2025, Vol. 46
2. 北京林业大学水土保持学院, 北京 100083;
3. 北京林业大学云南建水荒漠生态系统国家定位观测研究站, 北京 100083;
4. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085
, LONG Jie1 , YANG Tao1,3 , PENG Xia-wei1,3
, LI Yong-shuang1 , WAN Long2,3 , WU Xiu-qin2,3 , BAI Zhi-hui4
2. College of Soil and Water Conservation, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China;
3. National Location Observation Research Station of Jianshui Desert Ecosystem in Yunnan, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China;
4. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
畜禽粪便作为可回收利用有机废弃物资源, 含有丰富的氮（N）、磷（P）和钾（K）等营养物质, 可作为土壤有机肥施用, 提高农业生产.此外, 在农业系统中施用有机肥可以减轻微生物资源限制并改善土壤聚集, 从而促进土壤碳积累[1].然而, 中国畜禽粪便的利用率不到60%, 造成了严重的养分流失和环境污染问题[2, 3].目前, 人们普遍认识到有机废物的不当利用会增加温室气体（如CH4和N2O）的排放, 这不仅会加剧全球温室效应, 还会通过降低有机废物的资源再利用率而降低农业生态系统的生产力[4].因此, 有必要倡导研究更有效的技术来促进废物管理和资源利用.
芽孢杆菌具有较好的纤维素酶分泌功能、耐热性和良好的环境适应性, 在好氧有机堆肥过程表现出良好的性能[5].然而, 接种微生物菌剂, 如芽孢杆菌, 往往不能达到预期效果[6, 7], 因为不同的环境因素和本地细菌群落的稳定性会影响外来微生物的代谢活动[8].因此, 已有研究探究了接种芽孢杆菌对堆肥效率的影响, 并与Fenton预处理和竹制生物炭施用等技术相结合[9, 10], 为推动芽孢杆菌接种效率提供技术支撑.纳米膜的核心是膨胀聚四氟乙烯膜（e-PTFE）, 夹在两层固体聚酯膜之间.e-PTFE薄膜经膨胀拉伸后可形成150~350 nm孔径, 可保证充足的供氧, 阻断粉尘、气溶胶和病原微生物向外扩散.因此, 纳米膜覆盖为堆肥系统提供了恒定的小气候（例如, 温度、氧气和湿度）, 从而为刺激与降解相关的微生物活动提供了有利条件[11, 12].目前, 人们一直在研究纳米膜覆盖相关的堆肥系统, 以改善堆肥过程, 减少污染, 提高资源再利用率.有学者报道, 纳米膜覆盖在堆肥过程中分别减少了7.34%和26.27%的NH3和N2O排放[13].虽然, 有研究探究了堆肥质量对纳米膜覆盖的响应, 但很少有学者探究纳米膜覆盖对微生物群落及其代谢活性的影响, 而微生物代谢活动和结构是驱动有机废物降解的引擎, 特别是在添加芽孢杆菌的情况下[14].
微生物通过胞外酶的分泌在好氧堆肥体系的物质转化过程中发挥作用, 加速复杂底物降解为生物可利用资源, 提高堆温可有效杀死致病菌[15, 16].先前的研究表明, 微生物群落的演替可以有效预测堆体腐熟和病原体消除[12].因此, 破译微生物群落与代谢能力对于提高畜禽粪便堆肥效率至关重要.堆肥材料配比、堆肥方法和堆肥条件对微生物群落组成有不同程度的影响.目前, 越来越多的研究表明微生物相互作用对生态系统功能起着关键作用[17].具体而言, 一些微生物类群, 特别是数量丰富且无处不在的核心类群, 集中在特定生态集群中, 对维持微生物生态功能至关重要[18].然而, 对微生物的研究主要集中在微生物代谢活动和群落结构的演替, 关于微生物的相互作用在好氧堆肥过程中的作用研究仍然有限[19, 20].因此, 本研究以鸡粪、玉米芯、香菇渣和稻壳为原料, 进行了为期24 d的大规模好氧堆肥实验, 通过设置槽式好氧堆肥发酵实验, 共设置对照（CK）、单独接种芽孢杆菌（CB）、纳米膜覆盖（CM）以及纳米膜覆盖联合芽孢杆菌接种（BM）这4个好氧堆肥处理组, 探讨了纳米膜覆盖和芽孢杆菌接种对好氧堆肥（理化性质、细菌群落及其物质代谢活力）的影响, 并通过冗余分析与细菌生态网络分析了微生物细菌群落对好氧堆肥体系中微生物代谢活力的影响, 以期为今后微生物菌剂联合纳米膜强化高温好氧堆肥技术的应用提供理论支撑.
1 材料与方法 1.1 实验设计好氧堆肥的主料为鸡粪, 辅料为蘑菇渣、玉米芯和稻壳.将主料鸡粪和3种辅料按照鲜重比为2∶1的配比进行混匀, 其中菇渣、玉米芯和稻壳的鲜重比为2∶3∶3.微生物接种剂（购自江苏某生物科技有限公司）主要由杆菌科的枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成.采用固体接种剂, 有效活菌数 > 2 ×109 CFU·g-1.本实验使用的功能膜为国内研制的半透膜.按发酵物料鲜重比3‰添加微生物剂, 在发酵物料中均匀混合.本实验设空白对照组（CK）、仅接种菌处理组（CB）、覆盖膜处理组（CM）和接种菌加膜处理组（BM）这4个处理[14].在堆肥过程的第1、3、6、9、12、16、20和24 d分别从每个反应器收集顶层、中层和底层的堆肥样品.样品从每个反应器的顶部、中部和底部取下, 并充分混合.每个样品被放置在一个灭菌的聚乙烯袋中.样品分为两部分：一部分保存在4℃的冰箱中, 测定堆体的理化性质和酶活性, 另一部分冷冻在-80℃进行DNA提取.
1.2 实验方法 1.2.1 理化性质和酶活性的测定在堆肥过程中, 分别于08：00、14：00和20：00监测各堆肥处理的内部和外部温度.新鲜的堆肥样品和去离子水以1∶10（土水比）的比例混合, 在25℃, 150 r·min-1条件下振荡2 h, 取振荡液在4 000 r·min-1离心机中离心15 min, 得到上清液, 用pH计（PHS⁃25）测定pH, 用电导率仪（RMD-ISEC2）测定电导率（electric conductivity, EC）.有机质（organic matter, OM）的测定采用灼烧减量法[21]. 铵态氮（NH4+-N）、硝态氮NO3--N）和亚硝态氮（NO2--N）测定：准确称取堆肥样品2 g, 以1∶10（土水比）的比例加入2 mol·L-1 KCl溶液中进行浸提, 混合振荡2 h后用0.45µm的滤膜过滤浸提液, 所得滤液用AA3型连续流动分析仪测定.种子萌发指数（GI）的测定参考López-González等[22].脲酶活性（urease）和蛋白酶活性（protease）的测定分别采用靛酚蓝比色和改良茚三酮比色法[23].木聚糖酶活性（xylanase）和纤维素酶活性（cellulase）测定参考文献[24].
1.2.2 DNA提取、扩增和测序根据反应器温度的变化, 分别在升温期（HP）、高温期（TP）、冷却期（CP）和成熟期（MP）的第1 d、第9 d、第16 d和第24 d取样.将4个阶段的堆肥样品充分混合, 冷冻干燥.采用DNA提取试剂盒（DP336；天元生物科技, 北京, 中国）按照制造商提供的说明.采用NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific）检测DNA浓度, 确保提取DNA的质量.用以下引物扩增细菌16S rRNA基因：338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGC AGA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）, 靶向V3-V4区.PCR扩增在50.0 µL反应体系中进行, 反应体系中含有0.5 µL Taq DNA聚合酶、5 µL 10 × PCR缓冲液、4 µL dNTP混合物、1µL正向引物（10 µm）、1 µL反向引物（10 µm）、1µL模板DNA和37.5 µL蒸馏水.细菌16S rRNA基因PCR热循环谱为：95℃下5 min, 95℃下45 s, 55℃下50 s, 72℃下45 s, 28个循环, 最后72℃下延长10 min, PCR扩增产物用2.0%的琼脂糖进行电泳验证.纯化的扩增子产物在Illumina MiSeq PE300平台上进行高通量测序[25].
1.2.3 数据及统计分析细菌α多样性指数计算采用Mothur（版本v1.30.1）, 包括Chao1和Shannon.基于计算的Bray-curtis距离, 采用非度量多维尺度分析（NMDS）细菌群落的β多样性.利用Majorbio I-Sanger云平台免费在线平台上的PERMANOVA分析不同处理间细菌群落差异. RDA采用Canoco（Version 5.0）软件进行.本研究使用Z-score转换对4种酶的活性进行标准化, 获取一个简单且可解释的衡量一个群落同时维持多种功能的综合指标.基于igraph包构建无向的细菌类群的元网络（|r| > 0.65和P < 0.001）, 并通过“Speraman”法分析关键细菌集群与Z-score相关性.
2 结果与讨论 2.1 堆肥过程中腐熟指标的动态变化堆体温度是评价堆肥质量的重要指标.如图 1（a）所示, 4个处理的温度变化趋势相似, CK、CB、CM和BM组堆体最高温度分别为68.1、68.2、77.4和81.6℃, 接近峰值温度后所有处理的温度都略有下降.CK、CB、CM和BM的平均温度分别为55.63、55.02、64.95和65.68℃.BM组堆体最高可能是由于微生物的代谢活力强, OM的高效降解过程中释放出更多的热量[26, 27].同时, BM中0~9 d阶段OM的含量比其他处理迅速下降, 所有处理组中堆体OM的含量在9d后缓慢下降[图 1（b）].以上结果表明, 纳米膜覆盖联合芽孢杆菌的施用可以促进微生物的代谢活性, 促进堆肥初期OM的降解并释放更多的热量[28].此外, 研究表明在纳米膜覆盖下, 接种芽孢杆菌对温度的影响更为明显, 表明是纳米膜覆盖提高了好氧堆肥体系中芽孢杆菌活性.
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图 1 堆肥过程中温度、电导率（EC）、萌发指数（GI）、有机质（OM）和pH值的变化 Fig. 1 Changes in temperature, electrical conductivity(EC), germination index(GI), organic matter(OM), and pH value during composting |
每个处理组的最终EC值分别为1.56、1.19、2.23和3.14 mS·cm-1 [图 1（c）], 这表明所有处理都可以应用于后续的农业生产[29].堆肥结束时, BM的GI值（100.04%）明显高于其他处理（CK、CB和CM分别为89.60%、93.20%和96.80%）, 这可能是由于BM中病原菌丰度较低, 营养物质有效性较高[图 1（d）].如图 1（e）所示, CM和BM的pH值在第12 d之前急剧下降.这一结果可能与纳米膜覆盖下OM的降解率提高有关, 从而改善了有机氮的矿化过程, 减少了NH3的排放, 从而在堆肥堆中固存了更多的NH4+-N.此后, CM和BM的pH值不断升高, 最终值分别为7.92和7.97, 这可能是由于更多的NH4+-N通过硝化作用不断转化为NO3-所致.而CB的pH值在第12d之前基本保持稳定状态, 之后略有下降.
2.2 堆肥过程中酶活性和养分的动态变化酶活性是影响堆肥过程和反映特定微生物功能的重要指标[30, 31].为了进一步阐明纳米膜覆盖与芽孢杆菌接种对堆肥质量的促进作用, 图 2显示了不同处理下堆肥过程中代表性酶活性的变化.在堆肥的初始阶段（HP）, BM组纤维素酶和木聚糖酶的活性高于其他处理, 活性分别在TP和CP阶段达到峰值[图2（a）和2（b）].纤维素酶和木聚糖酶活性变化与堆体中OM变化相一致[图 1（b）], 表明覆盖纳米膜可以快速增加高分子碳水化合物的降解.芽孢杆菌表现出较好的纤维素酶分泌功能[32].本研究中, 在接种芽孢杆菌后, CM中纤维素酶和木聚糖酶活性的变化大于CK, 这可能是由于覆盖纳米膜为芽孢杆菌提供了适宜的生长条件, 从而提高了芽孢杆菌的接种效率与活性[33].蛋白酶和脲酶对含氮有机物的转化至关重要, 与堆肥系统中的N循环密切相关[34]. 4个处理组的蛋白酶和脲酶活性在TP阶段达到最大值, 之后均略有下降[图2（c）和2（d）].芽孢杆菌的添加对脲酶和蛋白酶的活性没有影响, 但在覆盖纳米膜下施用芽孢杆菌可以促进脲酶和蛋白酶的活性.综上所述, 覆盖纳米膜联合芽孢杆菌接种促进好氧堆肥体系中微生物胞外酶活性, 从而促进了好氧堆肥中有机氮和高分子碳水化合物的周转[35].
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图 2 不同处理堆肥过程中酶活性变化 Fig. 2 Changes in enzyme activities under different treatments during composting |
与对照相比, 在纳米膜覆盖下, 堆体前3 d的NH4+-N对芽孢杆菌添加的响应变化更为明显[图 3（a）].BM中较高的NH4+-N浓度表明纳米膜覆盖与接种芽孢杆菌对促进可持续堆肥有显著的交互作用.堆肥3 d后, 所有处理的NO2--N浓度都显著提高, 这可能是硝化作用的结果[图 3（b）].纳米膜覆盖下（CM和BM）NO2--N浓度在第6 d达到峰值, 之后逐渐下降, 而CK和CB在第9 d达到最峰值.第6 d之前, 不同纳米膜膜覆盖处理间NO2--N浓度变化较小.上述结果表明, 添加芽孢杆菌处理对纳米膜覆盖下NH4+-N向NO2--N的转化影响不明显. BM中NO2--N浓度明显低于其他处理, 但NO3--N浓度高于其他处理这可能与反硝化细菌活性受到抑制有关[图 3（c）].
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图 3 堆肥过程中NO2-、NH4+和NO3-含量的变化 Fig. 3 Changes in NO2-, NH4+, and NO3- during composting |
鉴于微生物多样性对代谢功能的重要影响[36], 本研究采用Shannon指数和Chao1指数分别分析纳米膜覆盖与接种芽孢杆菌对细菌群落多样性和丰富度的影响[37].芽孢杆菌的添加对细菌群落丰富度和多样性无显著影响[P=0.09, P=0.66, 图 4（a）].纳米膜覆盖显著提高了Chao1（P < 0.05）, 这可能主要是由于OM的降解更彻底, 提高了细菌养分的可利用性.基于Bray-curtis距离的NMDS显示, 不同阶段的堆肥样品形成了不同的簇.此外, 本研究观察到不同处理之间细菌群落差异显著[R=0.41, P < 0.001, 图 4（a）].
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（a）不同堆肥处理细菌α多样性指数, （b）不同堆肥处理发酵过程中细菌β多样性变化不同堆肥处理发酵过程中细菌群落组成在门水平上的变化, （c）不同堆肥处理发酵过程中细菌群落组成在门水平上的变化, （d）不同堆肥处理发酵过程中细菌群落组成在科水平上的变化；（b）应力值=0.13, 发酵时间：R=0.51, P < 0.001, 纳米膜覆盖×菌剂施用：R=0.41, P < 0.001 图 4 不同堆肥处理下细菌群落多样性与组成的变化 Fig. 4 Changes of bacterial community diversity and composition under different composting treatments |
4个好氧堆肥组的前10个细菌门相对丰度如图 4（c）所示.4种处理的优势菌门分别为Firmicutes（72.24%）、Actinobacteria（19.91%）、Chloroflexi（3.05%）和Proteobacteria（2.04%）.在HP时期, BM组的Firmicutes相对丰度（96.95%）高于其他处理（CM：77.32%, CB：70.86%, CK：72.98%）.然而, Firmicutes的丰度在TP期间在BM和CM中下降, 尤其是在BM中（87.05%）.这一结果可能是由于Firmicutes快速降解HP中的顽固性OM, 释放出更容易获得的单分子物质, 以上物质支持其他细菌分类群生长与繁殖（如Actinobacteria和Proteobacteria）.因此, 在HP中, BM的放线菌丰度高于其他3种处理.已发现Actinobacteria分泌多种抗生素抑制病原菌生长[38, 39], 表明纳米膜覆盖与接种芽孢杆菌可有效杀灭病原菌, 提高堆肥产品安全性.
在科水平上细菌群落组成的演变如图 4（d）所示. 4个处理组的优势科分别为Bacillaceae（2.89%~62.17%）、Thermoactinomycetaceae（7.67%~41.74%）、Nocardiopsaceae（0.16%~26.63%）和Limnochordaceae（0.93%~17.75%）.Bacillaceae因较强耐热性和良好的环境适应性, 在有机氮的分解中起着关键作用, 在堆肥过程中普遍存在[40, 41].在堆肥中后期（TP、CP和MP）, Bacillacea在CM和BM中相对丰度较高, 表明覆盖纳米膜加速了N相关物质的转化.Micromonosporaceae、Pseudonocardiaceae和Staphylococcaceae科的多数微生物类群属病原菌, 如Streptomonospora、Moraxella和Staphylococcus[13, 42], 在CK和CB组中相对丰度较高, 研究结果表明纳米膜覆盖能有效杀灭致病菌.
2.3.2 细菌群落结构与堆体理化性质和酶活性的相关性分析冗余分析结果表明, 所选解释变量在前2个坐标轴上对HP、TP、CP和MP科水平细菌群落组成变异的贡献率分别为84.77%、83.47%、87.40%和90.75%.在HP阶段, 堆体NH4+-N、NO2--N和NO3--N以及pH是解释细菌群落组成的最重要因素[图 5（a）].Nocardiopsaceae是一种通过硝化作用将NH4+-N转化为NO2--N的亚硝酸盐菌群, 与NH4+-N呈负相关关系, 与NO2--N呈正相关关系.如图 5（c）所示, 在CP时期, Nocardiopsaceae与堆体中NH4+-N、NO2--N和NO3--N的关系较弱.结合堆肥过程中N组分的变化趋势（图 3）, 可知Nocardiopsaceae在HP阶段活性更高, 有利于N的转化[41, 42].在TP阶段, 细菌群落组成的变化主要由纤维素酶和脲酶来解释[图 5（b）].此外, 本研究发现Bacillaceae与纤维素酶和脲酶有较强的正相关关系.值得注意的是, BM中杆菌科的丰度高于CB[图 4（d）], 说明纳米膜覆盖极大地改善了Bacillaceae生长的微环境, 从而提高了接种芽孢杆菌的TP的活性.此外, 本研究只发现芽胞杆菌科与温度呈正相关, 这可能与纤维素酶参与有机废物降解过程中释放的热量有关[43].
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红色箭头表示不同细菌类群（科水平）, 黑色箭头表示土壤酶活和理化性质 图 5 好氧堆肥过程中细菌群落组成与酶活性和理化性质冗余分析 Fig. 5 Redundancy analysis of bacterial community composition and enzyme activity and physicochemical properties during aerobic composting |
为了更好地了解堆肥过程中细菌与物质转化（Z-score）之间的联系, 本研究通过构建细菌的互作网络, 并分析了关键细菌集群与Z-score的关系.通过细菌互作网络共确定了5个主要的生态集群, 它们包含了网络内86.30%的节点[图 6（a）].只有集群2和集群3的相对丰度对OM转换有显著影响[图 6（b）].有趣的是, 集群2与Z-score呈显著负相关, 而集群3与Z-score呈正相关.Zhang等[30]报道关系越复杂的细菌降解能力越弱, 这与本研究的研究结果一致, 即集群3中网络的平均度、图密度和聚类系数的拓扑特征高于集群2（表 1）.图 6（c）显示了集群2和集群3在科水平上的物种组成.结果表明集群3中58.12%的重要微生物类群属于Bacillaceae（58.12%）, 这可能表明集群3在有机废物降解方面具有很大的潜力.此外, Pseudonocardiaceae科的多数微生物类群属病原菌, 研究发现Pseudonocardiaceae在集群3中的比例高于集群2.综上所述, 以上结果表明集群2具有更好的降解有机废物的能力.与CB处理组相比, 本研究发现集群2中的Bacillaceae的相对丰度在BM中明显更高[图 4（d）和图 6（c）].
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（a）包括多个生态集群在内的元网络, 节点的颜色代表不同的生态集群, （b）主要生态集群内核心类群相对丰度与Z-score的相关性分析, *、**分别表示在P < 0.05和P < 0.01水平上显著相关, （c）生态集群2和聚类3在科水平上的物种组成 图 6 微生物群生态网络生态集群间与Z-score联系 Fig. 6 Links between ecological clusters within ecological network of bacteria taxa and Z-score |
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表 1 全局网络与主要集群网络拓扑参数 Table 1 Topological features of different ecological clusters |
3 结论
纳米膜覆盖可以优化堆肥微环境, 从而提高有机质的降解率和酶活性.EC、pH和温度是影响细菌群落组成的主要环境因子.在纳米膜覆盖与接种芽孢杆菌联合作用下, 与OM降解相关的厚壁菌门和放线菌门丰度更高.此外, 纳米膜覆盖还能有效降低病原菌的丰度.本研究还揭示了聚集在集群3中的细菌群落在好氧堆肥过程中参与物质转化的重要性.综上, 研究结果表明微生物菌剂与纳米膜覆盖相结合是提高堆肥质量的有效策略.
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