2025, Vol. 46
2. 南阳师范学院土木与建筑工程学院, 南阳 473061;
3. 南水北调中线水源区流域生态安全高等学校学科创新引智基地, 南阳 473061
, CHEN Yan2 , NIU Xing-yi1 , ZHANG Yu1 , LIU Yong-qi1 , DING Chuan-yu1 , Bai-lian Larry Li3 , DUAN Peng-fei1
, CHEN Zhao-jin3
2. College of Civil Engineering and Architecture, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China;
3. Overseas Expertise Introduction Center for Discipline Innovation of Watershed Ecological Security in the Water Source Area of the Mid-line Project of South-to-North Water Diversion, Nanyang 473061, China
近年来, 随着工业化进程的加速发展, 土壤中重金属和微塑料的污染已经日益严重[1, 2].镉（Cd）作为土壤重金属污染的主要组成, 能降低土壤微生物的生物活性, 影响作物的产量和品质.微塑料（MPs）作为土壤中的一种新兴污染物, 是指0.1 µm~ 5 mm的纤维、薄膜等塑料碎屑和颗粒[3].微塑料具有的持久性、多样性、传播性和丰富性对土壤生态系统造成了严重的危害[2, 4].在农业生产中, 由于微塑料和重金属的广泛共存, 并且微塑料具有复杂的结构和比表面积, 可能发生交互作用[5].微塑料与重金属共存会改变重金属迁移率、土壤肥力、土壤酶活性以及微生物多样性和功能, 从而可能威胁到土壤生态系统的多功能性[6].目前, 重金属微塑料复合污染的修复研究极少开展, 与单一污染相比, 生态修复更为困难.
植物促生细菌（plant growth-promoting bacteria, PGPB）是一类能促进植物生长的有益细菌, 可通过产生铁载体、生物固氮、1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（ACC脱氨酶）和提高土壤中有效养分等多种途径促进植物的生长发育[7].植物促生细菌在重金属盐复合污染和重金属农药复合污染等重金属复合污染环境中得到广泛应用, 有效缓解了植物受到的复合胁迫并提高植物修复效率[7, 8].当微塑料与重金属在土壤中共存时, 产生的复合污染通过交互作用, 对生长的植物产生更为强烈的胁迫, 呈现毒性增强的现象[6].植物促生细菌在微塑料重金属复合污染条件下能否起到作用, 目前相关研究极少开展.笔者课题组之前通过水培试验发现植物促生细菌在微塑料和重金属复合污染中能通过调节高粱基因表达缓解所受到的胁迫, 但该研究在水培相对简单的环境中, 更为复杂真实的土壤中作用效果如何, 仍待验证[9, 10].
本研究从微塑料重金属污染土壤分离筛选植物促生细菌, 通过盆栽试验分析植物促生细菌对不同粒径聚丙烯PP（6.5 µm、830 µm）和镉（Cd）复合污染条件下狼尾草生长和Cd积累的影响, 同时通过高通量测序分析根际微生物群落组成的影响, 以期为植物微生物联合修复微塑料重金属复合污染理论提供数据支持和试验依据.
1 材料与方法 1.1 菌株分离筛选和促生特性研究选取重金属微塑料复合污染的土壤, 采用1/2 LB培养基和R2A培养基进行稀释涂布, 挑取平板中生长的菌落特征不一致的单菌落进行菌种分离, 划线纯化3次.将分离纯化后的菌株, 于4 ℃下进行保存.通过SDS方法提取细菌基因组DNA, 采用细菌通用引物27F和1492R进行序列16S rRNA基因扩增, 使用NCBI BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）与GenBank数据库中序列进行比对.使用MEGA 11.0进行系统发育和分子进化分析.
对分离菌株植物促生特性进行测定, 产吲哚乙酸（IAA）能力采用Salkowski比色法测定, 溶磷能力采用NBRIP培养基培养测定, 解钾能力采用筛选培养基测定, 产铁载体能力采用CAS蓝色定性培养基测定.
1.2 盆栽试验盆栽土壤采集自南阳师范学院西区石榴园, 基本理化性质：黄棕色土壤, ω（有机质）为10.29 g·kg-1, 阳离子交换量为16.8 cmol·kg-1, ω（全N）为1.31 g·kg-1, ω（全P）为1.90 g·kg-1, pH为6.93, 土壤中Cd未检测到. 土壤过筛后加CdSO4·8H2O使其Cd离子含量为10 mg·kg-1, 充分搅拌至混匀后放置1月用于固定重金属, 每盆称入0.75 kg土壤.本试验设计两个粒径（6.5 µm和830 µm）的聚丙烯（PP）, ω（PP）为0.1%, 设置不添加PP不添加Cd的无污染对照组（CK组）, 设置不添加PP只添加10 mg·kg-1 Cd污染组（Cd组）, 设置PP+Cd复合污染中接种植物促生细菌处理组.每个处理设置3个重复.盆栽种植期间, 浇水使盆栽土壤含水量保持在75%左右.
1.3 供试菌株接种将挑选出的具有良好促生能力的供试菌株接种于液体LB培养基中, 28℃振荡培养12~24 h, 取部分培养液置于50 mL离心管中, 4 800 r·min-1离心20min收集菌体, 菌体用无菌去离子水反复清洗至菌体含量达到1×108 cfu·mL-1.当幼苗在第30、45和60 d接种供试菌株, 在每盆每根狼尾草的根部接种10 mL的供试菌液.
1.4 盆栽处理当狼尾草生长80 d后收集植物和根际土壤样品.将盆栽中狼尾草拔出, 采用抖落法收集根际土壤, 然后用清水洗净, 浸泡在0.01 mol·L-1的EDTA-2Na缓冲液中20 min, 装入信封中放入100℃的烘箱中烘干24 h后, 测量地上部和地下部的干重.把地上部和地下部别研磨成粉, 消解后用ICP-OES测定植物不同组织中Cd含量.分析过程中加入土壤（GBW 07428）及植物（GBW10015）标准物质进行质量控制. Cd回收率分别为102%~108%和92%~106%.将土壤自然晾干后研磨过1 mm筛和1.5 mm筛, 测定理化性质, 土壤pH用pH计来测定；有效磷用浸提-钼锑抗分光光度法测定；碱解氮用碱解扩散法测定；速效钾用火焰光度法测定.
1.5 高通量测序土壤微生物基因组DNA采用试剂盒提取, 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测质量, 在按指定测序区域合成带有barcode的特异引物.使用TransGen ap 221-02进行正式的PCR检测, PCR设备采用ABI GeneAmp®9700, 将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量, 之后按照每个样本的测序量要求, 进行相应比例的混合.在上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina PE300测序, Illumina测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接, 同时对序列质量进行质控和过滤, 区分样本后进行ASV聚类分析和物种分类学分析, 再基于ASV聚类分析结果, 对ASV进行多种多样性指数分析, 以及对测序深度的检测.基于分类学信息, 在各个分类水平上进行群落结构的统计分析.
1.6 数据分析所有数据均有3次重复, 使用SPSS 23.0进行统计分析, 显著性差异检验使用T检验和单因素方差分析（P < 0.05）.
2 结果与分析 2.1 菌株分离和促生特性测定将分离得到的细菌菌株测定其植物促生特性, 筛选出具有良好促生特性的7株菌, 命名为Y-23、Y-35、Y-38、Y-51、Y-62、Y-S和Y-V.通过NCBI数据库将序列上传GenBank, 获得登录号（表 1）.将与菌株同源性较高已命名菌的序列信息构建系统发育树, 菌株Y-23、Y-51和Y-V与肠杆菌的序列相似性最高, 属于肠杆菌属（Enterobacter sp.）.根据系统发育树的拓扑结构可得, 菌株Y-38、Y-35、Y-62和Y-S与芽孢杆菌处在同一分支, 属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）.通过测定菌株的植物促生特性, 7株菌均可产生IAA, 具备铁载体、溶磷、解钾能力, 且有较好的Cd耐受性（表 1）.
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表 1 分离菌株信息和植物促生特性1） Table 1 Information on isolated strains and their plant growth-promoting properties |
2.2 不同处理对狼尾草生长的影响
由图 1（a）可知, 相比CK处理, 在Cd胁迫下狼尾草的地上部长度和地下部长度分别降低13.16%和14.98%.与单一Cd污染相比, 添加不同粒径PP的效果不同, 6.5 µm PP+Cd狼尾草地上部长度降低6.06%, 地下部降低7.96%；830 µm PP+Cd狼尾草地上部和地下部长度显著降低7.58%和10.23%.在PP+Cd复合污染中加入供试菌株, 与6.5 µm PP+Cd处理相比, 地上部长度增加比例为2.15%~20.43%, 地下部长度增加比例为4.94%~66.67%, 其中地上部是6.5 µm PP+Cd+Y-23, 提高20.43%, 地下部长度提高最明显的是6.5 µm PP+Cd+Y-23, 增加66.67%.与830 µm PP+Cd处理相比, 地上部长度中只有830 µm PP+Cd+Y-38是下降的, 其余接菌处理地上部长度均增加.地下部长度接菌处理均增加, 增加比例为8.86%~30.38%, 其中830 µm PP+Cd+Y-35最显著, 增加比例为30.38%.
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1.CK, 2.Cd, 3.6.5 µm PP+Cd, 4.6.5 µm PP+Cd+Y-23, 5.6.5 µm PP+Cd+Y-35, 6.6.5 µm PP+Cd+Y-38, 7.6.5 µm PP+Cd+Y-51, 8.6.5 µm PP+Cd+Y-62, 9.6.5 µm PP+Cd+Y-S, 10.6.5 µm PP+Cd+Y-V, 11.830 µm PP+Cd, 12.830 µm PP+Cd+Y-23, 13.830 µm PP+Cd+Y-35, 14.830 µm PP+Cd+Y-38, 15.830 µm PP+Cd+Y-51, 16.830 µm PP+Cd+Y-62, 17.830 µm PP+Cd+Y-S, 18.830 µm PP+Cd+Y-V；不同字母表示处理之间有显著差异P < 0.05 图 1 不同处理狼尾草长度和干重 Fig. 1 Length and dry weight of Hybrid pennisetum under different treatments |
由图 1（b）可知, Cd胁迫、PP+Cd复合污染和植物促生细菌接种对狼尾草干重的影响与长度的影响一致, 即Cd胁迫降低狼尾草地上部干重和地下部干重, 比例分别为19.90%和23.01%.PP+Cd复合污染相较Cd单一胁迫, 6.5 µm PP+Cd和830 µm PP+Cd地下部干重下降3.36%和18.38%.在PP+Cd复合污染中接种供试菌株, 除个别菌株外, 均能提高狼尾草的干重.由狼尾草长度和干重变化可知, PP+Cd复合污染对狼尾草生长呈现毒性增强的现象, 并且随着PP粒径的降低, 对狼尾草的抑制作用越明显.分离筛选的植物促生细菌能很好地缓解PP+Cd复合污染导致的胁迫, 狼尾草长度和干重明显得到改善.
2.3 不同处理对狼尾草Cd含量和积累量的影响由图 2（a）可知, 相较Cd处理组, 添加6.5 µm PP和830 µm PP的处理组地上部Cd含量分别下降13.59%和15.15%, 830 µm PP的处理组地下部Cd含量下降0.57%.在6.5 µm PP+Cd条件下, 接种植物促生细菌狼尾草地上部的Cd含量都增加, 比例为13.26%~40.23%, 其中增加效果最为明显的是株菌Enterobacter sp. Y-V, 增加比例为40.23%.地下部的除株菌Bacillus sp. Y-62, Enterobacter sp. Y-51和Bacillus sp. Y-S外, 其余接菌处理均增加Cd含量.与830 µm PP+Cd相比, 接菌处理地下部的Cd含量增加4.40%~12.60%.其中地下部增加最为明显的是菌株Bacillus sp.Y-35, 增加了12.60%.
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1.Cd, 2.6.5 µm PP+Cd, 3.6.5 µm PP+Cd+Y-23, 4.6.5 µm PP+Cd+Y-35, 5.6.5 µm PP+Cd+Y-38, 6.6.5 µm PP+Cd+Y-51, 7.6.5 µm PP+Cd+Y-62, 8.6.5 µm PP+Cd+Y-S, 9.6.5 µm PP+Cd+Y-V, 10.830 µm PP+Cd, 11.830 µm PP+Cd+Y-23, 12.830 µm PP+Cd+Y-35, 13.830 µm PP+Cd+Y-38, 14.830 µm PP+Cd+Y-51, 15.830 µm PP+Cd+Y-62, 16.830 µm PP+Cd+Y-S, 17.830 µm PP+Cd+Y-V；不同字母表示处理之间有显著差异（P < 0.05） 图 2 不同处理狼尾草Cd含量和积累量 Fig. 2 Cd content and accumulation of Hybrid pennisetum under different treatments |
由图 2（b）可知, 相对于Cd处理组, 6.5 µm PP+Cd处理组和830 µm PP+Cd处理组的地上部Cd积累量分别降低了28.39%和10.65%, 6.5 µm PP+Cd处理组和830 µm PP+Cd处理组的地下部Cd积累量分别降低了8.72%和3.96%.在6.5 µm PP+Cd条件下, 接种菌株后狼尾草地上部和地下部Cd积累量分别增加42.45%~125.82%和16.72%~87.51%, 其中菌株Enterobacter sp. Y-V和Enterobacter sp.Y-23分别为地上部和地下部效果最为显著菌株.与830 µm PP+Cd相比, 接种菌株Enterobacter sp. Y-23、Bacillus sp. Y-38和Enterobacter sp. Y-V狼尾草地上部Cd积累量下降, 地下部分Cd积累量增加6.10%~46.80%.
2.4 不同处理对狼尾草根际土壤理化性质和有效态镉的影响与CK相比, Cd处理组速效钾显著降低6.03%（表 2）.相比Cd处理组, 6.5 µm PP+Cd处理组和830 µm PP+Cd处理组速效钾显著降低5.11%和6.50%.相较6.5 µm PP+Cd和830 µm PP+Cd处理组, 接菌处理提高速效钾含量, 比例分别为0.40%~2.20%和0.08%~6.64%.与CK相比, Cd处理组有效磷显著降低16.69%.相比Cd处理组, 6.5 µm PP+Cd处理组和830 µm PP+Cd处理组降低3.33%和0.43%.相比6.5 µm PP+Cd和830 µm PP+Cd处理组, 接菌处理提高有效磷含量, 比例分别为0.97%~9.42%和0.36%~12.56%, 其中Bacillus sp. Y-38在6.5 µm PP+Cd和830 µm PP+Cd处理中均效果最显著.
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表 2 不同处理狼尾草根际土壤pH值、速效钾含量、有效磷含量和DTPA提取态Cd含量1） Table 2 The pH, potassium, phosphorus content, and DTPA extracted Cd content of Hybrid pennisetum rhizosphere soil under different treatments |
与Cd处理组相比, 土壤中有效态镉（DTPA-Cd）含量在6.5 µm PP+Cd处理组和830 µm PP+Cd处理组显著升高30.70%和12.70%.不同粒径条件下菌株接种对DTPA-Cd含量产生的影响不同, 与6.5 µm PP+Cd处理组相比, 接菌处理组的DTPA-Cd中只有6.5 µm PP+Cd+Y-23和6.5 µm PP+Cd+Y-35是增加的, 分别增加0.75%和17.67%, 其余处理下降.与830 µm PP+Cd处理组相比, 接菌处理组的DTPA-Cd只有830 µm PP+Cd+Y-23和830 µm PP+Cd+Y-62是降低的, 分别降低31.78%和14.06%, 其余处理上升.
相比于CK, Cd处理的pH显著降低4.66%.相比Cd处理组, 6.5 µm PP+Cd处理组和830 µm PP+Cd处理组的pH值降低0.63%和5.20%.相比PP+Cd复合污染处理, 接菌后土壤pH含量均降低.6.5 µm PP+Cd处理组中, 6.5 µm PP+Cd+Y-35降低最显著为6.50%, 830 µm PP+Cd处理组中, 830 µm PP+Cd+Y-62降低最显著为3.54%.
2.5 不同处理下根际土壤细菌群落组成的影响高通量测序结果表明, 18组54个送测样品的狼尾草根际土壤样品中由41个门和1 144个属组成.如图 3（a）所示, 门水平上变形菌门（Proteobacteria, 25.74%~34.89%, 相对丰度, 下同）、酸杆菌门（Acidobacteriota, 14.40%~23.13%）、放线菌门（Actinobacteriota, 10.29%~13.68%）、厚壁菌门（Firmicutes, 6.89%~17.34%）和绿弯菌门（Chloroflexi, 5.84%~7.09%）为优势种群, 占全部序列的86.93%~95.12%.如图 3（b）所示, 属水平的优势种群由鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas, 4.70%~7.84%）、芽孢杆菌属（Bacillus, 4.44%~14.17%）、RB41（3.87%~7.12%）和节杆菌属（Arthrobacter, 1.84~5.77%）等组成, 占全部序列的17.48%~34.90%.
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1.CK, 2.Cd, 3.6.5 µm PP+Cd, 4.6.5 µm PP+Cd+Y-23, 5.6.5 µm PP+Cd+Y-35, 6.6.5 µm PP+Cd+Y-38, 7.6.5 µm PP+Cd+Y-51, 8.6.5 µm PP+Cd+Y-62, 9.6.5 µm PP+Cd+Y-S, 10.6.5 µm PP+Cd+Y-V, 11.830 µm PP+Cd, 12.830 µm PP+Cd+Y-23, 13.830 µm PP+Cd+Y-35, 14.830 µm PP+Cd+Y-38, 15.830 µm PP+Cd+Y-51, 16.830 µm PP+Cd+Y-62, 17.830 µm PP+Cd+Y-S, 18.830 µm PP+Cd+Y-V 图 3 门分类和属分类水平上群落相对丰度分布 Fig. 3 Relative abundance distribution of communities at the phylum and genus taxonomic levels |
采用LefSe（linear discriminant analysis effect size）软件, 分析不同处理水平样品之间根际土壤细菌群落组成的差异性（图 4）.结果表明LDA > 2条件下不同处理间的根际土壤细菌有48个存在差异.在CK处理组中差异显著的为Firmicutes、Bacilli和Arthrobacter；在6.5 µm PP+Cd处理组中差异显著的是Bacilli、Paenibacillales、Paenibacillaceae和Cohnella；在6.5 µm PP+Cd+Y-S处理组中差异显著的是Proteobacteria、Gammaproteobacteria、Cellvibrionales、Spongiibacteraceae、Firmicutes、Bacilli、Thermoactinomycetaceae和BD1；在830 µm PP+Cd+Y-38处理组中差异显著的是Streptomyces、Crossiella、Kitasatospora、Caldilineales、Chloroflexi、Litorilinea、Anaerolineae和Actinobacteriota；在830 µm PP+Cd+Y-51处理组中的差异显著的是Chloroflexi、Cyanobacteria、Gemmatimonadota、Cytophagales、Aquicella、Oligoflexales、Anaerolineae、Proteobacteria、Diplorickettsiales、Bacteroidia、Bdellovibrionota和Ligoflexus；在830 µm PP+Cd+Y-62处理组中差异显著的是Proteobacteria、Sphingomonas、Gemmatimonadetes、Actinobacteriota、Thermoleophilia、Reyranellales、Alphaproteobacteria和Ellin6055.
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1.6.5 µm PP+Cd, 2.6.5 µm PP+Cd+Y-35, 3.6.5 µm PP+Cd+Y-38, 4.6.5 µm PP+Cd+Y-62, 5.6.5 µm PP+Cd+Y-S, 6.6.5 µm PP+Cd+Y-V, 7.830 µm PP+Cd+Y-23, 8.830 µm PP+Cd+Y-38, 9.830 µm PP+Cd+Y-51, 10.830 µm PP+Cd+Y-62, 11.830 µm PP+Cd+Y-S, 12.830 µm PP+Cd+Y-V, 13.CK 图 4 不同样品差异细菌LefSe分析 Fig. 4 LefSe analysis identifying the most differentially abundant taxa |
为了探究重点细菌类群对植物生长、Cd含量、积累量和土壤理化性质之间的关系, 采用Mantel检验进行分析（图 5）.结果表明, Bacillus与地上部长度（r=0.345, P=0.034）、地上部Cd含量（r=0.870, P=0.016）、地下部Cd含量（r=0.915, P =0.014）、地上部Cd积累量（r=0.691, P=0.020）、地下部Cd积累量（r=0.817, P=0.018）、DTPA-Cd（r=0.771, P=0.039）和pH（r=0.458, P=0.028）呈显著相关.Firmictes与地上部长度（r =0.331, P=0.043）、地上部Cd含量（r=0.852, P=0.017）, 地下部Cd含量（r=0.900, P=0.019）、地上部Cd积累量（r =0.676, P=0.022）、地下部Cd积累量（r=0.805, P=0.018）、DTPA-Cd（r=0.754, P=0.044）和pH（r=0.457, P=0.028）呈显著相关.
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1. 地上部长度, 2.地下部长度, 3.地上部干重, 4.地下部干重, 5.地上部Cd含量, 6.地下部Cd含量, 7.地上部Cd积累量8.地下部Cd积累量, 9.DTPA-Cd, 10.pH, 11.K, 12.P 图 5 狼尾草重点细菌类群与生长指标与土壤理化性质的Mantel分析 Fig. 5 Mantel analysis of key bacterial groups, growth indicators, and soil physical and chemical properties of Hybrid pennisetum |
狼尾草作为高生物量能源植物, 是国内有前景的非粮能源植物之一, 在重金属污染植物修复中得到广泛的应用[11].本研究表明, Cd的添加使狼尾草长度和生物量均有不同程度的下降, 地上部和地下部长度分别降低13.16%和14.98%, 干重降低19.90%和23.01%, 该结果与之前研究的Cd污染会使狼尾草生物量降低一致[12].微塑料在水体和土壤等自然生态系统中与重金属共存时, 能成为重金属的转运载体, 产生交互作用[5].宁瑞艳等[13]研究表明微塑料的添加不仅增强了Cd对东南景天生长的抑制作用, 还促进了东南景天和叶芽鼠耳芥对Cd的吸收.本试验表明PP+Cd复合污染相较Cd单一胁迫, 6.5 μm PP+Cd和830 μm PP+Cd的地上部长度分别降低6.06%和7.58%, 地下部长度分别降低7.96%和10.23%, 这与很多研究证明的微塑料和重金属复合污染相比较于单一污染植株生物量更低, 呈现复合污染对植物毒性增强的现象一致[6, 14].由于根系直接暴露于微塑料和重金属复合污染, 受到的复合胁迫较地上部更大, 长度和生物量的下降更大[15].
植物促生细菌是指能通过直接作用或间接作用提高植物生长、缓解植物受到的逆境胁迫的菌株, 可促进作物养分吸收, 维持土壤生态健康等[7, 16, 17].本试验从微塑料重金属污染土壤中分离7株菌株, 鉴定结果为芽孢杆菌和肠杆菌, 是已被报道的广泛存在的促进植株生长的优势菌群[18, 19].菌株的促生特性分析表明, 菌株Y-23、Y-35、Y-38、Y-51、Y-62、Y-S和Y-V均具有产IAA、溶磷、解钾能力和Cd抗性.有研究表明, 具有产IAA能力的芽孢杆菌和肠杆菌能促进植物生长, 缓解植物受到的重金属胁迫, 对植物修复具有增效作用[20, 21].本试验中, 与未接种菌组处理相比, PP+Cd复合污染条件下接种产IAA植物促生细菌处理狼尾草, 地上部长度和干重分别提高2.15%~20.43%和1.01%~60.97%, 地下部长度和干重分别提高4.94%~66.67%和1.65%~66.67%, 表明植物促生细菌有效缓解狼尾草受到的PP+Cd复合污染胁迫, 促进了狼尾草的生长发育.这与笔者之前开展的水培条件下接种植物促生细菌Enterobacter sp. VY-1和Bacillus sp. SL-413能缓解高粱受到的Cd+PE复合污染胁迫的结果一致, 表明植物促生细菌在不同生境中均具有较好的效果[10].微塑料在土壤中会引起土壤理化性质的变化, 改变土壤矿质元素形态, 影响土壤微生物和生物有效性[4, 22]. Han等[23]的研究表明微塑料对根际土壤养分有效性产生负面影响, 如降低土壤速效钾和有效磷.本研究表明PP添加导致的复合污染能降低土壤矿质元素含量, 速效钾和有效磷分别降低0.43%~3.33%和5.11%~6.50%.土壤中矿质营养元素有效态低, 是植物生长受限的主要因素之一, 是PP+Cd复合污染导致狼尾草生物量下降主要原因之一.植物促生细菌活化土壤矿质营养元素, 提高其含量, 是其促进植物生长的主要机制之一[24, 25].本试验中分离的供试菌株, 均具有产生溶磷和解钾的能力, 盆栽试验表明这些菌株能提高PP+Cd复合污染中速效钾和有效磷的含量, 有效缓解PP+Cd导致的矿质营养元素降低的状况.
有研究表明, 微塑料与重金属共存时还能影响植物对重金属的积累, 影响植物重金属含量和积累量[1].相较Cd处理组, 6.5 µm PP+Cd复合污染中狼尾草地上部和地下部Cd积累量分别降低28.39%和8.72%, 830 µm的复合污染中狼尾草的地上部和地下部Cd积累量分别降低了10.65%和3.96%, 表明6.5 µm的复合污染降低幅度要比830 µm的复合污染大.土壤中的微塑料通过物理吸附和共沉降, 能降低重金属的交换态、碳酸盐结合态和铁锰氧化物结合态, 增加有机结合态, 降低重金属在土壤中的生物有效性和迁移率, 从而降低植物重金属的积累[1]. 6.5 μm PP+Cd复合污染DTPA-Cd含量相较对照Cd处理组更高, 但积累量更低, 还可能与PP添加到土壤中之后抑制狼尾草水分吸收, 影响有效态Cd进入植物体内有关.植物促生细菌产生有机酸, 改变根际周围土壤的pH值, 活化根际土壤重金属, 从而提高植物富集重金属是其提高植物修复的主要机制之一[17, 26].对接菌处理的土壤pH值测定表明, 植物促生细菌接种降低了PP+Cd复合污染中的pH值.土壤pH通过影响土壤组分和重金属的电荷特性-沉淀/溶解、吸附/解吸和配位/解离平衡来改变重金属有效性和固定化, 还可通过微生物活性间接影响金属有效性.土壤DTPA-Cd测定结果表明Enterobacter sp.Y-23和Bacillus sp.Y-35能提高6.5 µm PP条件下DTPA-Cd含量, Bacillus sp. Y-35、Bacillus sp. Y-38、Bacillus sp. Y-S和Enterobacter sp. Y-51、Enterobacter sp.Y-V能提高830 µm PP条件下DTPA-Cd含量, 活化土壤有效态重金属, 进而改变狼尾草对PP+Cd复合污染中Cd的吸收和富集.
植物促生细菌接种到植物根际环境, 不仅对植物有着直接影响, 对根际土壤中微生物群落也会造成影响[27].植物根际微生物群落的物种组成和变化是土壤健康和植物生长适应的重要指标, 也是决定植物健康和生产力的关键因素之一[28].本试验表明, 狼尾草根际细菌群落组成在CK、Cd、PP+Cd复合污染和接菌处理之间存在显著差异. Habibollahi等[29]研究表明, 在受重金属污染的土壤中变形菌门、厚壁菌门、酸杆菌门和拟杆菌门为优势菌门, 本文的研究发现PP+Cd复合污染及其接菌处理土壤也是这些优势种群组成.这些细菌具有较高的适应性, 在这些生态系统中起着至关重要的作用.其中有研究证实变形菌门和厚壁菌门等通常是土壤中最丰富的门, 同时也是是重金属和微塑料的抗性微生物[30, 31].而属水平上由芽孢杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和RB41属等优势菌属组成, 其中芽孢杆菌属是已报道的重金属抗性细菌, 广泛存在不同的重金属土壤中[32, 33].同时, 微塑料的添加能够为这些微生物提供附着点, 芽孢杆菌属和鞘氨醇单胞菌属是微塑料表面生物膜的重要组成, 在微塑料降解中起到重要作用[34, 35].后续Mantel检验分析表明芽孢杆菌属和厚壁菌门与狼尾草生物量和Cd含量、积累量呈现显著相关, 是影响狼尾草生长的重要因素.
4 结论（1）狼尾草长度和干重变化表明6.5 µm和830 µm粒径PP和Cd复合污染对狼尾草生长呈现毒性增强的现象, 并且随着PP粒径的降低, 对狼尾草的抑制作用越明显.
（2）分离筛选到7株具有产生IAA、铁载体、溶磷和解钾促生能力的菌株, 盆栽试验表明植物促生细菌能很好缓解PP+Cd复合污染导致的胁迫, 狼尾草长度和干重明显得到改善.
（3）植物促生细菌能增加土壤速效钾和有效磷含量, 缓解PP+Cd复合污染导致的土壤矿质营养元素降低.
（4）PP+Cd复合污染和植物促生细菌接种能影响狼尾草根际细菌群落组成, 能影响变形菌门、厚壁菌门和放线杆菌门等优势种群的组成.
| [1] | Jia H, Wu D, Yu Y, et al. Impact of microplastics on bioaccumulation of heavy metals in rape (Brassica napus L.)[J]. Chemosphere, 2022, 288. DOI:10.1016/j.chemosphere.2021.132576 |
| [2] |
朱永官, 朱冬, 许通, 等. (微)塑料污染对土壤生态系统的影响: 进展与思考[J]. 农业环境科学学报, 2019, 38(1): 1-6. Zhu Y G, Zhu D, Xu T, et al. Impacts of (micro)plastics on soil ecosystem: progress and perspective[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2019, 38(1): 1-6. |
| [3] | Wu P F, Huang J S, Zheng Y L, et al. Environmental occurrences, fate, and impacts of microplastics[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 184. DOI:10.1016/j.ecoenv.2019.109612 |
| [4] | Yang L, Zhang Y L, Kang S C, et al. Microplastics in soil: a review on methods, occurrence, sources, and potential risk[J]. Science of the Total Environment, 2021, 780. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.146546 |
| [5] | Cao Y X, Zhao M J, Ma X Y, et al. A critical review on the interactions of microplastics with heavy metals: mechanism and their combined effect on organisms and humans[J]. Science of the Total Environment, 2021, 788. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.147620 |
| [6] |
段莉阳, 张玉, 任学敏, 等. 微塑料和镉复合污染对狼尾草根际土壤微生物群落结构和功能的影响[J]. 环境科学, 2023, 44(12): 6973-6981. Duan L Y, Zhang Y, Ren X M, et al. Effects of combined pollution of microplastics and cadmium on microbial community structure and function of Pennisetum hydridum rhizosphere soil[J]. Environmental Science, 2023, 44(12): 6973-6981. |
| [7] | Compant S, Clément C, Sessitsch A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2010, 42: 669-678. DOI:10.1016/j.soilbio.2009.11.024 |
| [8] | Gutiérrez-Ginés M J, Hernández A J, Pérez-Leblic M I, et al. Phytoremediation of soils co-contaminated by organic compounds and heavy metals: bioassays with Lupinus luteus L. and associated endophytic bacteria[J]. Journal of Environmental Management, 2014, 143: 197-207. |
| [9] |
刘泳岐, 赵锶禹, 任学敏, 等. 转录组分析植物促生细菌缓解高粱微塑料和重金属复合污染胁迫机制[J]. 环境科学, 2024, 45(1): 480-488. Liu Y Q, Zhao S Y, Ren X M, et al. Transcriptome analysis of plant growth-promoting bacteria alleviating microplastic and heavy metal combined pollution stress in sorghum[J]. Environmental Science, 2024, 45(1): 480-488. |
| [10] | Liu Y Q, Chen Y, Ren X M, et al. Plant growth-promoting bacteria modulate gene expression and induce antioxidant tolerance to alleviate synergistic toxicity from combined microplastic and Cd pollution in sorghum[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety 2023, 264. DOI:10.1016/j.ecoenv.2023.115439 |
| [11] |
侯新村, 范希峰, 武菊英, 等. 草本能源植物修复重金属污染土壤的潜力[J]. 中国草地学报, 2012, 34(1): 59-64, 76. Hou X C, Fan X F, Wu J Y, et al. Potentiality of herbaceous bioenergy plants in remediation of soil contaminated by heavy metals[J]. Chinese Journal of Grassland, 2012, 34(1): 59-64, 76. |
| [12] |
刘大林, 孙启鑫, 邵将, 等. 镉胁迫对两种狼尾草不同生育时期生长性能、光合作用特征及镉吸收转运差异的影响[J]. 草业科学, 2017, 34(1): 84-93. Liu D L, Sun Q X, Shao J, et al. Effects of Cd concentrations on growth, photosynthetic indices and bioconcentration of two Pennisetum during different growth stages[J]. Pratacultural Science, 2017, 34(1): 84-93. |
| [13] |
宁瑞艳, 刘娜, 程红艳, 等. 微塑料和镉及其复合对超富集植物生长和富集镉的影响[J]. 环境科学学报, 2022, 42(6): 415-425. Ning R Y, Liu N, Cheng H Y, et al. Effects of microplastics, cadmium and their combination on the growth and cadmium accumulation of hyperaccumulators[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2022, 42(6): 415-425. |
| [14] | Wang F Y, Zhang X Q, Zhang S Q, et al. Interactions of microplastics and cadmium on plant growth and arbuscular mycorrhizal fungal communities in an agricultural soil[J]. Chemosphere 2020, 254. DOI:10.1016/j.chemosphere.2020.126791 |
| [15] | Kumar R, Ivy N, Bhattacharya S, et al. Coupled effects of microplastics and heavy metals on plants: Uptake, bioaccumulation, and environmental health perspectives[J]. Science of the Total Environment, 2022, 836. DOI:10.1016/j.scitotenv.2022.155619 |
| [16] | Li X Q, Liu Y Q, Li Y J, et al. Enhancing mechanisms of the plant growth-promoting bacterial strain Brevibacillus sp. SR-9 on cadmium enrichment in sweet sorghum by metagenomic and transcriptomic analysis[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2022, 19(23). DOI:10.3390/ijerph192316309 |
| [17] | Ren X M, Guo S J, Tian W, et al. Effects of plant growth-promoting bacteria (PGPB) inoculation on the growth, antioxidant activity, cu uptake, and bacterial community structure of rape (Brassica napus L.) grown in cu-contaminated agricultural soil[J]. Frontiers in Microbiology, 2019, 10. DOI:10.3389/fmicb.2019.01455 |
| [18] | Li Y, He Y H, Wang W F, et al. Plant-beneficial functions and interactions of Bacillus subtilis SL-44 and Enterobacter cloacae Rs-2 in co-culture by transcriptomics analysis[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2021, 28(40): 56333-56344. DOI:10.1007/s11356-021-14578-y |
| [19] | Özdoğan D K, Akçelik N, Akçelik M. Genetic diversity and characterization of plant growth-promoting effects of bacteria isolated from rhizospheric soils[J]. Current Microbiology, 2022, 79(5). DOI:10.1007/s00284-022-02827-3 |
| [20] | Babu A G, Kim J D, Oh B T. Enhancement of heavy metal phytoremediation by Alnus firma with endophytic Bacillus thuringiensis GDB-1[J]. Journal of Hazardous Materials, 2013, 250-251: 477-483. DOI:10.1016/j.jhazmat.2013.02.014 |
| [21] | Carlos M H J, Stefani P V Y, Janette A M, et al. Assessing the effects of heavy metals in ACC deaminase and IAA production on plant growth-promoting bacteria[J]. Microbiological Research, 2016, 188-189: 53-61. DOI:10.1016/j.micres.2016.05.001 |
| [22] |
赵群芳, 褚龙威, 丁原红, 等. 微塑料对土壤中养分和镉淋失的影响[J]. 环境科学, 2024, 45(1): 489-495. Zhao Q F, Chu L W, Ding Y H, et al. Effects of microplastics on the leaching of nutrients and cadmium from soil[J]. Environmental Science, 2024, 45(1): 489-495. |
| [23] | Han Y J, Teng Y, Wang X, et al. Biodegradable PBAT microplastics adversely affect pakchoi (Brassica chinensis L.) growth and the rhizosphere ecology: focusing on rhizosphere microbial community composition, element metabolic potential, and root exudates[J]. Science of the Total Environment, 2024, 912. DOI:10.1016/j.scitotenv.2023.169048 |
| [24] | Ju W L, Liu L, Jin X L, et al. Co-inoculation effect of plant-growth-promoting rhizobacteria and rhizobium on EDDS assisted phytoremediation of Cu contaminated soils[J]. Chemosphere, 2020, 254. DOI:10.1016/j.chemosphere.2020.126724 |
| [25] | Meena V S, Meena S K, Verma J P, et al. Plant beneficial rhizospheric microorganism (PBRM) strategies to improve nutrients use efficiency: a review[J]. Ecological Engineering, 2017, 107: 8-32. DOI:10.1016/j.ecoleng.2017.06.058 |
| [26] |
李交昆, 余黄, 曾伟民, 等. 根际促生菌强化植物修复重金属污染土壤的研究进展[J]. 生命科学, 2017, 29(5): 434-442. Li J K, Yu H, Zeng W M, et al. Research progress on plant growth promoting rhizobacteira and their role in phytoremediation of heavy metal-contaminated soil[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2017, 29(5): 434-442. |
| [27] | Wang W J, Liu A R, Zheng X Y, et al. Combined application of a PGPR strain Methylophilus sp. FP-6 and adenine to enhance the phytoremediation potential of tobacco: oxybenzone remediation, plant response and rhizosphere bacterial community adaptation[J]. Plant and Soil, 2023, 482(1-2): 313-332. DOI:10.1007/s11104-022-05691-z |
| [28] | Chaparro J M, Sheflin A M, Manter D K, et al. Manipulating the soil microbiome to increase soil health and plant fertility[J]. Biology and Fertility of Soils, 2012, 48(5): 489-499. DOI:10.1007/s00374-012-0691-4 |
| [29] | Habibollahi M H, Baghizadeh A, Sabokbar A, et al. Isolation and characterization of copper and cadmium resistant bacteria from industrial wastewaters and evaluating the biosorption of selected bacteria[J]. Desalination and Water Treatment, 2017, 93: 139-144. DOI:10.5004/dwt.2017.21483 |
| [30] | Sun A Q, Jiao X Y, Chen Q L, et al. Microbial communities in crop phyllosphere and root endosphere are more resistant than soil microbiota to fertilization[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2021, 153. DOI:10.1016/j.soilbio.2020.108113 |
| [31] | Alotaibi B S, Khan M, Shamim S. Unraveling the underlying heavy metal detoxification mechanisms of Bacillus species[J]. Microorganisms, 2021, 9(8). DOI:10.3390/microorganisms9081628 |
| [32] |
马莹, 王玥, 石孝均, 等. 植物促生菌在重金属生物修复中的作用机制及应用[J]. 环境科学, 2022, 43(9): 4911-4922. Ma Y, Wang Y, Shi X J, et al. Mechanism and application of plant growth-promoting bacteria in heavy metal bioremediation[J]. Environmental Science, 2022, 43(9): 4911-4922. |
| [33] | Gupta R, Khan F, Alqahtani F M, et al. Plant growth–promoting rhizobacteria (PGPR) assisted bioremediation of heavy metal toxicity[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2023. DOI:10.1007/s12010-023-04545-3 |
| [34] | Ya H B, Xing Y, Zhang T, et al. LDPE microplastics affect soil microbial community and form a unique plastisphere on microplastics[J]. Applied Soil Ecology, 2022, 180. DOI:10.1016/j.apsoil.2022.104623 |
| [35] | Zhai X Y, Zhang X H, Yu M. Microbial colonization and degradation of marine microplastics in the plastisphere: a review[J]. Frontiers in Microbiology, 2023, 14. DOI:10.3389/fmicb.2023.1127308 |