2025, Vol. 46
2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085;
3. 山西师范大学生命科学学院, 太原 030031;
4. 长治学院生命科学系, 长治 046011;
5. 中国科学院大学资源与环境学院, 北京 101408
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. School of Life Science, Shanxi Normal University, Taiyuan 030031, China;
4. Department of Life Science, Changzhi University, Changzhi 046011, China;
5. College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China
多环芳烃（polycyclic aromatic hdrocarbons, PAHs）是一类由两个及两个以上苯环构成的稠环化合物, 属于持久性有机污染物, 具有潜在的生态风险和健康风险.有16种PAHs已被美国国家环保署（US EPA）列入优先控制污染物名录[1, 2].其中, 苯并[a]芘（BaP）是我国优先控制的18种化学物之一.有研究认为环境中的PAHs能够通过呼吸、饮食、皮肤接触等途径进入人体[3~6], 产生“三致”（致癌、致畸和致突变）风险.PAHs主要来源于化石燃料（石油、天然气、煤和有机高分子化合物等）, 生物质（木材、作物秸秆和烟草等）等不完全燃烧或热解过程, 是煤化工企业典型的污染物类型[7~9].
土壤环境是PAHs的一个重要“汇”.有研究认为, 不同生产活动过程排放的PAHs, 最终90%以上会通过各种途径进入土壤[10].因其憎水性, PAHs进入土壤易吸附在有机质颗粒上, 并能随着植物、动物和微生物的代谢活动进入生物体内, 通过食物链进入高一级生物体或人体内, 对土壤生态系统安全和人体健康具有潜在的风险[11, 12].
微生物是土壤生态系统的重要组成部分, 在促进土壤物质循环和维持生态系统稳定中发挥着重要作用.由于微生物具有体积小、代谢旺盛、繁殖速度快且易突变等特征, 因此, 土壤微生物一方面对污染物具有降解作用[13], 另一方面, 微生物在污染胁迫下可能发生遗传特性和生理特征的改变, 改变土壤微生物群落结构, 提升菌群的环境适应能力.有研究认为[14], 微生物对环境变化具有敏感性, 可将土壤微生物群落变化作为衡量土壤环境受外界因素扰动的一个指标.有研究表明, 在PAHs的长期胁迫下, 土壤微生物群落组成及其功能均发生了较大变化[15].有研究表明, 土壤污染物能够诱导微生物在基因水平或染色体水平上发生基因的突变、转移、重排与复制等适应性遗传机制的改变, 从而构成了PAHs降解或耐受性优势菌；同时, PAHs污染物影响了土壤微生物的代谢活性与代谢路径, 影响了土壤环境因子, 进而对土壤微生物类型发生了选择性促进或抑制性影响[16].目前, 有关PAHs污染土壤微生物学研究, 多集中于实验室或短期PAHs污染土壤的微生物群落结构解析或降解菌的筛选[17, 18], 但基于自然条件, 对长期受污染的土壤, 开展的微生物群落结构的研究报道还较少[19].山西某焦化厂具有40多年的生产历史, 由于生产和运输车辆排放的PAHs引起的周边农田土壤污染现象越来越严重, 对农作物生长产生了一定程度的影响.因此, 本文以该厂周边农田土壤为研究对象, 采用田间随机取样方式, 利用高通量测序分析和化学分析方法, 解析土壤微生物群落结构和PAHs污染物特征, 探讨土壤微生物对PAHs长期污染胁迫因子的效应, 旨在为污染土壤的安全评价与微生物修复技术的研发提供理论支撑.
1 材料与方法 1.1 土壤样品采集样区位于焦化厂的西北-西部-西南, 距离厂区围墙约800~1 000 m.该样区属于基本农田, 20世纪70~80年代, 有引用厂区污水灌溉的现象.近年来, 多种农作物（白菜、萝卜、菠菜、香菜、胡芹、豆角和土豆等当地常种作物）在生长周期中的某一时期, 会出现发生暴发性腐烂死亡、异常开花和暴裂等现象, 导致该区大部分土壤弃耕或仅种植玉米.本样品采集于2021年9月作物收获以后的表层（0~25 cm）土壤.采样点示意见图 1, 共计26个土壤样点, 每个样点平均代表约200 m2的样区（每个样区以“S”采样方式, 采集20~30个点的土壤, 然后合并混合记作一个样品）.土壤样品除去石块、植物根茎等杂物, 取一定量用自封袋运回实验室.微生物分析的样品采用鲜土.PAHs和理化分析的样品, 在室温下, 通风干燥, 风干后研磨, 过1 mm孔径的筛, 将土壤样品保存在-20℃冰箱待用.
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图 1 土壤样点位示意 Fig. 1 Soil sampling sites |
土壤pH根据水土比2.5∶1, 用pH仪（PHS-3C型）测定.电导率（EC）使用电导率仪（DDS-111A）测定；土壤有机质（TOC）含量采用TOC分析仪（Elementar, 德国）测定；全氮（TN）采用凯氏定氮法测定；总磷（TP）和有效磷（AP）采用钼锑抗比色法测定；总钾（TK）和速效钾（AK）采用火焰光度法测定；碱解氮（AN）采用碱解扩散法测定.
1.3 PAHs的测定方法土壤PAHs采用US EPA超声振荡提取法3540[20]的改良方法进行提取.称取10 g干燥均质的土壤样品, 加入30 mL丙酮∶二氯甲烷=1∶1（体积比）溶液, 涡旋振荡使样品分散, 在30℃、振荡频率为40 kHz的条件下超声提取20 min, 共提取3次, 3次提取的上清液用干燥无水硫酸钠过滤, 然后, 将滤液在35℃下氮吹浓缩至0.5 mL.使用装有无水硫酸钠和活化硅胶的（长15 cm×10 mm）柱对提取液进行净化.硅胶100℃下活化24 h, 无水硫酸钠, 200℃下干燥10 h.先后用丙酮和二氯甲烷混合液预洗硅胶柱, 然后, 将待净化样品移入柱内, 用正己烷∶二氯甲烷=1∶1（体积比）溶液洗脱, 收集含有PAHs的洗脱液, 在35℃下氮吹至0.5 mL, 然后用色谱级正己烷定容至1 mL, 经0.22 µm有机相滤头, 成样于1.5 mL棕色样品瓶, 利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析.
多环芳烃GC/MS分析条件.柱温初始温度60℃, 保持2 min, 然后以8℃·min-1升至230℃, 保持2 min, 再以2℃·min-1升至290℃, 保持2 min, 最后以5℃·min-1升至300℃, 保持12 min.进样口温度保持在300℃, 载气为高纯氦气（99.999%）, 保持恒定流速1 mL·min-1.用含有16种PAHs的标准混合标准溶液对GC-MS系统进行校正.提取效率的计算采用氘标记的替代标准.
1.4 质量控制对分析方法进行精密度和准确度检查.所有样品均重复测定3次, 包括过程空白（溶剂）和加标空白（在溶剂中添加16种PAHs标准品）的处理.通过分析已知添加量（每种PAHs的基质加标含量为100 µg·kg-1）的样品PAHs的检测量来计算不同类型PAHs的回收率. 16种PAHs的检出限（LOD）以6个浓度样品的标准偏差计算.16种PAHs的最低检出限从0.12 µg·kg-1（Nap）至0.62 µg·kg-1（BghiP）. 16种PAHs标准物质的基质加标回收率在（87±3）%~（98±4）%之间. 3个重复样品中单个PAHs的相对标准偏差均小于10%.空白样品响应值反映了样品的不同组分对PAHs测量没有干扰.
1.5 土壤DNA提取利用土壤DNASPIN快速提取试剂盒（MP Biomedicals）进行土壤微生物DNA的提取.称取土壤0.5 g, 引物为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区.利用上海美吉生物医药科技有限公司Illumina MiSeq PE300平台进行测序及后续生物信息学分析.
2 结果与分析 2.1 土壤PAHs污染特征土壤样品中PAHs的分析结果见表 1.从中可知, 土壤中检测到12种美国环保署（EPA）优先控制的多环芳烃类型, 即苊烯（Acy）、菲（Phe）、蒽（Ant）、芘（Pyr）、荧蒽（Fla）、（Chry）、苯并[a]蒽（BaA）、苯并[a]芘（BaP）、二苯并[a, h]蒽（DaA）、苯并[k]荧蒽（BkF）、苯并[b]荧蒽（BbF）和茚并[1, 2, 3-cd]芘（InP）.其中, （Chry）含量平均值最高（2.99×103 µg·kg-1）, 苊烯（Acy）平均值最低（0.03×103 µg·kg-1）；基于PAHs的环数可以分为4类：3环、4环、5环和6环PAHs, 其中, 占比最高的是4环PAHs（占比最大值为95.10%, 平均值为45.80%）, 其次是5环PAHs（占比最大值为49.00%, 平均值为40.10%）.土壤样品中PAHs总量（∑PAHs）的范围在1.28×103~60.73×103 µg·kg-1之间, 平均值为14.40×103 µg·kg-1, 中位值为5.71×103 µg·kg-1；有强致癌性BaP总量范围为ND~1.92×103 µg·kg-1, 平均值为0.68×103 µg·kg-1, 中位值为0.64×103 µg·kg-1.表明该区域土壤中高环PAHs（4~6环）所占比例, 土壤∑PAHs较高, 且不同样点之间差异较大, 平均值大于中位值, 同时, 毒性最大的BaP含量较高.
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表 1 土壤样品中不同PAHs的特征1） Table 1 Characteristics of different PAHs in soil samples |
依据Maliszewska-Kordybach[21]对欧洲农业土壤多环芳烃污染情况划分的4个水平：无污染（小于200 µg·kg-1）、轻度污染（200~600 µg·kg-1）、中度污染（600~1 000 µg·kg-1）和重度污染（大于1 000 µg·kg-1）, 该区所有样点土壤PAHs污染程度均达到了重度污染水平.同时可知, 土壤中主要存在的是相对分子质量高的PAHs, 与相对分子质量低的PAHs相比更难降解.参照我国土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准[22]中规定BaP的风险筛选值是0.55×103 µg·kg-1, 依据此标准可知, 该区61.5%的样点土壤检出BaP, 其中53.8%的样点土壤BaP含量大于筛选值（0.55×103 µg·kg-1）, 该区域土壤污染的风险需要关注.
2.2 土壤质量特征本研究选取了土壤有机质、酸碱度、土壤离子和标识土壤肥力的N、P、K（总量和速效组分）作为土壤质量的基本因子.根据1.2节的方法, 分析了26个土壤样品的有关质量因子（表 2）.由表 2可知, 样区土壤ω[有机质（TOC）]在0.34~2.22 g·kg-1之间, 平均值为0.95 g·kg-1.土壤ω[总氮（TN）]、ω[总磷（TP）]和ω[总钾（TK）]平均值分别为1.60、0.39和23.01 g·kg-1；ω[有效磷（AP）]、ω[速效氮（AN）]和ω[速效钾（AK）]的平均值分别为0.47、0.65g和8.04 g·kg-1.土壤pH范围6.58~8.41, 平均值为7.87.EC范围为0.24×103~4.61×103 µS·cm-1, 平均值为1.17×103 µS·cm-1.根据《第三次全国土壤普查技术规程》对土壤质量的划分标准, 该区土壤pH属于弱碱性土壤（7.5~8.5）, EC满足农田土壤质量标准（0.2~1.5 µS·cm-1）, TOC含量均低于最低等级标准（6 g·kg-1）；土壤AP丰富度为极丰富（> 0.04 g·kg-1）；土壤AN丰富度为极丰富（> 0.15 g·kg-1）.
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表 2 土壤基本因子 Table 2 Soil basic factors |
2.3 土壤微生物组成特征
根据16S rRNA测序结果, 分析26个土壤样品微生物群落的生物总量、类群和丰度等特征, 结果见表 3.从中可知, 从26个土壤样品微生物中共提取到1 385 004条有效序列, 平均长度为437.27 bp.其Shannon-Wiener曲线趋向平坦, 表明该样本测序数据量足够大, 能够反映样本中绝大多数的微生物多样性信息[23].土壤微生物的Shannon指数在6.49~7.26之间, 平均值为7.02. Ace指数在3.30×103~4.34×103之间, 平均值为3.80×103.指数的大小表示微生物群落物种的多样性, 数值越大, 表示土壤微生物群落物种种类越多；根据土壤微生物16S rRNA序列的5 450个OTU, 可划分为40个门、105个纲、208个目、399个科、769个属和1 610个种.
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表 3 不同样点土壤中微生物群落多样性 Table 3 Diversity of microbial communities in soils at different sites |
2.4 土壤微生物群落结构特征
根据土壤微生物不同类群的OTU丰度, 将相对丰度低于1%的合并为Others, 土壤微生物门水平上的分类结果如图 2所示.从中可知, 土壤微生物分属于40个门, 相对丰度排名前10的类群分别是变形菌门（Proteobacteria, 27.3%, 相对丰度, 下同）、放线菌门（Actinobacteria, 16.0%）、绿弯菌门（Chloroflexi, 13.3%）、酸杆菌门（Acidobacteria, 12.6%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes, 10.6%）、拟杆菌门（Bacteroidetes, 4.3%）、蓝菌门（Cyanobacteria, 3.01%）、浮霉菌门（Planctomycetes, 1.75%）、厚壁菌门（Firmicutes, 1.96%）和螺旋体门（Saccharibacteria, 1.37%）.结果表明, PAHs污染土壤的微生物群落呈现多样性, 其中变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria）, 芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）是占比较高的优势菌群, 5个优势菌群的总丰度为79.8%, 其中占比最高的变形菌门（Proteobacteria）相对丰度为27.3%.
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1.All（2~13的总和）, 2.Others, 3.Proteobacteria, 4.Actinobacteria, 5.Chloroflexi, 6.Acidobacteria, 7.Gemmatimonadetes, 8.Bacteroidetes, 9.Cyanobacteria, 10.Planctomycetes, 11.Firmicutes, 12.Saccharibacteria, 13.Nitrospirae；内环百分数表示门水平上不同物种在PAHs污染土壤中的分布比例（红色数字）, 以及相同物种在土壤中的分布比例（黑色数字） 图 2 PAHs污染土壤微生物门水平的结构特征 Fig. 2 Structural characteristics of PAHs-contaminated soil at the level of microbial phylum |
在属水平上, 微生物可以分为769个属, 排名前10的类群分别是, 酸杆菌属（norank_c_Acidobacteria, 6.53%, 相对丰度, 下同）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas, 4.46%）、芽单胞菌属（Gemmatimonadetes, 3.39%）、norank_ f__Gemmatimonadaceae（3.33%）、norank_o__JG30-KF-CM45, （3.17%）、norank_o__Acidimicrobiales, （1.95%）、norank_c__KD4⁃96, （1.91%）、norank_ f__Anaerolineaceae, （1.79%）、norank_ f__Nitrosomonadaceae, （1.66%）和norank_ f__Longimicrobiaceae, （1.48%）.其中, 酸杆菌属（norank_c_Acidobacteria）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽单胞菌属（Gemmatimonadetes）和norank_ f__Gemmatimonadaceae、norank_o__ JG30⁃KF⁃CM45. 5个属的总占比仅为20.9%, 最高单一属的占比仅为6.53%（图 3）.结果表明, 土壤微生物在属水平没有优势类群.
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1.All（2~13的总和）, 2.Others, 3.norank_c__Acidobacteria, 4.norank_o__JG30⁃KF⁃CM45, 5.norank_ f__Anaerolineaceae, 6.norank_c__Gemmatimonadetes, 7.Sphingomonas, 8.norank_ f__Gemmatimonadaceae, 9.norank_o__Acidimicrobiales, 10.norank_p__Saccharibacteria, 11.norank_c__KD4⁃96, 12.norank_ f__Longimicrobiaceae, 13.norank_ f__Nitrosomonadaceae, 14.norank_c__Cyanobacteria, 15.Nocardioides, 16.norank_c__Actinobacteria, 17.Gaiella, 18.Nitrospira, 19.norank_c__TK10, 20.norank_ f__OM1_clade, 21.Blastococcus, 22.norank_o__AKYG1722, 23.Marmoricola, 24.norank_o__Subgroup_7；内环百分数表示属水平上不同物种在PAHs污染土壤中分布比例（红色数字）, 以及相同物种在土壤中分布比例（黑色数字） 图 3 PAHs污染土壤微生物群落属水平的结构特征 Fig. 3 Structural characteristics of PAHs-contaminated soil at the level of microbial genus |
以土壤PAHs含量为自变量, 微生物OTU总量为因变量, 进行回归分析作散点图（图 4）.依据土壤微生物OTU对PAHs总量的数量关系可以分为4组：PAHs总量 > 30×103 µg·kg-1, OTU > 2.6×103和OTU < 2.6×103；PAHs总量 < 30×103 µg·kg-1, OTU > 2.6×103和OTU < 2.6 × 103；同时可知, 当PAHs总量 > 30×103 µg·kg-1 OTU的范围在2.41×103~2.69×103之间, 呈现较低的状态, 而当PAHs总量 < 30×103 µg·kg-1时, OTU的范围在2.21×103~2.98 × 103之间, 不同样点之间呈现多样性.结果表明, PAHs总量差异较大的样点, 但微生物总量接近（OTU, 2.41×103~2.69×103之间）, 如S24、S21、S12、S20（PAHs总量 > 30×103 µg·kg-1）和S10、S13、S5、S7、S25、S26、S2、S23（PAHs总量 < 30×103 µg·kg-1）；PAHs总量接近的样点（PAHs总量 < 30×103 µg·kg-1）, 但微生物量差异很大, 如S1、S9（OTU > 2.8×103）, S4、S16（OTU < 2.4×103）（图 4）.因此, 作者认为, 影响土壤微生物总量（OTU）的因素不仅仅是PAHs总量, 可能还与PAHs的类型及其相对丰度等因素有关.
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图 4 不同样点土壤PAHs总量与微生物丰度（OTU）散点图 Fig. 4 Scatter plot of correlation between total OTU and total PAHs content of soil microbial communities at different sites |
Chao1指数是度量物种丰富度的指标, 可以有效地估计物种数量, 准确地衡量由物种数量引起的多样性变化.以土壤PAHs的组成（不同类型PAHs的相对含量）与物种丰富度（Chao1指数大于0.01%的类群）进行相关性分析（图 5）.26个样点土壤检测到的12种PAHs与微生物的Chao1指数相关性均不高, 相关系数最大的类型是Acy（相关系数R2=0.74, P < 0.001）, 其次是Phe（R2=0.20, P < 0.05）和Ant（R2=0.07）, 其余类型的PAHs相关系数为0 < R2 < 0.1. 结果表明, 3环的PAHs类型对土壤微生物物种数量的影响较大, 而总体来看, 单一类型的PAHs对土壤微生物物种丰富度的影响力均不高.
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纵坐标表示相对丰度（%）, 横坐标表示Chao1指数；阴影部分表示置信区间；不同深浅的圆表示Chao1指数大小, 颜色越深Chao1指数越大 图 5 土壤PAHs组分与微生物物种丰度相关性分析 Fig. 5 Correlation analysis between soil PAHs fractions and microbial species abundance |
利用随机森林算法, 检测到一系列生物标记物, 它们对PAHs污染水平的变化表现出更高的敏感性.通过随机森林模型, 确定了一组微生物敏感的PAHs标记物[图 6（a）].通过线性回归分析表明, 模型能够准确预测微生物物种多样性对PAHs污染水平的响应能力[R2 =0.93, P < 0.001, 图 6（b）].通过反复交叉验证, 从12种PAHs中筛选出6种PAHs（Phe、Ant、BbF、DaA、Chry和InP）的污染水平与土壤微生物菌群的波动关系密切.其中Phe和Ant对土壤微生物物种丰度的影响具有显著性[图 6（c）].
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阴影部分代表置信区间；不同深浅的圆代表Chao1指数大小, 颜色越深Chao1指数越大；* 表示P < 0.05, **表示P < 0.01 图 6 随机森林回归模型 Fig. 6 Random forest regression model |
以不同环数PAHs的相对含量与物种丰富度（OTU数量）进行相关性分析（图 7）.不同环数的PAHs对土壤微生物丰富度具有一定的影响, 但也存在一定的差异.整体来看3环PAHs对土壤微生物的丰度影响较大（R2 =0.17, P = 0.037）.该结果与物种多样性分析具有一致性, 表明在PAHs污染土壤中微生物的丰度及其多样性受多因子的影响.
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阴影部分表示置信区间；不同深浅的圆表示Chao1指数大小, 颜色越深则Chao1指数越大 图 7 不同环数PAHs与微生物OTU的相关性 Fig. 7 Correlation of PAHs with microbial OTUs at different ring numbers |
以土壤不同PAHs相对含量与相对丰度前24的属进行相关性分析（图 8）.结果表明属水平上, 土壤Acy与Marmoricola、Nocardioides和Phormidium；Phe与H16、Nitrospira和Steroidobacter；Pyr与Bacillus、Lysobacter、Massilia和Truepera；Fla与Pseudarthrobacter；Chry与Flavobacterium和Pseudomona；BkF与Truepera；BbF与Nocardioides和Pseudarthrobacter；InP与Phormidium呈显著正相关（P < 0.05）. Acy与Nitrospira；Phe与Phormidium；Ant与Herpetosiphon；Fla与Phormidium；BaA与Pseudarthrobacter；InP与Massilia呈现显著负相关（P < 0.05）.结果表明, 不同类型的PAHs对同属的微生影响不同, 而且同一类型的PAHs对不同属微生的影响也不相同.
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1. Sphingomonas, 2. Nocardioides, 3. Gaiella, 4. Nitrospira, 5. Blastococcus, 6. Marmoricola, 7. Lysobacter, 8. H16, 9. Pseudarthrobacter, 10. Pontibacter, 11. Bacillus, 12. RB41, 13. Streptomyces, 14. Gemmatimonas, 15. Flavobacterium, 16. Microvirga, 17. Massilia, 18. Pseudomonas, 19. Steroidobacter, 20. Truepera, 21. Phormidium, 22. Meiothermus, 23. Herpetosiphon, 24. Vulcaniibacterium；*表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 8 不同PAHs同物种的相关性热图 Fig. 8 Heat map of correlation between different PAHs and the same species |
基于土壤因子、不同类型PAHs的相对含量与门水平丰度前10的类群做冗余分析（CCA, 图 9）.土壤因子和PAHs污染物对微生物群落总的解释度为62.47%.依据决定系数（R2）, 土壤EC、pH、TOC、TK、AK等因子和DaA、BaA、Ant等不同类型的PAHs与微生物类群的关联度高（R2≥0.10）；AP、AN和Acy、BbF、Fla、Pyr等因子与微生物类群具有中等相关（0.05≤R2 < 0.10）；TN、TP和Phe、BaP、Chry、BkF、InP等具有低度相关（R2 < 0.05）.土壤微生物类群可分为：与环境因子高度关联的类群, 主要包括变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）的类群；与环境因子低度关联度的类群主要有：拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝菌门（Cyanobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）和螺旋体门（Saccharibacteria）的类群.
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1. Proteobacteria, 2. Actinobacteria, 3. Acidobacteria, 4. Chloroflexi, 5. Firmicutes, 6. Bacteroidetes, 7. Gemmatimonadetes, 8.Saccharibacteria, 9. Planctomycetes, 10.Cyanobacteria；绿色的圆点表示样点, 红色箭头表示环境因子, 蓝色箭头表示微生物类型；样本点间的距离表示样本菌群组成的相似性和差异性；环境因子箭头的长短表示该因子对于物种数据影响程度的大小, 箭头间的夹角表示正负相关性, 其中锐角表示正相关, 钝角表示负相关, 直角表示没有相关性 图 9 土壤微生物群落组成与环境因子相关性分析 Fig. 9 Correlation analysis of soil microbial community composition and environmental factors |
结果表明, 微生物的群落结构是土壤环境因子与污染物PAHs共同作用的结果.其中, EC、pH、TOC、TK、AK, 致癌性（DaA、BaA、BbF）或低分子量的PAHs（Ant、Acy）与微生物的关联度较高.同时可知, 该区污染土壤主要的微生物类群是变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）.
3 讨论 3.1 多环芳烃污染土壤微生物的多样性特征研究区域土壤微生物分属于40多个门、769个属和1 610个种.占比前5的优势菌群依次是变形菌门（Proteobacteria）, 放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）, 总占比仅达79.8%, 而且在属和种水平上均无典型的优势类群.这可能是由于多种PAHs及其多样性的中间代谢产物的诱导作用, 尤其是致癌性PAHs及其中间代谢产物的诱变作用；其次是土壤基础条件, 如弱碱性（pH平均值为7.87）、基本满足农用标准的EC值（0.2×103~1.5×103 µS·cm-1）、低含量TOC（6 g·kg-1）、极丰富的AP（> 0.04 g·kg-1）、极丰富的AN（> 0.15 g·kg-1）和C/N失调等为土壤微生物提供了寡养性生存条件.因此, PAHs污染土壤微生物, 在多种环境条件的胁迫下, 诱导和分化形成了能够以污染物PAHs为碳源和能源物质生长的微生物类群.Sutton等[15]研究报道了长期受柴油污染的土壤, 土壤微生的优势菌群主要有变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria）等.有研究认为在有氧或缺氧条件下, 参与PAHs代谢的降解菌大多属于这4个门[24, 25]. Bell等[26]研究表明, Proteobacteria是石油污染土壤的主导微生物, 直接参与烃类物质降解.Gou等[27]研究表明, 受PAHs污染严重的土壤中, 降解PAHs的主要细菌群体为Proteobacteria. Haritash等[28]从多种污染（石油、机油、木材处理和炼油厂）场地中分离出多株具有降解BaP能力的菌株, 主要是Proteobacteria门的菌群. Macnaughton等[29]研究表明, PAHs污染土壤中的微生物多样性指数下降, 但其中α⁃Proteobacteria含量显著增加, 成为优势菌群.杨蕊琪等[30]研究表明, 在青藏高原这种极端的环境下, Proteobacteria会对烃类污染物做出迅速响应, 并认为Proteobacteria门的菌群多属于兼性厌氧或专性厌氧细菌, 对于土壤氮素的转化和利用具有较高的能力.有研究认为, 鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是常见的PAHs降解菌, 具有非常丰富的与降解功能相关的基因, 能够协调多种降解途径共同发挥作用, 在降解多环芳烃等芳香族化合物方面具有明显的优势[31].王振兴等[32]从高效纤维素降解菌群中筛选得到鞘氨醇单胞菌属降解PAHs的菌株.张杰等[33]研究表明, 鞘氨醇单胞菌属对多环芳烃菲具有较强的降解能力.有研究表明, 芽孢杆菌属（Bacillus）、分枝杆菌属（Mycobactetirum）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和假单胞菌属（Pseudomonas）都能够降解PAHs[34].
3.2 土壤微生物多样性的驱动因子本研究的结果表明, 依据对微生物多样性的影响力, 土壤因子和PAHs污染物可以分为3个水平：第一, 高水平的影响因子, 包括pH、TOC、EC、TK和DaA；第二, 中等水平的影响因子, 包括AK、AP和Ant、BaA、Acy、BbF；第三, 低水平关联的因子, 主要有TN、TP、AN和Phe、Fla、Pyr、BkF、Chry、InP、BaP土壤pH、EC、N、P和K是土壤环境的基本组成, 对微生物的生存有显著影响[35~37].有研究表明, pH、TOC、N和P含量等土壤因子是土壤微生物多样性形成的驱动因子[38, 39].TOC、N和P含量高的生境更适合土壤细菌的生长, 其微生物多样性也随之增加[40]. pH和EC是影响细菌群落结构的驱动因素[41, 42].有研究认为[43~45], PAHs能为微生物提供可利用的碳源和能源, 也是影响土壤微生物群落结构的因素之一.细菌可以通过特定的降解酶来降解PAHs, 产生多种种间代谢产物, 该类细菌能够适应并广泛暴露于环境污染环境中, 从而诱导形成污染环境微生物的多样性[46], Alsberi等[47]研究表明, Actinobacteria在石油污染土壤中具有降解碳氢化合物的潜力.有研究认为[48], Actinobacteria是一类种类繁多的细菌, 能够降解多种有机化合物, 尤其是PAHs等疏水性化合物.
4 结论（1）该区PAHs污染土壤微生物群落呈现多样性特征, 分属于40个门、769个属和1 610个种.在门水平上的优势类群主要有：变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）, 总丰度占土壤微生物总量的79.8%, 但在种和属水平上, 均没有典型优势类群.
（2）土壤微生物群落特征是土壤因子和污染物PAHs组分共同作用的结果.其中, 土壤理化性质（pH、TOC、EC和TK）是微生物群落的主要驱动因子；致癌性（DaA、BaA、BbF）或低毒性（Ant、Acy）PAHs是次要驱动因子.
（3）土壤微生物群落结构特征是污染物PAHs类型和土壤特征因子共同作用的结果
| [1] | Kuppusamy S, Thavamani P, Venkateswarlu K, et al. Remediation approaches for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) contaminated soils: technological constraints, emerging trends and future directions[J]. Chemosphere, 2017, 168: 944-968. DOI:10.1016/j.chemosphere.2016.10.115 |
| [2] |
张秀秀, 朱昌达, 王飞, 等. 南京城郊不同土地利用类型农业土壤多环芳烃污染特征及风险评价[J]. 环境科学, 2023, 44(2): 944-953. Zhang X X, Zhu C D, Wang F, et al. Pollution characteristics and risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons in agricultural soils of different land use types in Nanjing suburbs[J]. Environmental Science, 2023, 44(2): 944-953. |
| [3] |
阿米拉, 耿柠波, 曹蓉, 等. 大气颗粒物中典型有机物的分析方法和污染特征研究进展[J]. 环境化学, 2021, 40(12): 3774-3786. A M L, Geng N B, Cao R, et al. Research progress of analytical methods and pollution characteristics of typical organic pollutant in atmospheric particulate matter[J]. Environmental Chemistry, 2021, 40(12): 3774-3786. DOI:10.7524/j.issn.0254-6108.2020081204 |
| [4] | Kariyawasam T, Doran G S, Howitt J A, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon contamination in soils and sediments: sustainable approaches for extraction and remediation[J]. Chemosphere, 2022, 291. DOI:10.1016/j.chemosphere.2021.132981 |
| [5] | Zhang Y, Peng C, Guo Z H, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons in urban soils of China: distribution, influencing factors, health risk and regression prediction[J]. Environmental Pollution, 2019, 254. DOI:10.1016/j.envpol.2019.112930 |
| [6] |
李静雅, 吴迪, 许芸松, 等. 长江三角洲区域表土中多环芳烃的近期分布与来源[J]. 环境科学, 2016, 37(1): 253-261. Li J Y, Wu D, Xu Y S, et al. Recent distribution and sources of polycyclic aromatic hydrocarbons in surface soils from Yangtze River Delta[J]. Environmental Science, 2016, 37(1): 253-261. |
| [7] |
麻俊胜, 苟雅玲, 王兴润, 等. 化学氧化后深层土壤中多环芳烃的缺氧微生物降解[J]. 环境工程技术学报, 2020, 10(1): 97-104. Ma J S, Gou Y L, Wang X R, et al. Anoxic biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in aged deep soil pretreated with chemical oxidation[J]. Journal of Environmental Engineering Technology, 2020, 10(1): 97-104. |
| [8] |
王硕, 魏文侠, 李佳斌, 等. 某钢铁厂土壤中多环芳烃污染评价与风险评估[J]. 环境工程技术学报, 2019, 9(4): 447-452. Wang S, Wei W X, Li J B, et al. Evaluation and risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil of a steel plant[J]. Journal of Environmental Engineering Technology, 2019, 9(4): 447-452. |
| [9] |
董捷, 黄莹, 李永霞, 等. 北方某大型钢铁企业表层土壤中多环芳烃污染特征与健康风险评价[J]. 环境科学, 2016, 37(9): 3540-3546. Dong J, Huang Y, Li Y X, et al. Pollution characteristics and health risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons in the surface soils of a large steel enterprise in the north of China[J]. Environmental Science, 2016, 37(9): 3540-3546. |
| [10] | Barth J A C, Steidle D, Kuntz D, et al. Deposition, persistence and turnover of pollutants: first results from the EU project AquaTerra for selected river basins and aquifers[J]. Science of the Total Environment, 2007, 376(1-3): 40-50. DOI:10.1016/j.scitotenv.2007.01.065 |
| [11] |
焦海华, 郭佳佳, 张婧旻, 等. 种植油麦菜评价多环芳烃污染土壤的农用风险[J]. 环境科学, 2019, 40(5): 2460-2470. Jiao H H, Guo J J, Zhang J M, et al. Evaluation of the potential agricultural risks of polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated soil by planting Lactuca sativa L.[J]. Environmental Science, 2019, 40(5): 2460-2470. |
| [12] |
周雯雯, 李军, 胡健, 等. 青藏高原中东部表层土壤中多环芳烃的分布特征、来源及生态风险评价[J]. 环境科学, 2018, 39(3): 1413-1420. Zhou W W, Li J, Hu J, et al. Distribution, sources, and ecological risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soils of the central and eastern areas of the Qinghai-Tibetan Plateau[J]. Environmental Science, 2018, 39(3): 1413-1420. |
| [13] | Díaz E. Bacterial degradation of aromatic pollutants: a paradigm of metabolic versatility[J]. International Microbiology, 2004, 7(3): 173-180. |
| [14] | Schloter M, Dilly O, Munch J C. Indicators for evaluating soil quality[J]. Agriculture, 2003, 98(1-3): 255-262. |
| [15] | Sutton N B, Maphosa F, Morillo J A, et al. Impact of long-term diesel contamination on soil microbial community structure[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(2): 619-630. DOI:10.1128/AEM.02747-12 |
| [16] | Silva-Castro G A, Rodelas B, Perucha C, et al. Bioremediation of diesel-polluted soil using biostimulation as post-treatment after oxidation with Fenton-like reagents: assays in a pilot plant[J]. Science of the Total Environment, 2013, 445⁃446: 347-355. |
| [17] |
代小丽, 王硕, 李佳斌, 等. 石油污染土壤原位生物修复强化技术研究进展[J]. 环境工程技术学报, 2020, 10(3): 456-466. Dai X L, Wang S, Li J B, et al. Research progress on in situ bioremediation enhancement technology of oil contaminated soil[J]. Journal of Environmental Engineering Technology, 2020, 10(3): 456-466. |
| [18] |
陈箐, 程昉, 宋晓峰, 等. 辽河油田油泥微生物多样性分析及功能菌种筛选评价[J]. 东北石油大学学报, 2017, 41(6): 105-111. Chen Q, Cheng F, Song X F, et al. Analysis of microbial diversity and functional strain screening evaluation from Liaohe oilfield sludge[J]. Journal of Northeast Petroleum University, 2017, 41(6): 105-111. DOI:10.3969/j.issn.2095-4107.2017.06.012 |
| [19] | Peng M, Zi X X, Wang Q Y. Bacterial community diversity of oil-contaminated soils assessed by high throughput sequencing of 16S rRNA genes[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2015, 12(10): 12002-12015. DOI:10.3390/ijerph121012002 |
| [20] | United States Environmental Protection Agency (USEPA). Method3540C, Soxhlet extraction[EB/OL]. http://en.wikipedia.org/wiki/United_States_Environmental_Protection_Agency, 2024-01-01. |
| [21] | Maliszewska-Kordybach B. Polycyclic aromatic hydrocarbons in agricultural soils in Poland: preliminary proposals for criteria to evaluate the level of soil contamination[J]. Applied Geochemistry, 1996, 11(1-2): 121-127. DOI:10.1016/0883-2927(95)00076-3 |
| [22] | GB 15618-2018, 土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)[S]. |
| [23] |
李文旭, 何剑汶, 刘璟, 等. 黄水溪砷环境地球化学迁移行为及其细菌群落分析[J]. 环境科学研究, 2019, 32(6): 966-973. Li W X, He J W, Liu J, et al. Environmental geochemistry and transportation behavior of arsenic and bacterial community analysis in Huangshui Creek[J]. Research of Environmental Sciences, 2019, 32(6): 966-973. |
| [24] | Rogers S W, Ong S K, Moorman T B. Mineralization of PAHs in coal-tar impacted aquifer sediments and associated microbial community structure investigated with FISH[J]. Chemosphere, 2007, 69(10): 1563-1573. DOI:10.1016/j.chemosphere.2007.05.058 |
| [25] | Zhang D C, Mörtelmaier C, Margesin R. Characterization of the bacterial archaeal diversity in hydrocarbon-contaminated soil[J]. Science of the Total Environment, 2012, 421-422: 184-196. DOI:10.1016/j.scitotenv.2012.01.043 |
| [26] | Bell T H, Yergeau E, Martineau C, et al. Identification of nitrogen-incorporating bacteria in petroleum-contaminated arctic soils by using [15N] DNA-based stable isotope probing and pyrosequencing[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(12): 4163-4171. DOI:10.1128/AEM.00172-11 |
| [27] | Gou Y L, Zhao Q Y, Yang S C, et al. Removal of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and the response of indigenous bacteria in highly contaminated aged soil after persulfate oxidation[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2020, 190. DOI:10.1016/j.ecoenv.2019.110092 |
| [28] | Haritash A K, Kaushik C P. Biodegradation aspects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): a review[J]. Journal of Hazardous Materials, 2009, 169(1-3): 1-15. DOI:10.1016/j.jhazmat.2009.03.137 |
| [29] | Macnaughton S J, Stephen J R, Venosa A D, et al. Microbial population changes during bioremediation of an experimental oil spill[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(8): 3566-3574. DOI:10.1128/AEM.65.8.3566-3574.1999 |
| [30] |
杨蕊琪, 薛林贵, 常思静, 等. 祁连山不同海拔低温原油降解菌群的分布特性研究[J]. 冰川冻土, 2016, 38(3): 785-793. Yang R Q, Xue L G, Chang S J, et al. Elevation-distribution characteristics of the crude oil degrading bacterium in the Qilian Mountains[J]. Journal of Glaciology and Geocryology, 2016, 38(3): 785-793. |
| [31] |
刘辉, 韦璐璐, 朱龙发, 等. 鞘氨醇单胞菌的研究进展[J]. 微生物学通报, 2023, 50(6): 2738-2752. Liu H, Wei L L, Zhu L F, et al. Research progress of Sphingomonas[J]. Microbiology China, 2023, 50(6): 2738-2752. |
| [32] |
王振兴, 陶敏, 方程, 等. 一株鞘氨醇单胞菌的分离鉴定及性质表征[J]. 大连工业大学学报, 2019, 38(6): 403-407. Wang Z X, Tao M, Fang C, et al. Isolation, identification and characterization of a Sphingomonas sp. strain[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2019, 38(6): 403-407. |
| [33] |
张杰, 姚依妮, 王开扬, 等. 鞘氨醇单胞菌的特征特性及对石油成分降解作用的分析预测[J]. 中国口岸科学技术, 2022, 4(9): 86-91. Zhang J, Yao Y N, Wang K Y, et al. Characteristics of Sphingomonas and prediction of its degrading effect on petroleum components[J]. China Port Science and Technology, 2022, 4(9): 86-91. DOI:10.3969/j.issn.1002-4689.2022.09.015 |
| [34] |
吴枭雄, 王红旗, 刘自力. 多环芳烃污染土壤的微生物修复技术研究进展[J]. 环境与发展, 2018, 30(7): 108-109. Wu X X, Wang H Q, Liu Z L. Progress in research on microbial remediation of polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated soil[J]. Environment and Development, 2018, 30(7): 108-109. |
| [35] |
李海云, 姚拓, 高亚敏, 等. 退化高寒草地土壤真菌群落与土壤环境因子间相互关系[J]. 微生物学报, 2019, 59(4): 678-688. Li Y H, Yao T, Gao Y M, et al. Relationship between soil fungal community and soil environmental factors in degraded alpine grassland[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2019, 59(4): 678-688. |
| [36] | Cheema S, Lavania M, Lal B. Impact of petroleum hydrocarbon contamination on the indigenous soil microbial community[J]. Annals of Microbiology, 2015, 65(1): 359-369. DOI:10.1007/s13213-014-0868-1 |
| [37] |
吴盼云, 晁群芳, 赵亚光, 等. 克拉玛依石油污染土壤微生物群落结构及其代谢特征[J]. 基因组学与应用生物学, 2019, 38(5): 2062-2069. Wu P Y, Chao Q F, Zhao Y G, et al. Microbial community structure and metabolic characteristics of oil-contaminated soil in Karamay[J]. Genomics and Applied Biology, 2019, 38(5): 2062-2069. |
| [38] | Rousk J, Brookes P C, Bååth E. The microbial PLFA composition as affected by pH in an arable soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2010, 42(3): 516-520. DOI:10.1016/j.soilbio.2009.11.026 |
| [39] | Wu Y C, Zeng J, Zhu Q H, et al. pH is the primary determinant of the bacterial community structure in agricultural soils impacted by polycyclic aromatic hydrocarbon pollution[J]. Scientific Reports, 2017, 7. DOI:10.1038/srep40093 |
| [40] | Delgado-Baquerizo M, Reich P B, Khachane A N, et al. It is elemental: soil nutrient stoichiometry drives bacterial diversity[J]. Environmental Microbiology, 2017, 19(3): 1176-1188. DOI:10.1111/1462-2920.13642 |
| [41] | Bryant J A, Lamanna C, Morlon H, et al. Microbes on mountainsides: contrasting elevational patterns of bacterial and plant diversity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(S1): 11505-11511. |
| [42] | Hu Y J, Xiang D, Veresoglou S D, et al. Soil organic carbon and soil structure are driving microbial abundance and community composition across the arid and semi-arid grasslands in Northern China[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2014, 77: 51-57. DOI:10.1016/j.soilbio.2014.06.014 |
| [43] | Zhao X H, Fan F Q, Zhou H D, et al. Microbial diversity and activity of an aged soil contaminated by polycyclic aromatic hydrocarbons[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2018, 41(6): 871-883. DOI:10.1007/s00449-018-1921-4 |
| [44] | Geng S Y, Cao W, Yuan J, et al. Microbial diversity and co-occurrence patterns in deep soils contaminated by polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2020, 203. DOI:10.1016/j.ecoenv.2020.110931 |
| [45] |
冉宗信, 陈靖宇, 王亚婷, 等. 典型工业区土壤多环芳烃污染特征及影响因素[J]. 环境科学, 2019, 40(10): 4594-4603. Ran Z X, Chen J Y, Wang Y T, et al. Characteristics and influencing factors of polycyclic aromatic hydrocarbons in surface soils from typical industrial areas of Chengdu[J]. Environmental Science, 2019, 40(10): 4594-4603. |
| [46] | Abo-State M A M, Riad B Y, Bakr A A, et al. Biodegradation of naphthalene by Bordetella avium isolated from petroleum refinery wastewater in Egypt and its pathway[J]. Journal of Radiation Research and Applied Sciences, 2018, 11(1): 1-9. DOI:10.1016/j.jrras.2017.10.001 |
| [47] | Alsberi H, Hamad A A, Hassan M M. Biodegradation of petroleum hydrocarbons using indigenous bacterial and actinomycetes cultures[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences, 2020, 23(6): 726-734. DOI:10.3923/pjbs.2020.726.734 |
| [48] | Dudhagara D R, Dave B P. Mycobacterium as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degrader[J]. Mycobacterium-Research and Development, 2018, 17: 349-361. |