环境科学  2025, Vol. 46 Issue (3): 1795-1805   PDF    
引用本文
雷春燕, 李亚男, 梁梦静, 杨泽, 孙岩, 季春丽, 张春辉, 李润植, 孙希平, 崔红利. 莱茵衣藻活细胞制剂缓解小麦幼苗镉胁迫的效应与机制[J]. 环境科学, 2025, 46(3): 1795-1805.
LEI Chun-yan, LI Ya-nan, LIANG Meng-jing, YANG Ze, SUN Yan, JI Chun-li, ZHANG Chun-hui, LI Run-zhi, SUN Xi-ping, CUI Hong-li. Effect and Mechanism of Chlamydomonas reinhartii Living Cell Agents in Alleviating Cd Stress on Wheat Seedlings[J]. Environmental Science, 2025, 46(3): 1795-1805.
莱茵衣藻活细胞制剂缓解小麦幼苗镉胁迫的效应与机制
雷春燕1, 李亚男1, 梁梦静1, 杨泽1, 孙岩1, 季春丽1, 张春辉1, 李润植1, 孙希平1, 崔红利2     
1. 山西农业大学农学院, 山西省特用作物遗传与代谢工程研究中心, 太谷 030801;
2. 中国科学院烟台海岸带研究所, 海岸带生物学与生物资源利用重点实验室, 烟台 264003
收稿日期: 2024-02-22; 修订日期: 2024-05-11
基金项目: 国家重点研发计划项目(2021YFD1901100)；省部共建有机旱作农业国家重点实验室(筹)自主研发课题项目(202105D121008-3-6)；山西省高等学校科技创新项目(2021L119)；山西省农业厅“六新”项目
作者简介: 雷春燕(1997~), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为作物逆境生理与生物技术, E-mail: vaeleicy@163.com
通信作者: 孙希平, E-mail: sxpljj@126.com; 崔红利, E-mail: cuihongli@sxau.edu.cn
摘要: 重金属镉(Cd)污染不仅导致农作物减产, 而且可通过食物链传递和积累, 对人类健康构成威胁. 减少作物对Cd吸收和富集, 以及提高Cd胁迫抗性是绿色健康农业可持续发展的重要议题. 为建立应用微藻防控Cd污染和提高作物抗逆性的新农艺技术, 选用莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和小麦(Triticum aestivum)开展系统研究, 以期阐明微藻阻滞Cd迁移和增强作物Cd胁迫抗性的效果及作用机制. 供试作物为冬小麦品种晋麦182(JM182)和春小麦品种津春6号(JC6). 水培试验设置2个剂量的Cd胁迫即50 mg·L-1(Cd50)和100 mg·L-1(Cd100). 制备2种剂量的莱茵衣藻活细胞制剂即藻液D680为1.0 (A1.0)和D680为2.0 (A2.0). 测定小麦幼苗生长、生理响应、Cd吸收、转运和积累, 以及重金属转运相关基因转录表达等参数. 结果表明, Cd胁迫严重抑制小麦幼苗生长. 施用莱茵衣藻活细胞制剂可显著增加小麦幼苗光合色素含量和激活抗氧化酶系统活性, 显著减轻Cd胁迫对小麦幼苗的伤害. 此外, 莱茵衣藻活细胞制剂A1.0和A2.0处理均能下调小麦幼苗重金属吸收和转运相关基因(TaHMA2、TaHMA3、TaNramp1和TaLCT1)的转录表达. 小麦幼苗Cd含量测定显示, Cd50和Cd100胁迫分别导致JC6春小麦幼苗Cd富集量达185.01 mg·kg-1和342.11 mg·kg-1, Cd在JM182冬小麦幼苗积累量达176.76 mg·kg-1和317.65 mg·kg-1. 显然, 与JM182品种相比, JC6小麦品种易于吸收和富集Cd. 重要的是, 微藻活细胞制剂处理则显著减少2个品种小麦幼苗Cd积累量. 与Cd50处理的JC6品种小麦幼苗相比, A2.0处理的JC6品种小麦幼苗根部和茎叶部的Cd积累量分别下降了76.80%和66.91%, 且Cd从根部向茎叶部转移率减低了27.58%. 结果显示, 莱茵衣藻活细胞制剂通过调控重金属吸收和转运相关基因的表达, 显著减少小麦幼苗对Cd的吸收和从根部向茎叶器官的转运与积累. 莱茵衣藻活细胞制剂亦可通过激活抗氧化系统及增强光合作用等, 有效缓解Cd对小麦幼苗的伤害, 进而促进小麦生长发育. 研究发现可为微藻活细胞制剂用作生物肥或生物刺激剂以阻滞重金属污染物的迁移和增强植物对重金属的抗逆性提供了科学依据和新策略.
关键词: 镉(Cd)胁迫      小麦幼苗      微藻活细胞制剂      抗氧化系统      光合作用      重金属吸收和积累     
Effect and Mechanism of Chlamydomonas reinhartii Living Cell Agents in Alleviating Cd Stress on Wheat Seedlings
LEI Chun-yan1 , LI Ya-nan1 , LIANG Meng-jing1 , YANG Ze1 , SUN Yan1 , JI Chun-li1 , ZHANG Chun-hui1 , LI Run-zhi1 , SUN Xi-ping1 , CUI Hong-li2     
1. Shanxi Engineering Research Center for Genetics and Metabolism of Special Crops, College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China;
2. Key Laboratory of Coastal Biology and Biological Resource Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China
Abstract: Cadmium (Cd) pollution not only leads to the reduction in crop yields but also migrates and accumulates through the food chain, thus posing a threat to human health. It is an important issue to reduce Cd uptake and enrichment in crops and increase crop resistance to Cd stress for sustainable development of green-health agriculture. To establish a novel agronomic technique using microalgae to control Cd pollution and improve crop stress resistance, the microalga Chlamydomonas reinhardtii and wheat (Triticum aestivum)were employed for systematic investigation so as to the elucidate effects and mechanism of microalgae in blocking Cd migration and enhancing crop resistance to Cd stress. The test crop materials were the winter wheat variety JM182 and spring wheat variety JC6. Hydroponic experiments were used to simulate Cd stress at two dosages, 50 mg·L-1 (Cd50) and 100 mg·L-1 (Cd100). Two different dosages of C. reinhardtii living cell agents, i.e., the microalgal cell cultures with D680 = 1.0 (A1.0) and D680 = 2.0 (A2.0), were prepared using conventional microalgal-cultivation methods and subsequently used to treat wheat seedlings under Cd stress. Several physiological and biochemical parameters were determined for wheat seedlings under two doses of Cd stress, respectively, including growth features, photosynthesis, cellular antioxidant enzyme activity, Cd uptake, transportation and accumulation, and transcriptions of the genes associated with heavy metal transportation. The results showed that Cd stress crucially inhibited the growth of wheat seedlings. However, the application of C. reinhardtii living cell agents significantly increased the contents of photosynthetic pigments (chlorophyll a, chlorophyll b, and carotenoids) and activated the antioxidant enzyme system activities (SOD, POD, CAT, GSH, and APX). The microalgal living cell agents also reduced the damage of Cd stress on wheat seedling growth. Moreover, both doses (A1.0 and A2.0) of C. reinhardtii living cell agents downregulated the expression of the genes related to heavy metal absorption and transportation (TaHMA2, TaHMA3, TaNramp1, and TaLCT1). Analysis of Cd contents indicated that Cd stress resulted in Cd accumulation in wheat seedlings, with a higher level of Cd in JC6 than in JM182 under both doses of Cd stresses. Cd50 and Cd100 stresses led to Cd levels up to 185.01 mg·kg-1 and 342.11 mg·kg-1 in JC6 wheat seedlings and 176.76 mg·kg-1 and 317.65 mg·kg-1 in JM182, respectively. Notably, the addition of the microalgal living cell agent significantly reduced Cd enrichment in wheat seedlings of both varieties under Cd stresses. Compared to the Cd level in JC6 wheat seedlings under Cd50 stress, the Cd accumulation level in roots and stem-leaf parts of A2.0-treated JC6 wheat seedlings was reduced by 76.80% and 66.91%, respectively, followed by a 27.58% diminution of Cd transport rate from roots toward stem-leaf parts. Collectively, microalgal living cell agents could remarkably reduce Cd uptake, accumulation, and transportation from roots to stem-leaf organs of wheat seedlings by down-regulating gene expressions involved in heavy metal absorption and transportation. The microalgal living cell agent can also activate the antioxidant system and increase photosynthesis, thus mitigating Cd toxicity and promoting the growth and development of wheat seedlings. The present findings provide a scientific basis and new strategy for using microalgal living cell agents as bio-fertilizers or bio-stimulants to impede migration of heavy metal pollutants and enhance plant resistance to heavy metal stresses.
Key words: cadmium (Cd) stress      wheat seedling      microalgal living cell agent      antioxidant system      photosynthesis      heavy metal uptake and accumulation     

随着工业化进程的加速, 环境质量遭受了前所未有的损害. 特别是废水、废渣和工业废物的无序排放, 导致了重金属广泛进入农业系统, 引发了土壤重金属面源污染[1]. 据统计, 中国大约有2 000万hm2耕地受到镉(Cd)、铅(Pb)和汞(Hg)等重金属污染, 其中Cd污染最严重, 占国土面积的7%[2, 3]. Cd具有高流动性、累积性和毒性[4, 5]. Cd污染严重影响植物生长和生理生化过程. 例如, Cd污染可阻碍种子发芽、减缓幼苗生长、降低生物量、削弱植株抗逆性、增加植物体内活性氧(ROS)富集、损伤植物抗氧化剂机制、破坏叶绿体的超微结构和抑制细胞光合作用等[6, 7].

小麦(Triticum aestivum)作为全球主要粮食作物之一, 其种植面积约占全球耕地总面积的20%[8]. 部分小麦产区已面临严重的Cd污染, 给小麦生产带来新的挑战. 小麦籽粒富集的Cd成为人类摄入Cd的主要来源[9, 10]. 然而, 人体内的Cd积累可能导致肝功能受损、肺水肿、骨骼疾病和高血压等健康问题[11]. 相较于大麦、玉米和水稻等其他粮食作物, 小麦籽粒对Cd的积累能力更强[12 ~ 14]. 因此, 对Cd污染农田进行修复, 特别是有效抑制小麦籽粒中Cd的积累对小麦的健康生长和保障国家粮食安全意义重大.

目前, 修复土壤重金属污染的方法主要包括物理修复、化学修复和生物修复[15]. 在众多生物修复技术中, 微藻(microalgae)生物制剂因其高效、经济和环保等优势已成为农田污染绿色治理研究的一个热点[16, 17]. 微藻是一类单细胞光自养低等植物, 不仅能在极端条件下良好生长, 而且能利用其细胞壁中的多肽、含醛基的胞外多糖、纤维素、油脂和蛋白质等成分有效地吸附重金属[18]. 微藻细胞壁上的官能团(如氨基、羧基、羟基、咪唑、磷酸盐、磺酸盐和硫醇等)可以通过静电作用和离子交换等方式, 将重金属离子吸附在细胞表面, 形成金属硫蛋白等有机金属复合物, 并通过细胞膜的载体进行内运, 从而降低重金属的迁移性[19]. 微藻还可以通过形成沉淀和稳定化合物等方式, 改变重金属的形态, 固定约70%的重金属[20]. 利用微藻处理土壤重金属污染不但能避免二次污染, 而且成本低廉, 去除效果良好.

此外, 微藻可作为生物肥(biofertilizer)或生物刺激剂(biostimulant), 在农业领域中的应用前景广阔[21]. 微藻富含微量元素、营养物质、生物活性物质和植物激素, 对作物生长至关重要. 施用微藻也能提高作物对干旱、盐碱和重金属等非生物胁迫的耐受性[22 ~ 24]. 然而, 鲜见应用微藻生物肥或微藻生物刺激剂来增强小麦对重金属的抗性以及治理土壤Cd污染的相关研究报道. 本研究通过水培试验探究外源施用微藻活细胞制剂对Cd胁迫下小麦幼苗的生长、光合作用、抗氧化系统、相关基因表达及植物对Cd吸收和转运的影响, 揭示微藻活细胞制剂缓解小麦Cd胁迫危害和促生效应及其作用机制. 本研究结果以期为建立基于微藻活细胞制剂治理麦田重金属污染、提高小麦抗逆性和健康、优质小麦粮食生产的技术策略提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试小麦品种：晋麦182(JM182), 山西晋中本地种植的冬小麦品种. 津春6号(JC6), 天津农作物研究所选育的春小麦品种.

供试藻种：莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC849藻株, 山西农业大学农学院分子农业与生物能源研究所提供.

1.2 莱茵衣藻活细胞制剂和重金属Cd溶液的配制

供试莱茵衣藻藻种接种于含有200 mL无菌TAP培养基的500 mL Erlenmeyer烧瓶中, 调整培养液pH为7. 将培养瓶置于温度(25±1)℃, 光强100 μmol·m-2·s-1和光周期16 h∶8 h的条件下培养. 每天用手摇藻培养5次, 连续培养7 d. 分别取藻细胞液D680值为1.0和2.0时的藻细胞液, 制备藻细胞生物量相差1倍的低(A1.0)和高(A2.0)2个剂量的莱茵衣藻活细胞制剂, 用于后续试验.

经预试验后, 确定用2个剂量Cd胁迫处理液(Cd50和Cd100). 以1/2 Hoagland营养液为基础, 添加CdCl2使其ρ(Cd)分别为50 mg·L-1和100 mg·L-1.

1.3 试验设计

选取大小均匀的小麦种子, 用5%次氯酸钠浸泡10 min, 蒸馏水冲洗3次后, 放入培养箱进行萌发试验. 小麦种子发芽7 d后, 将长势均匀的10株小麦幼苗为一组移栽到水培盒中(127 mm×84 mm×114 mm), 进行各种处理. 本试验处理设计见表 1.

表 1 试验处理设计 Table 1 Design of experimental treatments

每个处理设置3个平行重复. 所有处理的小麦幼苗均置于组培室中生长, 室温(25±1)℃, 2 d更换一次处理液, 连续处理21 d后, 收获小麦幼苗样品用于相关指标测定.

1.4 小麦幼苗样品的采集

小麦幼苗样品用0.05 mol·L-1 EDTA-2Na溶液浸泡, 去除根系表面附着的Cd离子, 按地上和地下两部分进行收获. 幼苗样品的叶片用液氮冷冻后, 置于冰箱于-80 ℃保存. 样品用于后续测定色素含量、抗氧化酶活性及RNA的提取. 剩余的幼苗样品置于烘箱中, 80 ℃烘干至恒重. 用天平称量幼苗样品质量, 幼苗茎叶器官和根部样本分别粉碎后, 用于测定Cd的含量.

1.5 叶绿素含量和荧光参数的测定

用电子天平称取0.1 g小麦幼苗叶片, 磨碎后, 立即加入80%丙酮, 置于4 ℃冰箱中24 h. 样品经5 000 g、4 ℃下离心5 min后, 取上清液, 用紫外分光光度计UV1 800测量470、645和663 nm处的吸光值. 通过公式计算光合色素的含量. 使用LI-6800叶绿素荧光仪测定小麦幼苗叶片光系统Ⅱ(PSⅡ)最大的光能转换效率(Fv/Fm)和PSⅡ实际光化学速率[(Y(Ⅱ)].

式中, Chla、Chla和Car分别为叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量(mg·g-1), A470、A663和A645分别为470、663和645 nm处测定的上清液的吸光值.

1.6 抗氧化酶活性的测定

使用购自北京索莱宝科技有限公司的试剂盒测定小麦超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽(GSH)的活性和脯氨酸(Pro)的含量.

1.7 Cd含量的测定

将小麦地上部和地下部的干燥组织样品(0.1g)粉碎后, 按照HNO3∶HClO4=4∶1消解, 使用AFS-230E双道原子荧光光度计测定Cd含量(mg·g-1), 并计算得到小麦地上部和地下部Cd积累量(mg·g-1)和Cd迁移系数.
1.8 总RNA提取及qPCR

使用Trizol(Takara)试剂从小麦幼苗样品中提取总RNA, 逆转录生成cDNA后, 进行qPCR反应. 根据2-ΔΔCt方法计算目标基因相对表达水平, 以TaActin为内参基因对目标基因表达水平进行标准化. 试验采用3个生物重复和3个技术重复. 表 2列出检测重金属ATP酶(HMA2/3)、低亲和性阳离子转运蛋白(LCT1)和自然抗性相关的巨噬细胞蛋白质(Nramp1)等目标基因表达所使用的PCR引物.

表 2 荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for quantitative PCR analysis

1.9 数据分析

用Excel 2013统计试验数据, 用SPSS 24.0进行LSD显著性差异分析, 用Origin 2021制图.

2 结果与分析 2.1 莱茵衣藻活细胞制剂缓解Cd胁迫对小麦幼苗的损害

用12种处理分别对2个小麦品种的幼苗进行处理, 于21 d后观察和分析小麦幼苗生长状况. 幼苗表型如图 1所示, 与无Cd处理(Cd0和TAP)相比, Cd胁迫显著抑制2个品种小麦幼苗的生长, 且高剂量Cd(Cd100)比低剂量Cd(Cd50)胁迫的抑制效应更强. 然而, 添加莱茵衣藻活细胞制剂(A1.0和A2.0)则明显缓解Cd对小麦幼苗的抑制作用, 促进小麦幼苗生长, 并且促生效果与莱茵衣藻活细胞制剂处理的剂量呈正比.

图 1 不同处理下2个品种(JM182和JC6)小麦幼苗的生长表型 Fig. 1 Phenotypes of wheat seedlings of two varieties (JM182 and JC6) under different treatments

进一步定量分析发现(图 2), 与低剂量Cd胁迫相比, 高剂量Cd胁迫导致小麦幼苗的株高、根长、叶鲜重、叶干重、根鲜重和根干重等指标下降幅度更大. 与小麦品种JM182相比, JC6对Cd胁迫较敏感. Cd100胁迫处理使JC6幼苗的株高、根长、叶鲜重、叶干重、根鲜重和根干重分别降低了15.81%、31.84%、69.61%、59.31%、63.15%和18.70%. 然而, 2种剂量(A1.0和A2.0)的莱茵衣藻活细胞制剂处理均可显著减弱Cd胁迫对JM182和JC6幼苗生长的抑制作用. 其中, 高剂量(A2.0)莱茵衣藻活细胞制剂对高剂量Cd胁迫(Cd100)处理小麦幼苗的促进效果最显著. 与Cd100处理相比, Cd100+A2.0处理使JM182幼苗的株高、根长、叶鲜重、叶干重、根鲜重和根干重分别增加了15.22%、57.86%、12.21%、20.19%、17.50%和16.22%；使JC6幼苗的株高、根长、叶鲜重、叶干重、根鲜重和根干重分别增加了13.38%、34.57%、83.49%、54.94%、44.33%和3.27%. 与对Cd胁迫较敏感的小麦品种JC5相比, 莱茵衣藻活细胞制剂能更有效促进Cd胁迫下JM182小麦幼苗的生长.

1. Cd0, 2. Cd0+TAP, 3. Cd0+A1.0, 4. Cd0+A2.0, 5. Cd50, 6. Cd50+TAP, 7. Cd50+A1.0, 8. Cd50+A2.0, 9. Cd100, 10. Cd100+TAP, 11. Cd100+A1.0, 12. Cd100+A2.0；不同小写字母表示不同处理之间有显著差异(P < 0.05), 下同 图 2 不同处理下2个品种(JM182和JC6)小麦幼苗的生长指标 Fig. 2 Growth parameters of wheat seedlings of two varieties (JM182 and JC6) under different treatments

2.2 莱茵衣藻活细胞制剂促进Cd胁迫下小麦幼苗叶片的光合作用

为探究Cd胁迫和莱茵衣藻活细胞制剂对小苗幼苗光合作用的影响, 分别测定了各处理小麦幼苗叶片光合色素含量(图 3). 2种剂量Cd胁迫均导致2个小麦品种JC6和JM182幼苗的Chla、Chlb和Car含量下降, 且高剂量Cd胁迫的抑制作用更强. 与JM182相比, Cd胁迫减低JC6幼苗光合色素含量的效应更显著. Cd100处理使JC6小麦幼苗Chla、Chlb和Car含量分别降低了30.46%、27.27%和67.47%. 在Cd50和Cd100胁迫下, A1.0和A2.0莱茵衣藻活细胞制剂处理均能提高JM182和JC6小麦幼苗光合色素含量, 其中A2.0莱茵衣藻活细胞制剂对Cd100胁迫下小麦幼苗光合色素的促进效果最显著. 与Cd100处理相比, Cd100+A2.0处理使JM182小麦幼苗的Chla、Chlb和Car含量分别增加21.19%、12.79%和35.16%；使JC6小麦幼苗的Chla、Chlb和Car含量分别增加9.70%、15.68%和46.96%.

图 3 不同处理下2个品种小麦幼苗叶片的光合色素含量 Fig. 3 Photosynthetic pigment contents in wheat seedling leaves of two varieties under different treatments

进一步测定JM182和JC6小麦幼苗的叶绿素荧光参数发现(图 4), Cd胁迫导致小麦幼苗光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光能转换效率Fv/Fm和实际光化学速率Y(Ⅱ)下降, 且JC6小麦幼苗这两个参数下降更显著. Cd100处理使JC6小麦幼苗Fv/Fm和Y(Ⅱ)分别别降低了7.34%和38.08%. 在Cd50和Cd100胁迫下, A1.0和A2.0莱茵衣藻活细胞制剂处理均能提高JM182和JC6小麦幼苗Fv/Fm和Y(Ⅱ)值, 且高剂量莱茵衣藻活细胞制剂对Cd100胁迫下小麦幼苗这两个参数上调效果最显著. 与Cd100处理相比, Cd100+A2.0使JM182小麦幼苗的Fv/Fm和Y(Ⅱ)分别增加9.33%和49.23%, 使JC6小麦幼苗的Fv/Fm和Y(Ⅱ)分别上升4.68%和26.57%. 显然, 与对Cd胁迫较敏感的小麦品种JC6相比, 莱茵衣藻活细胞制剂能更有效促进Cd胁迫下JM182小麦幼苗PSII的活性和光合作用.

图 4 不同处理下2个品种小麦叶片的叶绿素荧光参数 Fig. 4 Chlorophyll fluorescence parameters in wheat seedling leaves of two varieties under different treatments

2.3 莱茵衣藻活细胞制剂提高Cd胁迫下小麦幼苗抗氧化系统的活性

为解析Cd胁迫和莱茵衣藻活细胞制剂对小麦幼苗内源抗氧化系统的影响, 定量测定各处理小麦幼苗的SOD、POD、CAT、GSH、APX的酶活性和Pro含量. 结果显示(图 5), 2种剂量Cd胁迫处理均导致小麦品种JM182和JC6幼苗的SOD、POD、CAT、GSH、APX的酶活性和Pro含量升高, 小麦幼苗表现出氧化应激反应. 添加A1.0和A2.0莱茵衣藻活细胞制剂均可显著增加Cd50和Cd100胁迫下JM182和JC6幼苗的抗氧化酶活性和Pro含量, 其中A2.0莱茵衣藻活细胞制剂对Cd100胁迫下小麦幼苗抗氧化系统激活效应最显著. 与Cd100处理相比, Cd100+A2.0处理使JM182小麦幼苗的SOD、POD、CAT、GSH、APX酶活性和Pro含量分别提高了30.81%、17.16%、11.17%、6.41%、23.23%和25.25%. Cd100+A2.0处理使JC6的SOD、POD、CAT、GSH、APX酶活性和Pro含量分别提高了23.52%、22.12%、11.58%、7.10%、20.62%和28.93%. 可见, 莱茵衣藻活细胞制剂处理能显著激活小麦幼苗抗氧化系统活性, 缓解Cd胁迫对小麦幼苗造成的细胞过氧化伤害.

图 5 不同处理下2个品种小麦叶片的抗氧化系统活性 Fig. 5 Activities of antioxidant system in wheat seedling leaves of two varieties under different treatments

2.4 莱茵衣藻活细胞制剂阻滞Cd胁迫下小麦幼苗对Cd的吸收和富集

为评估施用莱茵衣藻活细胞制剂对Cd胁迫下小麦幼苗吸收、转运和积累Cd的影响, 检测了Cd胁迫及添加藻细胞制剂等处理条件下小麦幼苗根部和茎叶部Cd的含量. 结果显示(图 6), Cd胁迫导致小麦幼苗吸收Cd及在体内积累. 与低剂量Cd胁迫相比, 高剂量Cd胁迫导致JC6和JM182小麦幼苗吸收和积累更多的Cd. 小麦幼苗根部Cd积累量高于茎叶部Cd积累量. 两个小麦品种相比, JM182幼苗的Cd积累量低于JC6幼苗的Cd积累量, 表明与JC6小麦品种相比, JM182为低Cd积累的小麦品种. 添加A1.0和A2.0莱茵衣藻活细胞制剂均可显著减少Cd50和Cd100胁迫下JC6和JM182幼苗的根部和茎叶部Cd积累量. 其中, A2.0莱茵衣藻活细胞制剂对Cd50胁迫下小麦幼苗Cd积累量的减低效果最显著. 与Cd50处理相比, Cd50+A2.0处理使JM182幼苗茎叶部和根部的Cd积累量分别降低了60.28%和31.53%, 使JC6小麦幼苗茎叶部和根的Cd积累量分别减少了76.80%和66.90%. 可见, 莱茵衣藻活细胞制剂阻滞Cd敏感小麦品种(易吸收和富集Cd)JC6幼苗富集Cd效果更显著.

图 6 不同处理下2个品种小麦茎叶部和根部的Cd积累量 Fig. 6 Levels of Cd accumulation in wheat stem-leaf parts and roots of two varieties under different treatments

进一步计算Cd从小麦幼苗根部到茎叶部的迁移系数显示(图 7), 莱茵衣藻活细胞制剂处理能减低Cd从小麦幼苗根部向茎叶部的转运量. 其中, A2.0莱茵衣藻活细胞制剂处理抑制Cd迁移效果更显著. 与Cd50处理相比, Cd50+A2.0处理使JM182和JC6小麦幼苗的Cd从根部到茎叶部的迁移系数分别降低了42.51%和29.71%. 与Cd100处理相比, Cd100+A2.0处理使M182和JC6小麦幼苗的Cd从根部到茎叶部的迁移系数分别降低29.00%和34.38%. 小麦幼苗Cd积累量数据证明, 莱茵衣藻活细胞制剂能显著抑制小麦幼苗对Cd的吸收、转运和富集, 且高剂量莱茵衣藻活细胞制剂处理的效果更好.

图 7 不同处理下Cd从小麦幼苗根到茎叶器官的迁移系数 Fig. 7 Cd migration rate from roots to stem-leaf organs of wheat seedlings under different treatments

2.5 莱茵衣藻活细胞制剂下调Cd胁迫下小麦幼苗重金属转运相关基因的表达

为深入解析微藻活细胞制剂阻滞Cd吸收、转运和富集的分子机制, 进一步应用RT-qPCR检测各处理条件下小麦幼苗与重金属转运相关的内源基因表达量. 结果显示(图 8), 与Cd50和Cd100胁迫的小麦幼苗相比, A1.0和A2.0莱茵衣藻活细胞制剂处理均可显著下调JM182和JC6小麦幼苗TaHMA2、TaHMA3、TaNramp1和TaLCT1等基因的表达量. 其中, A2.0莱茵衣藻活细胞制剂对Cd100胁迫的小麦幼苗这些内源基因表达下调效果最显著. 与Cd100处理相比, Cd100+A2.0处理使JC6幼苗的TaHMA2、TaHMA3、TaNramp1和TaLCT1等基因表达量分别下调了46.39%、34.14%、38.89%和71.00%, Cd100+A2.0处理使JC6幼苗的TaHMA2、TaHMA3、TaNramp1和TaLCT1等基因表达量分别下调了66.65%、15.59%、26.52%和46.93%. 这4个重金属转运相关基因表达数据进一步表明, 莱茵衣藻活细胞制剂可通过下调重金属转运相关基因表达, 进而抑制小麦幼苗对Cd吸收、转运和富集.

图 8 不同处理下小麦幼苗TaHMA2、TaHMA3、TaNramp1和TaLCT1基因的表达量 Fig. 8 Expression levels of TaHMA2, TaHMA3, TaNramp1, and TaLCT1 genes in wheat seedlings of two varieties under different treatments

3 讨论 3.1 莱茵衣藻活细胞制剂缓解Cd胁迫下小麦幼苗生长的抑制作用

植物的生物量通常被作为评估植物非生物胁迫的耐性或抗性的重要指标之一[25]. 本文研究结果表明, Cd处理显著降低了JM182和JC6小麦幼苗的株高、根长和生物量(图 2). 这与Zeshan等[26]研究Cd显著抑制小麦生长, 导致生物量下降的结果一致. JC6小麦品种相比, JM182小麦品种对镉胁迫的抗/耐性较强. 这种抗/耐镉性的差异可能与这两个冬、春小麦品种遗传基础不同有关. Liu等[27]有研究表明, 植物对Cd胁迫的响应不仅在不同物种之间不同, 而且在同物种内不同基因型间也存在显著差异. Cd不是植物必需元素. 当植物吸收累积的Cd超出自身防御能力范围时, 植物就会茎叶发黄、生长缓慢, 甚至出现死亡[28]. 过量的Cd积累还会抑制根尖分生区细胞的有丝分裂和生长, Cd不是植物必需元素. 当植物吸收累积的Cd超出自身防御能力范围时, 植物就会茎叶发黄、且生长缓慢, 甚至出现死亡[29]. 施用莱茵衣藻活细胞制剂则能显著促进镉胁迫下小麦幼苗株高和根系的生长以及生物量的积累, 减少了Cd对小麦的抑制效应(图 2). 这可能是因为莱茵衣藻活细胞制剂本身富含多种营养成分、生物活性物质以及植物激素等, 这些营养和促生物质为小麦幼苗生长提供了所需的多种可直接吸收利用的营养物质, 使得在Cd胁迫下小麦幼苗保持一定生长[30]. 另一方面可能是微藻细胞吸附了Cd, 进而减少了小麦幼苗根系统对Cd的吸收和在幼苗体内积累. 因此, 小麦幼苗Cd损害症状显著缓解.

3.2 莱茵衣藻活细胞制剂增强Cd胁迫下小麦幼苗的光合作用效率

叶绿素是叶绿体发挥功能的核心组分, 其含量不仅反映植物的光合作用效率, 而且也是评估植物抵御非生物胁迫能力的关键生化指标[31]. 叶绿素荧光参数可进一步揭示植物在逆境胁迫下的生理状态和光合作用的调节机制[32]. 本研究结果表明, Cd处理显著抑制了小麦幼苗的光合色素的合成, 并降低了最大光化学效率Fv/Fm和实际光化学效率Y(Ⅱ)的值(图 4). Cd富集会破坏生物膜的完整性, 造成内囊体膜紊乱或溶解, 使合成叶绿素的酶失去骨架而不能正常发挥功能, 从而导致叶绿素含量降低[33]. 此外, Cd2+会替换掉光合作用关键酶1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBisco)内的Mg2+, 改变酶结构和降低酶活性, 导致叶绿素功能丧失, 造成植物光合效率降低[34]. Demiralay等[35]发现Cd胁迫导致玉米叶绿体结构损伤和叶绿素合成的抑制, 这与本研究结果相似. 然而, 本研究结果表明施用莱茵衣藻活细胞制剂可显著提升Cd胁迫下小麦幼苗光合色素含量和叶绿素荧光参数(图 3和图 4), 这可能是莱茵衣藻活细胞制剂为植株提供了必需营养和色素合成的关键元素(N、Mg等)的双重作用以及藻细胞能阻滞Cd被植物吸收和积累, 从而提高了植物的光合效率和促进植物生长[36].

3.3 莱茵衣藻活细胞制剂激活Cd胁迫下小麦幼苗的抗氧化酶系统的活力

抗氧化系统是植物应对重金属胁迫的第一道防线. Cd胁迫引起的活性氧(ROS)过量积累导致细胞氧化还原失衡. 然而, 植物通过调节渗透剂和抗氧化相关物质的生物合成与积累来对抗Cd胁迫诱发的细胞过氧化[37]. 本研究发现, 在Cd胁迫下, 小麦幼苗超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性上升, 以及脯氨酸(Pro)含量增加(图 5). 这表明植物能通过增强其清除ROS的能力来对抗Cd诱导的氧化应激[38]. SOD、POD和CAT是植物清除细胞中ROS最重要的3种酶. SOD是植物自我保护的核心酶, 能将超氧化物转化为O2和H2O2, 而POD将H2O2分解生成无害的H2O和O2-, CAT则是通过催化H2O2的分解H2O和O2, 来避免细胞内过氧化物的积累, 从而起到保护细胞的结构和功能的作用. 特别是GSH和APX能螯合植物体内的重金属离子, 对重金属起解毒作用[39 ~ 42]. Pro作为渗透调节剂, 可以直接参与ROS的消除、维护细胞结构以及抵御光抑制等过程[43]. 更为重要的是, 本研究发现莱茵衣藻活细胞制剂可进一步提高小麦幼苗这些抗氧化系统的活性, 进而减轻Cd胁迫诱发的细胞氧化应激损伤. 这与Ma等[44]对微藻活细胞制剂缓解非生物胁迫下藜麦氧化应激损伤的研究结果相吻合. 微藻活细胞这种激活植物抗氧化系统活性的具体分子机制有待解析.

3.4 莱茵衣藻活细胞制剂阻碍Cd胁迫下小麦幼苗对Cd的积累

虽然Cd等重金属不是植物必需的元素, 但植物能从环境中吸收和积累重金属[45]. 尽管不同物种或不同基因型对Cd等重金属吸收积累水平有差异. 已有研究显示, 不同小麦品种植株吸收、运输和积累重金属的能力不同[46]. Li等[47]研究表明小麦对Cd的积累存在品种依赖性, 在不同品种间具有显著差异. 本研究发现, 不同品种对Cd胁迫敏感性以及Cd富集量存在明显差异(图 6), 在高剂量Cd胁迫下, 春小麦品种JC6的Cd积累量显著高于冬小麦品种JM182. 与JC6相比, JM182是一个低镉积累小麦种质. 莱茵衣藻活细胞制剂能够显著降低小麦幼苗组织中Cd的积累量(图 6), 这可能是因为莱茵衣藻细胞壁可以吸附和固定根际介质中的Cd, 从而减少了Cd向根系的扩散, 降低了根系对Cd的吸收, 从而减少小麦幼苗组织中的Cd积累量.

植物根从根际介质中吸收Cd后, 通过木质部和韧皮部向地上部转运Cd[48]. 为了抵御Cd胁迫, 植物进化出许多参与重金属转运的基因, 这些基因表达的改变, 可影响到植物体内Cd等重金属的迁移和积累[49]. 重金属ATPase (HMA)家族蛋白对Cd有很高的亲和力, 能够转运锌(Zn)、Cd、铅(Pb)、钴(Co)等二价金属离子, 在调控Cd从根系向地上部的转运中起主导作用. 天然抗性相关巨噬细胞蛋白(NRAMP)参与植物体内金属的转运过程的同时还维持植物体内金属离子的平衡. 而低亲和性阳离子转运蛋白(LCT1)则参与Cd的吸收和转运[50 ~ 54]. 本研究发现, Cd胁迫导致小麦TaHMA2、TaHMA3、TaNramp1和TaLCT1的基因表达水平上升(图 8), 进而促进了Cd在植物体内的积累. 与之不同的是, 施用莱茵衣藻活细胞制剂则显著降低了这些重金属转运相关基因的表达(图 8), 从而抑制了Cd的吸收与转运, 有效减少了其在植物体内的迁移和积累(图 6和图 7). 这些基因表达的下调显然有助于缓解Cd胁迫对植物细胞造成的氧化伤害, 促进植物的整体生长和发育.

4 结论

Cd胁迫诱发细胞过氧化反应、抑制小麦幼苗光合作用和生长发育. 施用微藻活细胞制剂则能显著提高光合色素含量、激活细胞抗氧化系统活性和增强小麦幼苗抵御Cd胁迫的能力. 微藻活细胞制剂还可下调小麦幼苗重金属吸收和转运相关基因的表达, 进而抑制Cd从根部向茎叶器官的迁移和富集. 这些发现为建立利用微藻生物肥或生物刺激剂增强小麦等作物对重金属胁迫的抗逆性和阻滞Cd污染的新策略奠定了科学基础.

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