显示了较为稳定的环境状态, 受到较少的工业影响和人为干扰. PCoA分析结果显示, PCo1轴和PCo2轴分别解释35%和22.49%的变异, 城市河流与郊区河流的样本在PCo1和PCo2轴上呈现出明显的分离趋势[图 4（d）], 两类河流在MGEs的时间分布上存在显著差异.
|
（a）城市和郊区河流沉积物中MGEs, （b）不同城市河流沉积物中MGEs, （c）不同郊区河流沉积物中MGEs；（d）12月和4月河流沉积物中MGEs；XH表示洨河, WYG表示汪洋沟, HTH表示滹沱河, HH表示郜河, CH表示磁河 图 4 城市和郊区河流沉积物中MGEs NMDS和PCoA分析 Fig. 4 Analysis of NMDS and PCoA in urban and suburban river sediments MGEs |
典型MGEs为在多个样本中检出频率最高的前20种. 典型MGEs不仅出现频率高, 而且许多与已知的抗性或其他生物学功能密切相关（图 5）. 就城市河流中典型MGEs空间分布而言, 3条城市河流中MGEs两个月份平均丰度呈汪洋沟（3 694 RPKM） > 洨河（3 473 RPKM） > 滹沱河（3 166 RPKM）的趋势. 在城市河流所有样点中, XH3两个月份平均MGEs丰度最高（4 384 RPKM）. HTH3两个月份平均MGEs丰度最低（2 970 RPKM）. 就具体MGEs而言, 经过ANOVA分析在滹沱河中ISPa38、IS26和tnpA显著低于其它两条城市河流（P < 0.05, r=0.626, r=0.549和r=0.511）, 在汪洋沟中ISPa38显著高于其它两条河流（P < 0.05, r=0.519）. 之前的研究发现, ISPa38、IS26和tnpA在促进抗性基因转移中均起着重要作用, 通常与人为活动密切相关, 如污水处理厂和医院排放等. MGEs在滹沱河中的低丰度, 表明该河流在抗生素抗性基因传播方面面临的风险较低. 而汪洋沟ISPa38的高丰度表明受到了较强的人为环境压力, 特别是与污水排放或工业排放相关的活动导致ARGs的积累和传播.
|
（a）12月石家庄城市河流沉积物典型MGEs相对丰度, （b）12月石家庄郊区河流沉积物典型MGEs相对丰度, （c）4月石家庄城市河流沉积物典型MGEs相对丰度, （d）4月石家庄郊区河流沉积物典型MGEs相对丰度；a1.HTH_20_1, a2.HTH_20_2, a3.HTH_20_3, a4.WYG_20_1, a5.WYG_20_2, a6.WYG_20_3, a7.XH_20_1, a8.XH_20_2, a9.XH_20_3, b1.CH_20_1, b2.CH_20_2, b3.CH_20_3, b4.HH_20_1, b5.HH_20_2, b6.HH_20_3, c1.HTH_21_1, c2.HTH_21_2, c3.HTH_21_3, c4.WYG_21_1, c5.WYG_21_2, c6.WYG_21_3, c7.XH_21_1, c8.XH_21_2, c9.XH_21_3, d1.CH_21_1, d2.CH_21_2, d3.CH_21_3, d4.HH_21_1, d5.HH_21_2, d6.HH_21_3；_20_1为20年第1个采样点, _21_1为21年第1个采样点以此类推 图 5 城市和郊区河流沉积物中典型MGEs相对丰度 Fig. 5 Relative abundance of typical MGEs in urban and suburban river sediments |
在郊区河流中, 两条河流的MGEs两个月份平均丰度呈：郜河（2 796 RPKM） > 磁河（2 468 RPKM）. 所有郊区河流样点中, HH1两个月份平均MGEs丰度最高（2 876 RPKM）而CH1的平均丰度最低（1 602 RPKM）. ANOVA分析结果显示, 郜河中DTX_Bcre_IS5_consensus-1显著高于磁河（P < 0.05, r=0.431）. PCoA分析结果显示, PCo1轴和PCo2轴分别解释51.27%和34.33%的变异, 城市河流与郊区河流的样本在PCo1和PCo2轴上呈现出明显的分离趋势（图 6）, 两类河流在典型MGEs空间分布上存在显著差异.
|
图 6 城市和郊区河流沉积物典型MGEs PCoA分析 Fig. 6 PCoA analysis of typical MGEs in urban and suburban river sediments |
在不同河流中, 12月的典型MGEs丰度为37 208 RPKM, 占总MGEs的42.52%；而到了4月, 丰度上升到56 380 RPKM, 占总MGEs的52.98%. 具体而言, 12月城市河流中典型MGEs的丰度为24 481 RPKM, 占城市河流总MGEs的40.41%；郊区河流中典型MGEs的丰度为12 727 RPKM, 占郊区河流总MGEs的47.28%. 到了4月, 城市河流中典型MGEs的丰度增至37 520 RPKM, 占城市河流总MGEs的50.46%. 而郊区河流中典型MGEs的丰度增至18 859 RPKM, 占郊区河流总MGEs的58.82%.
ANOVA分析显示12月和4月沉积物样本间的MGEs组成差异显著（P < 0.05, r=0.623）. 对不同河流中的MGEs进行NMDS分析（图 7）, 结果表明城市河流和郊区河流MGEs在时间上差异显著[图7（a）和7（d）]. 城市河流高于郊区河流stress值, PCoA分析结果显示, PCo1轴和PCo2轴分别解释51.27%和34.33%的变异, 城市河流与郊区河流的样本在PCo1和PCo2轴上呈现出明显的分离趋势[图 7（d）], 两类河流在典型MGEs时间分布上存在显著差异.
|
（a）城市和郊区河流沉积物中典型MGEs, （b）不同城市河流沉积物中典型MGEs, （c）不同郊区河流沉积物中典型MGEs；（d）12月和4月河流沉积物中典型MGEs；XH表示洨河, WYG表示汪洋沟, HTH表示滹沱河, HH表示郜河, CH表示磁河 图 7 城市和郊区河流沉积物中典型MGEs NMDS和PCoA分析 Fig. 7 NMDS and PCoA analysis of typical MGEs in urban and suburban river sediments |
为研究石家庄城市和郊区河流沉积物中抗生素对MGEs的影响, 将检出的抗生素与MGEs进行Pearson相关性分析, 结果表明QNs浓度与部分MGEs存在显著相关性[图8（a）和8（b）]. 在2020年12月城市河流中, PIP、NOR和OXO与部分MGEs呈现正相关, 抗生素的存在促进了MGEs在城市的传播. 具体而言, PIP、NOR和OXO, 与ISPa38、IS26和tnpA等展现出正相关, 而与groL和groEL呈现负相关；相比之下, 郊区河流的分析结果呈现出不同的趋势. 其中, OXO和FLU与大部分MGEs呈现负相关, 而OFL、CIP、和ENR则与MGEs呈正相关. 在人为活动更少的郊区河流环境中, 尽管大部分抗生素倾向于促进MGEs的传播, 但也存在着能够抑制某些MGEs传播的抗生素.
|
（a）12月城市河流沉积物中典型MGEs与抗生素相关性；（b）12月郊区河流沉积物中典型MGEs与抗生素相关性；红色表示正相关, 蓝色表示负相关, P≥0.05无标记, *表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 8 12月城市与郊区河流沉积物中典型MGEs与抗生素相关性分析 Fig. 8 Correlation analysis of typical MGEs and antibiotics in urban and suburban river sediments in December |
通过冗余分析（RDA）, 本研究识别了5个主要社会经济因子, 以上因子显著影响城市与郊区河流沉积物中MGEs的丰度. 分析结果揭示了社会经济活动如何不同程度地影响城市与郊区河流中MGEs的分布（图 9）. 具体来说, 城市河流中的MGEs主要受以下因素影响：汪洋沟主要受IE的影响, 滹沱河主要受LGDP、TP和AGDP的影响, 洨河则主要受Sew和TP的影响；就郊区河流而言, 磁河和郜河则主要受LGDP和AGDP的影响. RDA分析结果表明, 2020年12月社会经济因子对MGEs的总解释量为93.6%. 结果突出了城市与郊区环境中抗生素对MGEs传播影响的差异性, 以及抗生素在不同生态环境中对MGEs动态的复杂影响.
|
XH表示洨河, WYG表示汪洋沟, HTH表示滹沱河, HH表示郜河, CH表示磁河；TP表示总人口, Sew表示每年污水排放量, IE表示工业企业数量, AGDP表示水产养殖生产总值, LGDP表示畜牧业生产总值 图 9 12月河流沉积物中典型MGEs与经济因子RDA分析 Fig. 9 RDA analysis of typical MGEs and economic factors in river sediments in December |
就2021年4城市河流而言, PIP、NOR和OXO等抗生素与多数MGEs维持了与2020年12月相似的正相关[图10（a）和10（b）]. 具体而言, 以上抗生素与ISPa38、IS26和tnpA等MGEs的正相关在两个时间点上均能观察到, 它们可能在促进特定MGEs在城市环境中的传播方面起到关键作用. 此外, PIP和OXO在2021年4月展现了与更多MGEs的正相关, 同时与groL、groEL和orf403仍呈现出负相关, 揭示了抗生素与MGEs相互作用随时间的动态变化. 就郊区河流的结果而言, FLU仍然与大多数MGEs显示出负相关, 这表明FLU可能在抑制郊区河流中MGEs的传播方面发挥作用. OFL、CIP和ENR与2020年12月相比与MGEs正相关减弱. 2021年4月汪洋沟样点较2020年12月更为集中, 且不同抗生素与MGEs驱动发生变化. 就城市河流而言, 汪洋沟主要受IE的影响, 滹沱河主要受LGDP的影响, 洨河主要受Sew和TP的影响；就郊区河流而言, 磁河和浩河主要受LGDP和AGDP的影响. RDA分析结果表明2021年4月社会经济因子对MGEs的总解释量为97.85%（图 11）.
|
（a）4月城市河流沉积物中典型MGEs与抗生素相关性；（b）4月郊区河流沉积物中典型MGEs与抗生素相关性；红色表示正相关, 蓝色表示负相关, P≥0.05无标记, *表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 10 4月城市与郊区河流沉积物中典型MGEs与抗生素相关性分析 Fig. 10 Correlation analysis of typical MGEs and antibiotics in urban and suburban river sediments in April |
|
XH表示洨河, WYG表示汪洋沟, HTH表示滹沱河, HH表示郜河, CH表示磁河；TP表示总人口, Sew表示每年污水排放量, IE表示工业企业数量, AGDP表示水产养殖生产总值, LGDP表示畜牧业生产总值 图 11 4月河流沉积物中典型MGEs与经济因子RDA分析 Fig. 11 RDA analysis of typical MGEs and economic factors in river sediments in April |
为了探究QNs、TP、Sew、IE、LGDP和AGDP对MGEs的影响, 通过网络分析, 进一步分析了MGEs与以上因素的共现关系（图 12）. 在城市河流, 共现网络包括650个节点和709条边；郊区河流中为394个节点和405条边. 城市河流的共现网络模块化指数为0.689, 郊区河流为0.527. 结果显示, 在城市河流中MGEs丰度与QNs、Sew、IE、LGDP、AGDP和TP均呈显著正相关. 这说明在城市环境中, 环境和社会经济因素共同作用于MGEs的相对丰度. 相比之下, 郊区河流中MGEs丰度只与QNs、LGDP、AGDP和TP显著正相关, 表明在郊区, 抗生素浓度是影响MGEs丰度的主要因素, 其社会经济因素的影响力较城市河流更小. 因此, 不同河流中MGEs丰度的主要影响因素存在差异, 这与各自区域的特定环境条件和社会经济活动模式有关. 在城市河流中, MGEs的相对丰度不仅受沉积物中抗生素浓度的影响, 还与总人口、污水处理以及农业生产等多个社会经济因素呈显著正相关. 城市化过程中的社会经济活动在推动城市河流中MGEs的多样性和丰度方面起着关键作用；在郊区河流中, 虽然沉积物中的抗生素浓度与MGEs显著相关但其与社会经济因素的相关性相对较低, 表明郊区河流中MGEs丰度主要受抗生素的影响, 而社会经济活动对MGEs丰度影响较弱.
|
（a）城市河流沉积物MGEs共现分析, （b）郊区河流沉积物MGEs共现分析；边缘显示相邻节点间的显著正相关关系（P < 0.05, r > 0.7）, 每个节点和字体大小与显著相关性的数量成正比；QNs表示喹诺酮类抗生素, TP表示总人口, Sew表示每年污水排放量, IE表示工业企业数量, AGDP表示水产养殖生产总值, LGDP表示畜牧业生产总值 图 12 城市和郊区河流沉积物MGEs共现分析 Fig. 12 Co-occurrence analysis of MGEs in urban and suburban river sediments |
关于不同河流中MGEs分布的差异, 石家庄城市河流MGEs的丰度显著高于郊区的河流, 与先前的MGEs的研究结果保持一致[29]. 例如, 日本城郊河流的对比研究揭示了城市河流沉积物中MGEs丰度通常高于郊区河流, 河流中的MGEs丰度会随着人类活动强度的增强而上升[30]. 考虑到石家庄市的制药企业发达, 并且大量的建设用地使得人类活动强度增高, 石家庄城市河流受到制药企业及人类活动的显著影响. 通过差异性分析, 发现大部分MGEs在城市河流与郊区河流环境之间呈现显著的差异性[31]. 其中, 典型MGEs城市和郊区河流分布差异最为显著的为ISPa38、IS26和tnpA. 先前研究已经揭示了ISPa38、IS26和tnpA与多种ARGs的相关性[32 ~ 34]. 例如, IS26在革兰氏阴性菌的抗生素多重耐药性传播中起主导作用, 通过构建含有不同抗性基因的转座元件, 进行抗生素耐药基因的传播[35]. 插入序列ISPa38在基因水平上转移抗性基因起着重要作用[36]. 石家庄城市和郊区河流ISPa38、IS26和tnpA的显著差异性进一步反映人类活动对携带抗生素抗性基因MGEs的影响. 就时间而言, 石家庄城市与郊区河流沉积物中MGEs丰度展现出明显的时间性差异. 具体而言, 4月无论是城市还是郊区河流, MGEs的丰度和种类都高于12月. 这种季节性变化可能与气温、降水量和河流流量等环境因素有关. 4月较高的温度和增加的降水可能促进微生物活动, 从而加速MGEs的传播和积累. 此外, 春季农业活动的增加, 如施肥和灌溉, 可能导致更多农药和化肥流入河流, 影响MGEs的组成和丰度. 12月的低温可能抑制微生物活动, 减少MGEs的传播. 同时降水量和河流径流量减小, 限制了污染物的扩散和微生物的迁移, 从而降低了MGEs的丰度[37].
城市河流与郊区河流因其不同的功能性质, 在污染物接收和MGEs传播方面表现出显著差异. 由于城市河流直接接收来自工业、市政以及生活的复合污水而与人类活动的联系更为密切[38]. 这种多样性的污染物提供了丰富的营养, 助力微生物生长, 从而加速了MGEs在河流中的传播和积累. 因此, 城市河流的MGEs通常种类繁多且丰度较高. 以石家庄的3条城市河流为例, 汪洋沟和洨河中的MGEs展现出较高的复杂性. 汪洋沟主要承载工业废水, 其水体接受了污水处理设施处理后的综合废水. 洨河则主要收集城市生活污水, 滹沱河受人类活动影响最小. 因此, 在城市河流中MGEs的丰度在汪洋沟、洨河和滹沱河中依次递减. 相较于城市河流, 郊区河流主要受畜牧养殖、水产养殖和农业活动的影响. 以上活动释放的废水可能会直接或间接流入河流系统, 进而对河流中的MGEs的种类和分布造成显著影响. 例如, 位于磁河附近的横山岭水库因长期接受养殖业废水, 未经处理的养殖废水被排放至磁河, 使得磁河中的MGEs丰度高于郜河. 此外, 不同河流的MGEs分布还受到自然条件和地理位置的影响, 不同地区的主导产业差异可能导致区域间MGEs组成的差异. 以上差异在一定程度上反映了城市和郊区河流MGEs对不同污染源的响应特性.
3.2 不同河流中MGEs的时空分布特征及其主要影响因素河流中MGEs的传播受到多重因素的影响, 涵盖自然环境条件、人类活动及社会经济. 例如, 在潮白河发现温度、重金属、营养物、抗生素都会促使细菌激活非特异性免疫反应. 这种反应不仅提高了细菌的耐药性, 而且还加速了MGEs在该环境中的扩散[39]. 在西班牙特尔河的污水处理厂进行的研究发现, 处理厂下游MGEs的丰度远高于上游, 尤其是整合子、整合酶和插入序列[40]. 珠江三角洲地区人口密集的区域以及珠江口质粒（0.33 copies, 以cell计）和整合子（0.21 copies, 以cell计）的丰度最高, 进一步证实了人类活动对水平基因转移的促进作用[41]. 在本研究中, 由于城市区域人口密度较大且拥有更多的工业废水处理设施, 使得城市河流中的水平基因转移活动更加频繁, 城市河流的MGEs受到环境因素、人类活动和社会经济因素的共同影响. 而郊区河流则主要受环境因素的影响. 在时间维度上, 城市和郊区河流中MGEs的丰度和种类在4月均高于12月, 表现出明显的季节性差异. 之前已有研究表明MGEs丰度的季节变化与地表径流表现出相似的趋势[42]. 季节性径流可能增加MGEs的丰度, 造成4月MGEs的丰度和种类要高于12月. 就人类活动和社会经济因素而言, 郊区区域的MGEs传播则主要受到畜牧业和水产养殖的影响.
石家庄作为一个制药业发达的城市, 其制药企业所排放的废水含有高浓度的抗生素, 这显著影响了水体中MGEs的活性, 加速了MGEs的形成和扩散[43]. 例如, 在海河流域, 磺胺类抗生素的浓度与MGEs的丰度呈现正相关[44]. 同样, 苏州城市垃圾填埋场渗滤液中MGEs与氟喹诺酮类抗生素浓度显著正相关[45]. 就石家庄城市和郊区河流MGEs与喹诺酮类抗生素相关性进行分析, 结果显示为正负相关的复杂模式. 特定抗生素（如OXO和FLU等）在不同时间点和河流沉积物对不同MGEs表现出不同的相关性, 这可能与微生物对抗生素压力的适应性响应有关. 到目前为止, 不同研究中抗生素与MGEs间的相关性尚未达成一致的结论. 在石家庄郊区, 由于污水处理设施相对落后, 养殖业未经处理的废水中常含有重金属等有害物质. 此外, 由农用薄膜残留导致郊区环境中微塑料污染对MGEs的产生和传播产生了影响. 已有研究表明重金属与MGEs呈显著正相关[46]. 例如, 在德兴铜矿区沉积物中, 铜含量与MGEs的种类和丰度之间存在显著的正相关[47]. 同样, 在九龙江河口的研究发现微塑料促进MGEs的传播[48]. 因此, 河流中MGEs的主要影响因素具有明显的空间性差异.
4 结论（1）河流类别不同, 其受人类活动的影响程度也有所区别, 导致城市与郊区河流沉积物中MGEs的丰度存在显著的空间分布差异：城市河流沉积物中MGEs丰度呈汪洋沟 > 洨河 > 滹沱河的趋势；郊区河流沉积物中MGEs丰度呈磁河 > 郜河的趋势.
（2）在时间变化上, 城市与郊区河流沉积物中MGEs的种类和丰度呈现出明显的季节性变化, MGEs丰度呈现4月> 12月的趋势.
（3）在石家庄城市与郊区河流中, ISPa38、IS26和tnpA作为典型MGEs显示出明显的差异. 不同河流中的分布差异突显了它们在抗性基因传播中的潜在作用. 特别是在城市河流中, ISPa38、IS26和tnpA的高丰度与更频繁的人类活动和工业排放相关.
（4）城市河流中MGEs的种类和丰度主要受抗生素浓度和多种社会经济因素的共同影响, 而郊区河流中MGEs种类和丰度则主要受抗生素浓度影响.
| [1] | Van Boeckel T P, Brower C, Gilbert M, et al. Global trends in antimicrobial use in food animals[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(18): 5649-5654. |
| [2] | He Y J, Nurul S, Schmitt H, et al. Evaluation of attenuation of pharmaceuticals, toxic potency, and antibiotic resistance genes in constructed wetlands treating wastewater effluents[J]. Science of the Total Environment, 2018, 631-632: 1572-1581. DOI:10.1016/j.scitotenv.2018.03.083 |
| [3] | Zhang Q Q, Ying G G, Pan C G, et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China: source analysis, multimedia modeling, and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(11): 6772-6782. |
| [4] | Mirzaei R, Yunesian M, Nasseri S, et al. Occurrence and fate of most prescribed antibiotics in different water environments of Tehran, Iran[J]. Science of the Total Environment, 2018, 619-620: 446-459. DOI:10.1016/j.scitotenv.2017.07.272 |
| [5] | Dinh Q T, Alliot F, Moreau-Guigon E, et al. Measurement of trace levels of antibiotics in river water using on-line enrichment and triple-quadrupole LC–MS/MS[J]. Talanta, 2011, 85(3): 1238-1245. DOI:10.1016/j.talanta.2011.05.013 |
| [6] | Bilal M, Ashraf S S, Barceló D, et al. Biocatalytic degradation/redefining "removal" fate of pharmaceutically active compounds and antibiotics in the aquatic environment[J]. Science of the Total Environment, 2019, 691: 1190-1211. DOI:10.1016/j.scitotenv.2019.07.224 |
| [7] | Boxall A B A, Rudd M A, Brooks B W, et al. Pharmaceuticals and personal care products in the environment: what are the big questions?[J]. Environmental Health Perspectives, 2012, 120(9): 1221-1229. DOI:10.1289/ehp.1104477 |
| [8] | Wang Z L, Cai M, Du P, et al. Wastewater surveillance for antibiotics and resistance genes in a river catchment: spatiotemporal variations and the main drivers[J]. Water Research, 2024, 251. DOI:10.1016/j.watres.2023.121090 |
| [9] | Partridge S R, Kwong S M, Firth N, et al. Mobile genetic elements associated with antimicrobial resistance[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2018, 31(4). DOI:10.1128/CMR.00088-17 |
| [10] | Tokuda M, Shintani M. Microbial evolution through horizontal gene transfer by mobile genetic elements[J]. Microbial Biotechnology, 2024, 17(1). DOI:10.1111/1751-7915.14408 |
| [11] | Haudiquet M, de Sousa J M, Touchon M, et al. Selfish, promiscuous and sometimes useful: how mobile genetic elements drive horizontal gene transfer in microbial populations[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2022, 377(1861). DOI:10.1098/rstb.2021.0234 |
| [12] | Shao S C, Hu Y Y, Cheng J H, et al. Research progress on distribution, migration, transformation of antibiotics and antibiotic resistance genes (ARGs) in aquatic environment[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2018, 38(8): 1195-1208. DOI:10.1080/07388551.2018.1471038 |
| [13] | Zhang Q Q, Tian G M, Jin R C. The occurrence, maintenance, and proliferation of antibiotic resistance genes (ARGs) in the environment: influencing factors, mechanisms, and elimination strategies[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, 102(19): 8261-8274. DOI:10.1007/s00253-018-9235-7 |
| [14] | Ma L P, Li B, Zhang T. Abundant rifampin resistance genes and significant correlations of antibiotic resistance genes and plasmids in various environments revealed by metagenomic analysis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(11): 5195-5204. DOI:10.1007/s00253-014-5511-3 |
| [15] |
黄福义, 周曙仡聃, 潘婷, 等. 基于高通量定量PCR与高通量测序技术研究城市湿地公园抗生素抗性基因污染特征[J]. 环境科学, 2024, 45(1): 576-583. Huang F Y, Zhou S Y D, Pan T, et al. High-throughput qPCR and amplicon sequencing as complementary methods for profiling antibiotic resistance genes in urban wetland parks[J]. Environmental Science, 2024, 45(1): 576-583. |
| [16] |
陈瑞, 程建华, 唐翔宇. 高垦殖丘陵区不同类型农用地土壤中抗生素抗性基因分布特征[J]. 环境科学, 2023, 44(12): 6947-6954. Chen R, Cheng J H, Tang X Y. Characteristics of antibiotic resistance genes distribution in different types of agricultural land soils in highly cultivated hilly areas[J]. Environmental Science, 2023, 44(12): 6947-6954. |
| [17] | Chen H Y, Bai X M, Jing L J, et al. Characterization of antibiotic resistance genes in the sediments of an urban river revealed by comparative metagenomics analysis[J]. Science of the Total Environment, 2019, 653: 1513-1521. |
| [18] | Zhao Z, Li C C, Jiang L Y, et al. Occurrence and distribution of antibiotic resistant bacteria and genes in the Fuhe urban river and its driving mechanism[J]. Science of the Total Environment, 2022, 825. DOI:10.1016/j.scitotenv.2022.153950 |
| [19] | Das B K, Behera B K, Chakraborty H J, et al. Metagenomic study focusing on antibiotic resistance genes from the sediments of River Yamuna[J]. Gene, 2020, 758. DOI:10.1016/j.gene.2020.144951 |
| [20] | Wang Z, Han M Z, Li E H, et al. Distribution of antibiotic resistance genes in an agriculturally disturbed lake in China: their links with microbial communities, antibiotics, and water quality[J]. Journal of Hazardous Materials, 2020, 393. DOI:10.1016/j.jhazmat.2020.122426 |
| [21] | Feng G Q, Huang H N, Chen Y G. Effects of emerging pollutants on the occurrence and transfer of antibiotic resistance genes: a review[J]. Journal of Hazardous Materials, 2021, 420. DOI:10.1016/j.jhazmat.2021.126602 |
| [22] | Luo T Y, Dai X H, Wei W, et al. Microplastics enhance the prevalence of antibiotic resistance genes in anaerobic sludge digestion by enriching antibiotic-resistant bacteria in surface biofilm and facilitating the vertical and horizontal gene transfer[J]. Environmental Science & Technology, 2023, 57(39): 14611-14621. |
| [23] | Jiang C X, Zhao Z L, Grossart H P, et al. Health risk ranking of antibiotic resistance genes in the Yangtze River[J]. Environmental Science and Ecotechnology, 2024, 21. DOI:10.1016/j.ese.2024.100388 |
| [24] |
剧泽佳, 付雨, 赵鑫宇, 等. 喹诺酮类抗生素在城市典型水环境中的分配系数及其主要环境影响因子[J]. 环境科学, 2022, 43(9): 4543-4555. Ju Z J, Fu Y, Zhao X Y, et al. Distribution coefficient of QNs in urban Typical water and its main environmental Influencing factors[J]. Environmental Science, 2022, 43(9): 4543-4555. |
| [25] |
剧泽佳, 赵鑫宇, 陈慧, 等. 石家庄市水环境中喹诺酮类抗生素的空间分布特征与环境风险评估[J]. 环境科学学报, 2021, 41(12): 4919-4931. Ju Z J, Zhao X Y, Chen H, et al. The characteristics of spatial distribution and environmental risk assessment for quinolones antibiotics in the aquatic environment of Shijiazhuang City[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2021, 41(12): 4919-4931. |
| [26] |
高银珍. 石家庄市生物医药产业集群竞争力评价与提升研究[D]. 石家庄: 河北科技大学, 2018. Gao Y Z. Research on evaluation and promotion of the cluster competitiveness of bio-medicine industry in Shijiazhuang[D]. Shijiazhuang: Hebei University of Science and Technology, 2018. |
| [27] | Fu H, Li X B, Wang J, et al. Activated carbon adsorption of quinolone antibiotics in water: performance, mechanism, and modeling[J]. Journal of Environmental Sciences, 2017, 56: 145-152. |
| [28] |
申立娜, 张璐璐, 秦珊, 等. 白洋淀喹诺酮类抗生素与微生物群落结构和多样性相关性研究[J]. 环境科学学报, 2020, 40(2): 574-584. Shen L N, Zhang L L, Qin S, et al. The correlation between quinolone antibiotics and microbial community structure and diversity in Baiyangdian Lake[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2020, 40(2): 574-584. |
| [29] | Zhao Z, Zhang Y, Liu R, et al. Antibiotic resistance genes in constructed wetlands: Driving indicators and risk assessment[J]. Journal of Hazardous Materials, 2023, 459: 1-14. |
| [30] | Ma C Y, Sugie Y, Yu Z Z, et al. Occurrence of E. coli and antibiotic-resistant E. coli in the southern watershed of Lake Biwa, including in wastewater treatment plant effluent and inflow rivers[J]. Chemosphere, 2022, 301. DOI:10.1016/j.chemosphere.2022.134372 |
| [31] | Zhang L L, Chen H D, Gao S, et al. Antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in different rivers: the link with antibiotics, microbial communities, and human activities[J]. Science of the Total Environment, 2024, 919. DOI:10.1016/j.scitotenv.2024.170788 |
| [32] | Cuypers W L, Meysman P, Weill F X, et al. A global genomic analysis of Salmonella concord reveals lineages with high antimicrobial resistance in Ethiopia[J]. Nature Communications, 2023, 14(1). DOI:10.1038/s41467-023-38902-x |
| [33] | Varani A, He S S, Siguier P, et al. The IS6 family, a clinically important group of insertion sequences including IS26[J]. Mobile DNA, 2021, 12(1). DOI:10.1186/s13100-021-00239-x |
| [34] | Meers C, Le H C, Pesari S R, et al. Transposon-encoded nucleases use guide RNAs to promote their selfish spread[J]. Nature, 2023, 622(7984): 863-871. |
| [35] | Harmer C J, Hall R M. IS26-mediated formation of transposons carrying antibiotic resistance genes[J]. mSphere, 2016, 1(2). DOI:10.1128/mSphere.00038-16 |
| [36] | Shankar C, Mathur P, Venkatesan M, et al. Rapidly disseminating blaOXA-232 carrying Klebsiella pneumoniae belonging to ST231 in India: multiple and varied mobile genetic elements[J]. BMC Microbiology, 2019, 19(1). DOI:10.1186/s12866-019-1513-8 |
| [37] | Chen Y H, Su J Q, Zhang J Y, et al. High-throughput profiling of antibiotic resistance gene dynamic in a drinking water river-reservoir system[J]. Water Research, 2019, 149: 179-189. |
| [38] | Sun J Y, Yuan Y M, Cai L S, et al. Metagenomic evidence for antibiotics-driven co-evolution of microbial community, resistome and mobilome in hospital sewage[J]. Environmental Pollution, 2023, 327. DOI:10.1016/j.envpol.2023.121539 |
| [39] | Wu Y, Qi D Q, Yao H, et al. Antibiotic resistome and its driving factors in an urban river in Northern China[J]. Science of the Total Environment, 2022, 838. DOI:10.1016/j.scitotenv.2022.156536 |
| [40] | Lekunberri I, Balcázar J L, Borrego C M. Metagenomic exploration reveals a marked change in the river resistome and mobilome after treated wastewater discharges[J]. Environmental Pollution, 2018, 234: 538-542. |
| [41] | Li W J, Su H C, Cao Y C, et al. Antibiotic resistance genes and bacterial community dynamics in the seawater environment of Dapeng Cove, South China[J]. Science of The Total Environment, 2020, 723. DOI:10.1016/j.scitotenv.2020.138027 |
| [42] | Wang J H, Lu J, Wu J, et al. Seasonal distribution of antibiotic resistance genes under the influence of land-ocean interaction in a semi-enclosed bay[J]. Chemosphere, 2022, 301. DOI:10.1016/j.chemosphere.2022.134718 |
| [43] | Hu Y P, Wei J J, Yuan Y Z, et al. Intervention effects of fructooligosaccharide and astragalus polysaccharide, as typical antibiotic alternatives, on antibiotic resistance genes in feces of layer breeding: advantages and defects[J]. Journal of Hazardous Materials, 2024, 465. DOI:10.1016/j.jhazmat.2023.133172 |
| [44] | Luo Y, Mao D Q, Rysz M, et al. Trends in antibiotic resistance genes occurrence in the Haihe River, China[J]. Environmental Science & Technology, 2010, 44(19): 7220-7225. |
| [45] | You X X, Wu D, Wei H W, et al. Fluoroquinolones and β-lactam antibiotics and antibiotic resistance genes in autumn leachates of seven major municipal solid waste landfills in China[J]. Environment International, 2018, 113: 162-169. |
| [46] | Zhang R R, Gu J, Wang X J, et al. Antibiotic resistance gene transfer during anaerobic digestion with added copper: important roles of mobile genetic elements[J]. Science of the Total Environment, 2020, 743. DOI:10.1016/j.scitotenv.2020.140759 |
| [47] | Jiang X W, Liu W H, Xu H, et al. Characterizations of heavy metal contamination, microbial community, and resistance genes in a tailing of the largest copper mine in China[J]. Environmental Pollution, 2021, 280. DOI:10.1016/j.envpol.2021.116947 |
| [48] |
程宏, 陈荣. 九龙江口微塑料与抗生素抗性基因污染的分布特征[J]. 环境科学, 2022, 43(11): 4924-4930. Cheng H, Chen R. Distribution of microplastic and antibiotic resistance gene pollution in Jiulong River estuary[J]. Environmental Science, 2022, 43(11): 4924-4930. |