我国是抗生素使用大国, 在畜禽养殖中抗生素使用量占国内全部抗生素使用量50%以上^[1]. 为有效遏制抗生素滥用现象和解决动物源细菌耐药性问题, 《农业农村部公告第194号》指出, 2020年7月1日起, 除中草药外, 饲粮中禁用其他促生长类药物饲料添加剂^[2]. 但目前仍然有大量的抗生素作为治疗用药在养殖中使用, 少数抗生素经过动物代谢分解转化外, 约30%~90%以原药的形式随动物粪尿排出, 造成了畜禽粪便中抗生素残留污染, 进一步引起了粪污中抗生素耐药菌和抗生素耐药基因（antibiotic resistance genes, ARGs）污染问题^[3]. 来源于养殖的ARGs在环境中的扩散和传播, 增加了病原菌获得耐药性的机会, 对生态环境和人类健康造成威胁^[4], 因此养殖源ARGs已成为国际范围内广泛关注的问题.

ARGs的广泛流行是质粒、宿主和环境之间复杂相互作用的结果^[5]. 一方面, 质粒可通过接合的方式传播, 甚至能够跨越生境传播^[6]. 在人类、动物和环境来源的样本的质粒上发现了临床相关的ARGs, 如blaKPC-1或mcr-1, 这有力地表明, 接合型质粒对于ARGs在不同生境间的传播至关重要^[7]. 另一方面, 畜禽粪便是耐药菌、ARGs和潜在人类病原菌传播的重要储存库, 是细菌通过水平基因转移交换遗传物质的媒介^{[8, 9]}. 接合型质粒在跨越不同质粒类型以及种属水平间的ARGs基因水平转移中起着核心作用^{[10, 11]}, 养殖粪污中风险最高的ARGs通常是接合型质粒携带的. 然而, 畜禽粪便中质粒介导的ARGs的赋存情况和转移特征尚不明确. 因此, 识别养殖粪污中典型高风险可移动耐药基因及其扩散机制对进一步控制养殖源耐药菌和ARGs传播具有重要意义. 为分析不同养殖动物粪污中高风险ARGs的特征, 本研究通过对北京、河北和宁夏等地养殖粪污中的接合型耐药质粒（conjugative antibiotic-resistant plasmids, CARP）进行实验捕获, 进而对耐药接合子进行高通量测序分析, 获得养殖粪污中CARP上ARGs类型及其质粒类型分布特征, 结合耐药表型分析, 获得典型养殖粪污中CARP及其耐药特征, 以期为进一步有效控制养殖源高风险ARGs的传播提供科学基础.

在北京、河北和宁夏等地区, 共采集了35个规模化畜禽养殖场的样品, 包括18个蛋鸡粪样、8个肉鸡粪样和9个猪粪样. 采取五点混合取样法, 每份样品混合后放入无菌样品袋, 低温运输至实验室, 4 ℃保存备用.

接合转移实验受体菌株：采用实验室前期构建的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）基因标记的大肠杆菌E. coli NK5449：：sGFP2菌株（EP2）, 该菌株无质粒, 具有利福平（Rif^R）、萘啶酮酸（Nal^R）和氯霉素（Cam^R）抗性, 在GFP激发光源下发绿色荧光.

培养基：LB液体培养基（g·L^-1）：胰蛋白胨10.0, 酵母粉5.0, 氯化钠10.0, pH值7.0±0.1；TSB液体培养基（g·L^-1）：胰酪胨17.0, 大豆木瓜蛋白酶消化物3.0, 氯化钠5.0, 磷酸氢二钾2.5, 葡萄糖2.5, pH值7.3±0.2；R2A琼脂培养基（g·L^-1）：蛋白胨0.5, 酪蛋白水解物0.5, 酵母浸出粉0.5, 葡萄糖0.5, 可溶性淀粉0.5, 磷酸氢二钾0.3, 丙酮酸钠0.3, 无水硫酸镁0.024, 琼脂15.0, pH值7.2±0.2；MH琼脂培养基（g·L^-1）：牛肉粉6.0, 酸水解酪蛋白17.5, 可溶性淀粉1.5, 琼脂15.0, pH值7.3±0.2.

受体菌制备：将受体菌EP2接种到含有利福平（100 mg·L^-1）、萘啶酮酸（50 mg·L^-1）和氯霉素（15 mg·L^-1）的LB液体培养基中于35 ℃过夜培养. 将培养液5 000 g离心5 min, 收集沉淀, 再用磷酸缓冲液（PBS）重悬菌体得到受体菌悬液.

养殖粪便供体菌群制备：称取10 g粪便样品加入到含有90 mL 10%的TSB液体培养基的三角瓶中, 28 ℃、180 r·min^-1振荡培养2 h得到粪便样本悬浮液.

接合转移实验：混合1 mL受体菌株EP2溶液和4 mL粪便样本悬浮液, 5 000 g离心5 min后用100 µL LB液体培养基重悬, 点加在贴于R2A平板的硝化纤维素滤膜（0.22 µm孔径）上, 28 ℃过夜培养. 再用PBS洗脱并重悬菌体, 梯度稀释后, 涂布于含有利福平（100 mg·L^-1）、萘啶酮酸（50 mg·L^-1）、氯霉素（15 mg·L^-1）、放线菌酮（100 mg·L^-1）和相应筛选用的抗生素[磺胺甲唑（256 mg·L^-1）、庆大霉素（20 mg·L^-1）、头孢噻肟（64 mg·L^-1）和四环素（16 mg·L^-1）]之一的MH琼脂平板上, 在28 ℃下培养2 d. 能够在利福平、萘啶酮酸、氯霉素和放线菌酮这4种抗生素生长, 且在GFP激发光源下呈现绿色菌落的为受体菌；根据养殖源易残留和人畜共用等抗生素特性, 选择磺胺甲唑、庆大霉素、头孢噻肟和四环素进行耐药接合子筛选. 在加有指定筛选抗生素平板上生长, 且可在GFP激发光源下呈现绿色的菌落即为指定抗生素耐药的接合子（transconjugants）；通过平板计数获得耐药接合子的数量, 进一步挑取单菌落进行分离纯化, 获得不同耐药特征的接合子. 接合频率=接合子数量/受体菌数量.

收集纯培养后接合子菌泥, 利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取, 并进行DNA检测及纯化, 随机打断构建文库, 送诺禾致源公司用二代IlluminaPE150进行基因组测序. 利用kneaddata软件将原始数据质控后过滤宿主——大肠杆菌受体菌的染色体基因组序列, 再质控后数据利用SPAdes进行拼接. 使用Prokka v1.14.5软件（https://github.com/tseemann/prokka）对质粒基因组进行基因注释^[12]. 将注释的基因使用salmon（v 0.13.1）软件进行相对定量后, 采用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA）进行层级聚类分析, 使用R语言作聚类分析树可视化不同接合子菌株的相似或差异程度, 对获得的接合子进行基因组水平去冗余. 使用PlatmidFinder 2.1^[13]对质粒测序结果的复制子进行筛查, 选取相似性高于95%且覆盖率大于85%的复制子进行分型. 将注释后序列比对CARD（comprehensive antibiotic research database）数据库, 选取相似性高于85%的耐药基因进行后续分析.

采用药敏纸片扩散法（Kirby-Bauer法）测定捕获的接合型耐药质粒对恩诺沙星（enrofloxacin, ENR）、环丙沙星（ciprofloxacin, CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin, LEV）、诺氟沙星（norfloxacin, NOR）、链霉素（streptomycin, S）、阿米卡星（amikacin, AK）、庆大霉素（gentamicin, CN）、头孢哌酮（cefoperazone, CFP）、头孢西丁（cefoxitin, FOX）、氨苄西林（ampicillin, AMP）、四环素（tetracycline, TET）和复方新诺明（trimethoprim/ sulfamethoxazole, SXT）这12种抗生素的药物敏感性. 以模式菌株E. coli MG1655作为质控菌, 根据美国临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute of America, CLSI）的标准判断结果.

将接合子菌株使用生理盐水制成菌悬液, 并调整至0.5麦氏浊度. 使用无菌棉签蘸取菌悬液均匀涂抹在MH琼脂平板表面, 加入药敏纸片, 将平板倒置于35 ℃培养箱中培养18 h, 并测量抑菌圈直径, 根据抑菌圈的大小, 将耐药质粒抗菌药物敏感性判定为耐药（R）、中敏（I）或敏感（S）.

畜禽粪便样品中耐药质粒捕获实验结果表明, 在磺胺甲唑、四环素和头孢噻肟耐药的培养基上蛋鸡粪的平均接合转移频率均为最高, 其最高接合转移频率分别达到2.8×10^-4、5.1×10^-4和1.3×10^-5；在庆大霉素培养基上, 最高的接合转移频率出现在猪粪样品中, 达到5.8×10^-5（表 1）. 在耐药接合子的检出率方面, 蛋鸡粪便样品中磺胺甲唑、四环素和头孢噻肟耐药接合子检出率均为最高, 其中磺胺类耐药的接合子在一半以上的蛋鸡场中能检出；在庆大霉素选择压力下, 3种动物的接合子检出率相近, 其中肉鸡样品中庆大霉素耐药接合子检出率最高. 说明养殖源接合型耐药质粒的转移情况和流行情况大致相同, 即蛋鸡粪便样品中CARP在环境中具有最高的转移能力和流行率. 此外, 捕获的4种抗生素耐药的接合型质粒分布特征不同, 磺胺甲唑耐药捕获53株, 占比为42%（53/125）；四环素耐药捕获41株, 占比为33%（41/125）；说明磺胺类和四环素类CARP在动物粪便中更易通过接合作用转移, 氨基糖苷类的CARP向肠杆菌转移的能力较弱[图 1（a）].

表 1 (Table 1)

表 1 耐药质粒从粪便到受体菌的接合转移频率1） Table 1 Conjugative frequency of antibiotic resistance plasmids from manure to recipient 抗生素类型 蛋鸡（n=18） 肉鸡（n=8） 生猪（n=9） 接合转移频率 流行率/% 接合转移频率 流行率/% 接合转移频率 流行率/% 最大值 平均值 最大值 平均值 最大值 平均值 磺胺甲唑 2.8×10-4 1.8×10-5 55.56 1.4×10-5 7×10-6 25.00 4.0×10-5 4.9×10-6 22.22 盐酸四环素 5.1×10-4 3.3×10-5 44.44 3.2×10-6 6.8×10-7 25.00 9.5×10-5 2.2×10-5 44.44 头孢噻肟 1.3×10-5 1.3×10-6 27.78 4.1×10-7 5.1×10-8 12.50 1.9×10-7 2.1×10-8 11.11 庆大霉素 1.8×10-5 1.1×10-6 11.11 4.0×10-8 5×10-9 12.50 5.8×10-5 6.4×10-6 11.11 1）n为样品数量

表 1 耐药质粒从粪便到受体菌的接合转移频率1） Table 1 Conjugative frequency of antibiotic resistance plasmids from manure to recipient

图 1

Fig. 1

图 1 接合型耐药质粒（CARP）分布特征 Fig. 1 Distribution characteristics of conjugated antibiotic-resistant plasmids (CARP)

与蛋鸡粪便不同[图 1（b）], 肉鸡和生猪粪便中4种抗生素耐药的接合型质粒分布特征相似[图1（c）和1（d）], 后两者的磺胺甲唑耐药接合子占比高于四环素类, 而头孢噻肟和庆大霉素耐药的占比较少. 蛋鸡粪便样品中磺胺甲唑耐药接合子（28%）占比低于四环素类（38%）, 而头孢噻肟和庆大霉素耐药的接合子占比更多, 分别为25%和9%. 总体而言, 虽然磺胺和四环素的耐药质粒在动物粪便中更易向受体菌转移, 但是不同养殖动物粪便中, 4种抗生素耐药的接合型质粒分布特征有所不同, 这可能是由于畜禽动物肠道微生物多样性受品种、日龄、养殖环境、饲喂方式、抗生素使用方式及健康状态等多种因素影响, 因此不同动物粪便的质粒宿主群落组成有较大差异, 进而导致接合型质粒在不同动物肠道中的分布特征具有一定偏好性^{[14, 15]}.

对养殖粪便中捕获的125株耐药接合子分析质粒上携带的ARGs进行注释, 一共获得了65种ARGs, 分属于氨基糖苷类、β-内酰胺类、苯丙酮类、大环内酯类、氟喹诺酮类、四环素类、甲氧苄啶类和磺胺类等（图 2）. 最常见的耐药基因分别是苯丙醇类耐药基因floR、氨基糖苷类aac（6′）-lb7和β-内酰胺类TEM-150, 125株接合子的携带率依次为98%、94%和87%. 此外, 来自肉鸡养殖场对四环素耐药的接合子T-LP8-1含有41个耐药基因, 是携带ARGs数目最多的接合型质粒.

图 2

Fig. 2

1. T-2D-2, 2. T-NRJA-2, 3. T-JLD-5, 4. T-2D-3, 5. T-2D-5, 6. T-JLX-3, 7. T-JLX-4, 8. C-NDJB-3, 9. S-10D-4, 10. T-JLX-5, 11. S-NZB-1, 12. C-NRJB-1, 13. G-NRGB-1, 14. S-NK-1, 15. C-NK-2, 16. T-NRJA-5, 17. S-NRJA-2, 18. C-GZC-1, 19. C-NK-1, 20. C-10D-3, 21. T-GZB-1, 22. S-NZB-2, 23. SNZB-3, 24. C-YS-3, 25. T-GZC-2, 26. T-JLX-2, 27. C-10D-1, 28. C-10D-2, 29. T-JYDJ-1, 30. G-2D-2, 31. T-2D-1, 32. C-JLD-3, 33. G-2D-1, 34. S-10D-5, 35. T-JLD-4, 36. C-JLX-1, 37. C-YS-4, 38. C-YS-5, 39. T-SY-1, 40. T-JLD-2, 41. C-JLD-5, 42. T-2D-4, 43. S-NK-5, 44. C-JLD-2, 45. S-NK-2, 46. T-GZC-1, 47. T-SY-5, 48. T-SY-2, 49. T-SY-4, 50. T-SY-3, 51. C-NK-5, 52. S-NK-4, 53. C-YS-2, 54. S-NK-3, 55. C-JLD-4, 56. C-NK-3, 57. S-MDDJ-1, 58. T-JLD-3, 59. S-RKDJ-3, 60. S-10D-2, 61. S-RKDJ-4, 62. S-RKDJ-5, 63. S-RKDJ-1, 64. S-10D-1, 65. S-RKDJ-2, 66. C-NDJB-2, 67. C-NDJB-5, 68. S-NDJB-1, 69. T-JLD-1, 70. C-NDJB-1, 71. T-NRJA-4, 72. S-10D-3, 73. T-NZA-4, 74. T-NZA-2, 75. T-NZA-5, 76. T-NZA-3, 77. S-LP5-1, 78. S-LP1-3, 79. T-LP8-1, 80. G-LP3-1, 81. S-LP3-3, 82. S-LP3-1, 83. S-LP3-4, 84. S-LP3-2, 85. S-LP3-5, 86. S-LP4-4, 87. S-LP4-5, 88. S-XCZRJ-22, 89. S-XCZRJ-13, 90. S-XCZRJ-17, 91. G-JLQ-1, 92. G-JLQ-5, 93. G-JLQ-4, 94. G-JLQ-2, 95. G-JLQ-3, 96. T-JLQ-3, 97. T-JLQ-4, 98. T-LP4-3, 99. S-LP4-2, 100. T-LP4-2, 101. T-LP4-5, 102. S-LP4-3, 103. T-LP4-4, 104. S-LP4-1, 105. T-LP4-1, 106. T-JLQ-1, 107. S-JLQ-5, 108. T-JLQ-2, 109. S-JLQ-2, 110. S-JLQ-4, 111. S-XCZRJ-7, 112. S-XCZRJ-15, 113. S-XCZRJ-14, 114. S-XCZRJ-21, 115. S-XCZRJ-5, 116. S-XCZRJ-20, 117. S-XCZRJ-10, 118. S-XCZRJ-11, 119. S-XCZRJ-8, 120. S-XCZRJ-23, 121. S-XCZRJ-12, 122. S-XCZRJ-19, 123. S-JLQ-3, 124. S-JLQ-1, 125. T-JLQ-5；A1. AAC（6'）-IIa, A2. aadA8, A3. MexD, A4. APH（3'）-VI, A5. dfrA22, A6. APH（3'）-IIa, A7. mefB, A8. tetM, A9. dfrA1, A10. DHA-1, A11. cfrA, A12. lnuF, A13. APH（4）-Ia, A14. linG, A15. cmlA6, A16. FosA3, A17. dfrA14, A18. QnrS2, A19. arr-8, A20. dfrA16, A21. tet（D）, A22. QnrB17, A23. Erm（33）, A24. QnrA1, A25. aadA5, A26. Erm（42）, A27. aadA16, A28. MCR-1, A29. CTX-M-65, A30. oqxA, A31. sul3, A32. tet（B）, A33. LAP-2, A34. dfrA17, A35. oqxB, A36. rmtB, A37. dfrA12, A38. dfrA27, A39. AAC（6'）-Ib-cr, A40. OXA-1, A41. catB3, A42. AAC（3）-IId, A43. mphA, A44. APH（3'）-Ia, A45. AAC（3）-IV, A46. mphE, A47. msrE, A48. arr-2, A49. sul1, A50. aadA2, A51. tet（G）, A52. aadA15, A53. CARB-3, A54. OXA-10, A55. cmlA5, A56. QnrS1, A57. CTX-M-55, A58. sul2, A59. tet（A）, A60. APH（3″）-Ib, A61. APH（6）-Id, A62. ANT（3''）-IIa, A63. TEM-150, A64. AAC（6'）-Ib7, A65. floR 图 2 不同耐药表型接合型质粒上ARGs亚型的分布情况 Fig. 2 Distribution of ARGs subtypes on plasmids with different antibiotic resistance phenotypes

同时观察到2/3（49/65）的ARGs共同从肉鸡、蛋鸡和生猪粪源中检出, 其中属于氨基糖苷类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类和甲氧苄啶类的ARGs占共有ARGs的64%（图 3）. 以上ARGs在不同养殖动物的畜禽粪便中均能检出, 说明其在养殖环境中广泛存在并易传播流行.

图 3

Fig. 3

（a）中数值表示不同样品ARGs的数量, 49为共有的ARGs数量；（b）为共有ARGs的分布类型 图 3 动物粪便中接合型质粒上共有的ARGs Fig. 3 Common ARGs on conjugate plasmids in animal manure

此外, 不同抗生素耐药接合子在携带ARGs数量和种类上均有明显差异, 平均每株接合子中检出19.9个ARGs（2 482/125）. 其中对头孢噻肟耐药的22株接合子中, 平均有19.5个耐药基因（430/22）, 并且CTX-M-55和TEM-150这2种β-内酰胺类耐药基因检出率为100%, 这是头孢噻肟耐药接合子对头孢噻肟高度耐药的主要原因；对磺胺甲唑耐药的53株接合子菌株中, 平均有20.3个耐药基因（1 074/53）, 每个菌株至少含有一个磺胺类耐药基因sul1、sul2或sul3；对庆大霉素耐药的9株接合子菌株中, 平均23个耐药基因（207/9）, 氨基糖苷类耐药基因aac（6′）-Ib7、APH（3''）-Ib和aph（6）-Id为共有基因, 携带率为100%, 并且5株接合子中检测到AAC（3）-IV；对四环素耐药的41个接合子菌株中, 平均18.8个耐药基因（771/41）, 每个菌株至少含有一个四环素耐药基因tet（A）、tet（G）或tet M. 以上基因会导致抗生素失活从而使宿主菌株产生耐药性^[16].

根据共有基因的注释特征对125株接合子进行聚类去冗余后, 获得64株ARGs类型不同的耐药大肠杆菌接合子, 对其进行药敏试验, 结果显示, 64株接合子大多数为多重耐药菌株, 50株（50/64, 78.13%）接合子至少对5种抗生素耐药, 其中肉鸡粪便中有8株（8/12, 66.67%）接合子, 蛋鸡粪便中有13株（13/41, 31.7%）接合子均能够耐受10种抗生素；生猪粪便中有8株（8/11, 72.73%）接合子对至少10种抗生素耐药（图 4）. 虽然蛋鸡粪中接合型耐药质粒检出率高, 但其多重耐药程度要弱于肉鸡和生猪粪.

图 4

Fig. 4

1.T-NZA-2, 2. S-NZB-2, 3. S-NZB-1, 4. T-NZA-3, 5. T-NZA-5, 6. C-NDJB-2, 7. C-YS-3, 8. S-LP3-1, 9. G-LP3-1, 10. S-LP3-1, 11. S-JLQ-5, 12. G-JLQ-2, 13. G-JLQ-5, 14. S-XCZRJ-8, 15. S-XCZRJ-5, 16. XCZRJ-19, 17. XCZRJ-15, 18. XCZRJ-13, 19. S-XCZRJ-12, 20. S-XCZRJ-10, 21. S-XCZRJ-11, 22. S-LP4-1, 23. S-LP4-4, 24. C-JLX-1, 25. T-JLQ-5, 26. T-JLQ-3, 27. T-JLQ-1, 28. S-JLQ-1, 29. S-JLQ-3, 30. T-LP8-1, 31. T-LP4-3, 32. T-LP4-4, 33. S-RKDJ-1, 34. S-RKDJ-5, 35. S-10D-3, 36. T-2D-1, 37. T-NRJA-2, 38. T-JLD-2, 39. T-JLX-3, 40. S-LP5-1, 41. T-JYDJ-1, 42. T-JLD-1, 43. T-GZB-1, 44. T-2D-2, 45. S-NRJA-2, 46. T-GZC-1, 47. S-MDDJ-1, 48. C-10D-1, 49. C-NK-5, 50. T-SY-5, 51. S-NK-5, 52. S-NK-2, 53. S-NK-1, 54. C-NK-1, 55. C-NK-3, 56. S-NDJB-1, 57. T-SY-4, 58. C-YS-1, 59. T-SY-1, 60. C-GZC-1, 61. C-JLD-3, 62. C-NDJB-1 63. S-10D-1, 64. T-NRJA-4 图 4 接合子抗生素耐药表型热图 Fig. 4 Heatmap of antibiotic resistance phenotype of transconjugants

总体上, 在用于耐药表型实验的12种抗生素中, 养殖粪便中捕获的接合子对β-内酰胺类的氨苄西林耐药率最高（93.75%）, 其次为四环素（89.06%）、链霉素（87.50%）、头孢哌酮（75%）、环丙沙星（68.75%）、恩诺沙星（67.19%）、复方新诺明（65.63%）、左氧氟沙星（57.81%）、诺氟沙星（50%）、庆大霉素（48.44%）和头孢西丁（39.06%）, 对氨基糖苷类的阿米卡星（26.56%）的耐药率最低.

复制子是质粒中唯一普遍存在的遗传单元, 但质粒复制子中并不存在普遍保守的基因, 复制子遗传元件的组成和结构复杂多样^[17]. 因此, 复制子是质粒系统分类中唯一具有普遍性和通用性的遗传标记^[18]. 通过PlasimidFinder数据库比对分析, 125株接合子中有85株鉴定出21种不同的复制子类型, 剩下40株接合子在已有数据库中未鉴定到复制子[图 5（a）]. 其中最常见的复制子类型为IncFIB（AP001918）（38/85, 44.71%）, 其次是IncFII（pHN7A8）（38/85, 44.71%）、IncFII（30/85, 35.29%）和IncHI2（14/85, 16.47%）. 64%（54/85）的菌株至少包含两个及以上不同的质粒复制子, 其中同时含IncFII（pHN7A8）和IncFII复制子的菌株比例较高（26/85, 30.6%）, 而5.9%（5/85）的菌株同时含有IncFIB（AP001918）、IncHI2和IncHI2A复制子. 其中IncHI2和IncHI2A是IncH型质粒中最为常见的低拷贝广宿主类型, 常常携带多种耐药基因, 与oqxAB、blaCTX-M、blaCMY、blaNDM、blaVIM、blaIMP和fosA3等多种耐药基因的传播有关^[19].

图 5

Fig. 5

（a）不同耐药表型, （b）不同动物粪便, 从左到右依次为蛋鸡、肉鸡和生猪；1. T-NZA-2, 2. T-NZA-4, 3. T-NZA-5, 4. S-NZB-2, 5. S-NZB-3, 6. T-NZA-3, 7. T-LP8-1, 8. S-NDJB-1, 9. S-MDDJ-1, 10. S-LP1-3, 11. S-NZB-1-1, 12. S-MDDJ-1-1, 13. C-NDJB-2, 14. C-NDJB-5, 15. T-GZB-1, 16. C-NRJB-1, 17. G-NRJB-1, 18. C-YS-3, 19. C-YS-4, 20. S-LP5-1, 21. C-10D-3, 22. C-10D-1, 23. C-10D-2, 24. T-GZC-2, 25. C-JLX-1, 26. T-SY-1, 27. C-YS-5, 28. C-JLD-5, 29. C-NDJB-1, 30. T-2D-4, 31. G-2D-1, 32. S-RKDJ-4, 33. T-JYDJ-1, 34. T-NRJA-5, 35. S-RKDJ-2, 36. S-10D-5, 37. S-NRJA-2, 38. S13A5, 39. T-NRJA-4, 40. T-NRJA-2, 41. T-JLX-5, 42. T-JLX-4, 43. T-JLX-3, 44. T-JLX-2, 45. T-JLD-5, 46. T-JLD-4, 47. T-JLD-3, 48. T-JLD-2, 49. T-JLD-1, 50. T-2D-5, 51. T-2D-3, 52. T-2D-2, 53. T-2D-1, 54. T-2D-1-1, 55. S-10D-3, 56. G-2D-2, 57. S-10D-2, 58. G9A1, 59. S-NZB-1-2, 60. T-SY-5-2, 61. T-SY-5, 62. T5A4, 63. C-GZC-1, 64. T-SY-4, 65. T-SY-3, 66. T-SY-2, 67. T-SY-5-1, 68. S-RKDJ-3, 69. S-NK-5, 70. S-NK-4, 71. S-NK-3, 72. S-NK-2, 73. S-NK-1, 74. S_MDDJ-1-2, 75. C-YS-2, 76. C-NK-5, 77. C-NK-3, 78. C-NK-2, 79. C-NK-1, 80. C-NDJB-3, 81. C-JLD-4, 82. C-JLD-2, 83. C-JLD-3, 84. G3A2-1, 85. T-GZC-1；A1. IncFIA（HI1）, A2. IncFIB（AP001918）, A3. IncFIB（K）（pCAV1099-114）, A4. IncFIB（K）（pCAV1099-114）, A5. IncFIC（FII）, A6. IncFII（pHN7A8）, A7. IncFII, A8. IncFII（29）, A9. IncHI2, A10. IncHI2A, A11. IncI1-I（Alpha）, A12. IncI（Gamma）, A13. IncI2, A14. IncN, A15. IncX1, A16. IncR, A17. Col156, A18. Col440I, A19. p0111, A20. pKPC-CAV1321, A21. repB（R1701） 图 5 养殖场接合型质粒的复制子分布特征 Fig. 5 Replicon distribution of conjugate plasmids in farms

3种畜禽粪便捕获的接合子中均检出的复制子类型为IncFIB（AP001918）、IncFII（pHN7A8）、IncFII、IncHI2、IncHI2A、IncN和IncX1, 其中IncHI2、IncHI2A和IncN均为广宿主质粒, 说明这3种质粒在畜禽养殖中广泛流行. 蛋鸡粪便的接合子共检出10种类型的复制子, 其中IncF型质粒占比最多（78%）[图 5（b）]；肉鸡养殖粪便中, 共检出10种类型的复制子, 流行率最高的为IncF型（65%）；生猪粪便中, 共检出17种类型的复制子, 主要流行为IncF型（36%）, IncH型（26%）、IncX型（9%）、Col质粒（9%）、IncI型（7%）和IncR型（7%）. 生猪养殖场中复制子类型多样性明显高于其他养殖场, 猪粪中有4株接合子均检出广宿主范围的IncR质粒, 相关研究表明IncR质粒可携带多种类别的抗生素耐药基因, 包括：β-内酰胺类、磺胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素和甲氧苄啶类^[20].

粪肥是农业种植中常用的有机肥料, 有研究表明, ARGs在接合型质粒的介导下可从种植土壤向周边水体甚至植物体内转移和传播^{[21 ~ 23]}. ARGs还能进一步随食物链富集和转移影响人体肠道菌群, 对人类健康构成潜在威胁^[24]. 因此, 明确养殖粪污中高风险ARGs的特征有利于进一步控制养殖源耐药菌和ARGs的传播. 本研究对来自不同养殖场畜禽粪便样品进行接合型耐药质粒（CARP）捕获实验, 调查了粪便中CARP的分布情况及转移频率. 结果表明, 不同养殖动物源CARP流行情况有一定差异, 其中蛋鸡粪样中CARP具有更高的转移能力和流行率, 但其多重耐药程度要弱于肉鸡和猪粪, 猪粪中复制子类型和每株接合子上携带的ARGs数量明显高于其他养殖场. 这可能与不同畜禽动物肠道耐药微生物特征有关, 一方面在实际养殖过程中, 与蛋鸡相比, 养殖食品动物（肉鸡和生猪）会添加更多种类及更高含量的抗生素, 因此肠道微生物中有更多的多重耐药菌^{[25, 26]}及多重耐药基因^[27], 从而导致肉鸡和生猪粪中捕获的接合子更容易有多重耐药能力. 另一方面, 接合型耐药质粒在环境中会更倾向于在低丰度、高转移频率的中间宿主菌中存活^[5], 而蛋鸡养殖日龄（300 d）远高于肉鸡（45 d）和生猪（120 d）, 蛋鸡肠道菌群的复杂程度也高于食品动物, 更有利于接合型耐药质粒在稀有菌株中得以保留^{[28, 29]}, 因此具有更高的转移频率. 虽然不同养殖源的ARGs有一定差异, 但是49个ARGs在3种畜禽粪便均能检出, 主要属于氨基糖苷类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类和甲氧苄啶类（图 3）, 从耐药表型上看, 养殖源接合子对β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、头孢烯类、氟喹诺酮类和磺胺类药物耐药率依次为95.31%、89.06%、87.5%、78.13%、68.75%和65.63%, 说明以上ARGs在养殖环境中分布较广. 王永强等^[30]对20株犊牛腹泻大肠杆菌进行耐药基因检测, 发现氨基糖苷类、β-内酰胺类和氟喹诺酮类耐药基因检出率同样最高, 这可能与畜牧业中抗生素的使用情况有关. 因此, 在抗生素使用中, 应分析当地耐药流行情况合理选用.

质粒主要通过接合的方式进行传播, 位于可移动质粒上的ARGs会随着质粒的转移进行传播, 增加了ARGs的传播风险. 在养殖畜禽粪便中, 通过4种抗生素耐药平板筛选, 人们发现磺胺和四环素耐药性质粒检出率和接合转移频率均较高. 对磺胺甲唑耐药接合子中, 耐药基因为sul1、sul2和sul3, 耐药机制是通过置换抗生素靶点产生耐药性^{[31 ~ 34]}. 四环素耐药接合子中耐药基因主要为tet（A）、tet（G）和tetM, 其中tet（A）和tet（G）通过编码抗生素外排泵（efflux pump, EFP）^[35], tet（M）则通过编码的核糖体保护蛋白（ribosomal protective protein, RPP）对四环素产生耐药性^[36]. Dang等^[37]从城区河流底泥中分离出26种不同类型的接合质粒, 其中对四环素和磺胺耐药性最普遍, 磺胺耐药基因为sul1和sul2, 四环素为tet（A）和tet（G）. 说明动物粪便和河底污泥中对磺胺和四环素耐药的接合型质粒中的主要ARGs类型相似, 其传播扩散可能有很强的关联性. 此外, 动物粪便中还检出了tetM, 由于动物肠道环境比河水环境有着更高浓度的抗生素, 抗生素选择压力下仅有外排泵的ARGs并不利于肠道菌的存活, 因此其四环素类耐药机制更为多样.

质粒作为ARGs在生境内和生境之间的细菌相互传播的重要分子元件, 一旦ARGs嵌入像IncP和IncQ这样的广宿主质粒中, ARGs就可能转移到包括潜在病原菌的不同系统发育分支的细菌中^{[38, 39]}. 本研究64%的样本含有两个及以上复制子, 主要为IncF、IncH和IncN. IncF是低拷贝可接合型质粒, 其宿主仅限于肠杆菌^[20], 是畜禽养殖场中常见的质粒复制子类型. 此外, 不同养殖场中复制子类型有所差异, 生猪养殖场中广宿主质粒占比最高, 为34.5%；蛋鸡和肉鸡场中广宿主质粒占比分别为16.8%和20%. 同时观察到不同养殖源的ARGs有一定差异, 其中蛋鸡养殖场中平均每株接合子检出19.5个耐药基因（1 539/79）；肉鸡养殖场中每株接合子平均有16.6个耐药基因（366/22）；生猪养殖场中平均每株接合子检出24个耐药基因（577/24）, 与其他养殖场相比数量最多, 这可能与其携带的广宿主范围的质粒有关. 从肉鸡养殖场四环素耐药平板筛选的接合子T-LP8-1含有41个耐药基因, 数目最多, 包括氟喹诺酮类耐药基因：oqxA和oqxB, 氨基糖苷类耐药基因：aac（6′）-Ib-cr, 氯霉素类耐药基因：catB3, 磺胺类耐药基因：sul1、sul2和sul3等. 对T-LP8-1质粒复制子类型进行鉴定, 发现包含IncHI2、IncHI2A、IncN1、IncFIA（HI1）和repB（R1701）多种类型. 有研究报道, IncHI2质粒是喹诺酮耐药基因oqxAB在中国的动物源和临床来源沙门氏菌中传播的主要载体^[40], 该质粒上还携带其它耐药基因, 如blaCTX-M-14, 或aac（6′）-Ib-cr、catB3、blaOXA-1、sul2和sul3等^{[41, 42]}. 这说明接合子T-LP8-1的多重耐药基因可能跟其质粒复制子类型多样有关, 可以在多样的宿主菌中转移以获取不同的ARGs, 并且广宿主的接合型质粒有可能携带更多的ARGs, 很大程度上增加了ARGs的传播风险.

抗生素耐药基因（ARGs）在细菌中广泛存在. 然而, 并不是所有的ARGs都对公众健康构成严重威胁. 导致病原体产生多重耐药性的ARGs列为一级高风险, 其特征为：由可移动基因元件携带, 能扩大其宿主范围并适应广泛的生态位^[43]. 125株接合子中共检出10个分属于6种不同类型的高风险ARGs, 分别为氨基糖苷类耐药基因：AAC（6'）-Ib7, β-内酰胺类：CTX-M-55, 氟喹诺酮类：qnrA1, 多黏菌素类：mcr-1, 四环素类：tetM, 甲氧苄啶类：dfrA1、dfrA12、dfrA14和dfrA17, 其中AAC（6'）-Ib7检出率最高为93.60%（117/125）. 共12株接合子中检出5个及以上高风险ARGs, 猪场中3株（3/24, 12.5%）接合子中均检出广宿主范围复制子, 其中接合子S-NZB-3中检出6个高风险ARGs, 包含广宿主质粒复制子IncHI2、IncHI2A和IncR；蛋鸡场中有7株（7/79, 8.86%）接合子42.86%（2/7）检出广宿主范围质粒复制子IncHI2和IncHI2A. 肉鸡场中有2株（2/22, 9.09%）, 其中1株接合子检出广宿主范围质粒复制子IncN、IncHI2和IncHI2A. 人们发现猪场中广宿主范围的复制子类型和占比高于其他养殖场, 且同时检出多个高风险ARGs的接合子比例也最高, 说明广宿主接合型质粒携带高风险ARGs是促使其传播的主要风险. 因此, 识别养殖源中那些具有重大潜在危害公共健康的抗生素ARGs, 对于进一步控制耐药菌和ARGs传播方面具有重要意义.

另外, 即使耐药表型一致的接合子在不同养殖动物中也会由不同的耐药机制的ARGs所控制. 选取均由磺胺甲唑选择性平板捕获, 分别来自肉鸡、蛋鸡和生猪粪便的多重耐药接合子S_JLQ_5、S_XCZRJ_5和S_NZB_2对比分析, 以上3株接合子在药敏实验中对六大类抗生素表现为耐药（表 2）. 进一步分析其携带的ARGs, 发现肉鸡粪接合子S_JLQ_5检测到九大类19个耐药基因, 主要为氨基糖苷类（4个, 36.8%）、β-内酰胺类（3个, 15.8%）、四环素类（2个, 10.5%）和苯丙醇类（2个, 10.5%）；蛋鸡粪接合子S_XCZRJ_5检测到七大类14个耐药基因, 主要为氨基糖苷类（4个, 28.6%）、β-内酰胺类（3个, 21.4%）和苯丙醇类（3个, 21.4%）；猪粪接合子S_NZB_2检测到十大类32个耐药基因, 主要为氨基糖苷类（11个, 34.4%）、β-内酰胺类（4个, 12.5%）、磺胺类（3个, 9.4%）和氟喹诺酮类（9.4%）. 以上3株接合子均检测到了磺胺类耐药基因sul1, 由于磺胺是20世纪30年代以来应用最早和最广泛的抗生素之一, sul1已经在环境中广泛存在^[37]. 值得注意的是, 虽然这3株接合子对一些抗生素耐药表型相同, 但是ARGs却不同, 例如接合子S_JLQ_5对氟喹诺酮的耐药基因是AAC（6'）-Ib-cr, 该基因通过氟喹诺酮乙酰化对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素产生双重抗药性；S_XCZRJ_5中的MexD, 是典型的多重耐药基因, 可通过控制抗生素外排从而对氟喹诺酮、大环内酯及头孢菌素等抗生素产生耐药性；S_NZB_2中则是qnrS1、oqxA和oqxB, 主要通过抗生素靶点保护对氟喹诺酮类药物产生耐药性. 所以, 不同养殖场中即使同一表型的接合子, 其携带的ARGs种类也会有所不同, 可能与不同ARGs的耐药机制有关, 兽用抗生素可导致动物肠道微生物产生抗药性, 不同动物肠道微生物环境下可能有各自的优势ARGs^{[44, 45]}.

表 2 (Table 2)

表 2 3种养殖动物粪便中典型多重耐药接合子对比分析 Table 2 Comparative analysis of typical multi-drug-resistant transconjugants in the manure of three farmed animals 抗生素类型 抗生素 肉鸡（S_JLQ_5） 蛋鸡（S_XCZRJ_5） 生猪（S_NZB_2） 敏感性 耐药基因 敏感性 耐药基因 敏感性 耐药基因 氟喹诺酮 ENR R AAC(6')-Ib-cr和MexD R MexD R QnrS1、oqxA和oqxB NOR R R R CIP R R R LEV R R R 氨基糖苷类 S R AAC(6')-Ib7、AAC(6')-Ib-cr、AAC(6')-IIa、aadA15、aadA2、aadA8和APH(3″)-Ib R AAC(6')-Ib7、aadA15、aadA2和 ANT(3″)-IIa R AAC(3)-Iid、AAC(3)-IV、AAC(6')-Ib7、aadA15、aadA2、ANT(3″)-Iia、APH(3')-Ia、APH(3″)-Ib、APH(3')-IIa、APH(4)-Ia和APH(6)-Id AK R R I CN R I R 头孢菌素类 CFP I OXA-10和TEM-150 R OXA-10和TEM-150 I CTX-M-55、CTX-M- 65、OXA-10和TEM-150 FOX R R S β-内酰胺类 AMP R OXA-10、TEM-150和 CARB-3 R OXA-10、TEM-150和CARB-3 R CTX-M-55、CTX-M-65、OXA-10和 TEM-150 四环素类 TET R tet(A)和tet(G) R tet(G) R tet(A)、tet(G)和tetM 磺胺类 SXT R sul1 R sul1 R sul1、sul2、sul3、dfrA12和dfrA14

表 2 3种养殖动物粪便中典型多重耐药接合子对比分析 Table 2 Comparative analysis of typical multi-drug-resistant transconjugants in the manure of three farmed animals

为了应对全球耐药性危机, 养殖环境中接合型耐药质粒的研究还需要开展以下多方面的研究：一是, 源头减量效应评估：禁用饲喂抗生素使用后, 以上高风险的ARGs如何转移, 与养殖源接合质粒的污染特征息息相关, 因此需要持续开展监测工作以明确抗生素减量使用后高风险耐药接合型质粒的变化特点；二是, 无害化的控制技术方法的研发：通过养殖粪污的堆肥或者沼气发酵等无害化的方法, 减少高风险耐药接合型质粒的宿主, 从而达到控制ARGs环境释放及发生水平基因转移的目的；另外, 采用噬菌体定向原位“清除”动物肠道的多重耐药菌也是消减该类质粒的有效方法之一；三是, 接合型质粒的环境归趋及风险研究：需要进一步了解高频转移、广宿主的接合型耐药质粒进入非养殖环境后如何存留, 在不同的抗生素压力水平下是否会有机会向人类病原菌发生转移, 明确其风险水平.

（1）与肉鸡和生猪粪便相比, 蛋鸡粪便中接合型耐药质粒有着更高的转移能力和流行率；但是, 生猪粪便来源的接合型耐药质粒携带有更多的ARGs, 对应接合子也具有更高的多重耐药率.

（2）养殖粪便中的接合型耐药质粒携带的ARGs高度重合, 2/3（49/65）的ARGs为3种养殖场共有, 64%的ARGs属于氨基糖苷类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类和甲氧苄啶类耐药基因.

（3）养殖粪便中接合型耐药质粒多为窄宿主复制子（如IncF）类型, 但广宿主复制子上（如IncH、IncN和IncR）更容易同时携带多个高风险ARGs, 应为防控高风险ARGs从养殖向周边环境水平转移的重点.