2025, Vol. 46
2. 中国科学院雄安创新研究院, 雄安 071899;
3. 澳大利亚联邦科学与工业组织, 肯辛顿 6151;
4. 河北省地质矿产勘查开发局第四地质大队, 承德 067000
, LI Shu-yuan1,2 , ZUO Tian-yuan1 , HU Zi-ru1 , LI Shuo-yang1 , LIU Hui1 , HU Qing2,3 , LI Fang-hong1
, HE Yu-huan4
2. Xiong'an Innovation Institute, Chinese Academy of Sciences, Xiong'an 071899, China;
3. Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation (CSIRO), Kensington 6151, Australia;
4. The Fourth Geological Brigade of Hebei Geological and Mineral Exploration and Development Bureau, Chengde 067000, China
石油是我国重要的化石能源之一, 随着我国石油资源的不断开发利用, 石油污染问题也愈发严重[1]. 石油中含有各种烷烃、环烷烃、芳香烃以及重金属等难降解混合污染物, 污染物进入土壤后会黏附在土壤表面, 降低土壤通透性, 影响土壤肥力, 造成农作物减产[2]. 石油污染物进入土壤后同时影响土壤中微生物群落的生长代谢, 使土壤中微生物群落结构发生改变, 微生物种类减少, 土壤环境进一步恶化[3]. 目前, 石油污染的修复技术有物理修复技术、化学修复技术以及生物修复技术[4]. 其中生物修复技术因对石油污染物降解效率高及成本低等优势, 越来越受到国内外专家的重视, 成为修复石油污染土壤的热点领域[5].
微生物修复可以利用土壤中的土著微生物对污染土壤进行原位修复[6, 7], 也可以向土壤中引入一些可快速降解某些特定污染物的外源微生物进行修复[8], 这些微生物可以充分利用土壤中的石油污染物作为营养物质快速生长发育, 在代谢过程中逐步分解土壤中污染物, 以达到修复污染土壤的目的. 微生物修复技术具有效果好、成本低且无二次污染的优势[9], 在环境土壤修复中被视为最具潜力的方法[10].
但在生产实践过程中, 利用微生物菌种修复污染土壤较实验室条件下稳定性差、不易控制[11], 在某些情况下, 土著微生物群落可能由于没有可降解的目标污染物而不具有代谢潜力[12], 或存在单一的菌株适应性差及对石油降解能力有限等缺点[13], 因此应采用生物强化是修复污染场地的有效方法[14]. 有研究表明, 接种外源菌会提高土壤中土著微生物的降解能力[15], 各专项优势降解菌的混合强化了生物修复效果[16], 加强了微生物之间协同作用, 提高了生物修复效果[17]. 利用不同微生物对石油不同组分的降解不同这一特点[18], 可通过调控不同微生物菌群构成复合菌群, 提高微生物对石油污染物降解的能力. 已有研究发现将单株菌组合构建的混合菌系更具优势[19], 利用混合菌群修复石油污染已经成为有机污染物修复热点[20], 如Rahman等[21]从原油污染土壤中筛选出多株优势菌种, 该菌群在培养后对石油污染物的降解率明显高于单一菌株的降解率；段春燕等[22]利用筛选出的石油降解菌构建11组菌系, 表现出高效的石油降解性能；Alisi等[23]基于生物强化方法利用新建立的微生物群落, 在42 d内柴油总烃减少约75%. 因此, 构建菌系对高效降解石油至关重要.
本研究在原位微生物修复技术的基础上添加外源石油降解菌, 构建不同种类的复合石油降解菌群并将其接种至石油污染土壤, 探讨其对石油烃的降解效果, 分析复合菌群的加入对土壤的修复效果, 以期为混合微生物菌群高效修复石油污染土壤提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 实验材料石油污染土壤样本：土壤采自于大港油田多年石油污染的土壤表层, 采用3点取样法, 取深度5~20 cm表层土壤, 去除其中残留的植物以及杂质, 混合均匀, 利用4分法取样, 样品装入塑封袋中低温保存运回实验室, 置于4℃冰箱保存备用.
石油降解菌来源：选择实验室已筛选保存的3类石油烃有机物降解菌群构建复合菌群, 各菌群编号分别为H（氮代谢菌群26株）、K（枯草芽孢杆菌2株）和N（多粘芽孢杆菌1株）
LB培养基：酵母粉5 g, 蛋白胨10 g, NaCl 5 g, 蒸馏水1 L, 调节pH至7.0（固体培养基在此基础上加3%的琼脂即可）；
无机盐培养基（MSM）：NaNO3 1.5 g, （NH4）2SO4 1.5 g, K2HPO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5g, KCl 0.5 g, FeSO4·7H2O 0.01g, CaCl2 0.002 g, 去离子水1 L, pH 7.0~7.2.
将配置好的LB培养基和无机盐培养基均在高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌20 min后, 冷却至室温备用.
1.2 实验方法 1.2.1 复合菌群的活化与构建选择实验室4℃冰箱保存的具有石油类降解功能菌H（氮代谢菌群26株）、K（枯草芽孢杆菌2株）和N（多粘芽孢杆菌1株）菌群, 分别进行活化, 在200 r·min-1, 30℃条件下活化12 h分别得到菌液, 菌液菌活数分别为3.21×108、4.56×108和2.98×109 CFU·mL-1.
分别取活化后的H菌液（含有氮代谢菌群26株）, H和K菌液（HK：含有氮代谢菌群26株+枯草芽孢杆菌2株）, H和N菌液（HN：含有氮代谢菌群26株+多粘芽孢杆菌1株）, H、K和N菌液（HKN：含有氮代谢菌群26株+枯草芽孢杆菌2株+多粘芽孢杆菌1株）各10 mL接种至新鲜LB培养基中, 在200 r·min-1, 30℃条件下培养12 h, 制备得到复合菌群菌液H、HK、HN和HKN, 菌液菌活数为3.21×108、3.86×108、7.56×108和4.98×108 CFU·mL-1.
1.2.2 复合菌群对石油污染土的降解将采集的石油污染土壤样品研磨后过10目筛, 取过筛后石油污染土壤样本15 g加入250 mL锥形瓶中, 加入150 mL超纯水. 分别加入H、HK、HN和HKN菌液50 mL, 以不加入菌液作为空白处理J0, 在200 r·min-1, 28℃的条件下摇床培养20 d, 得到污染土壤降解液.
1.2.3 土壤指标测定取实验组以及自然降解组J0培养20 d后的土壤混合液充分振荡20 min, 静置5 min. 按下述方法测定土壤各理化性质：使用电位法[24]测定土壤pH；使用质量法测定土壤盐度[25]；分光光度法测定土壤总磷（TP）[26]；采用分光光度法测定土壤中总氮（TN）[27]；TOC分析仪测定土壤有机质（SOM）含量 [28]. 以未培养的原始石油污染土壤样品作为对照, 分别测定原始土壤样本J0、H、HK、HN和HKN组中土壤各理化性质指标, 测定3次取平均值, 原始土壤样本理化指标如表 1.
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表 1 原始污染土壤理化指标 Table 1 Physical and chemical indexes of original contaminated soil |
1.2.4 石油降解率测定
将培养完成的土壤混合液倒入分液漏斗中, 加入10 mL石油醚进行萃取, 将萃取液在5 000 r·min-1的条件下离心10 min并收集上清液. 将上层萃取液用无水硫酸钠过滤后装入25 mL容量瓶中, 并用石油醚定容至刻度线[29]. 利用紫外-可见分光光度计测定实验组及对照组萃取液在225 nm处吸光度[30]. 由标准曲线计算相应的石油剩余浓度, 并由以下公式计算出实验组及对照组的石油降解率, 测定结果最后取平均值.
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取培养20 d后的实验组H、HK、HN、HKN和自然降解组J0土壤样本各10 mL, 提取样本DNA进行微生物群落检测, 分析5组样本群落结构组成；使用引物对16S rRNA基因V3-V4可变区域进行PCR扩增. 扩增程序如下：95℃预变性3 min, 变性至延伸循环30次（95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s）, 72℃稳定延伸10 min；各样品测序和数据分析由天津诺禾致源生物信息科技有限公司完成.
2 结果与分析 2.1 石油污染土壤理化性质测定结果由图 1可知, 各实验组在微生物修复过程中土壤pH、盐度、有机质、总氮和总磷整体均呈下降趋势, 随着培养时间的延长, 土壤的理化性质逐渐趋于稳定. 这种现象的出现是因为微生物在降解石油烃的过程中会大量消耗土壤中的这些物质, 土壤中的石油烃作为唯一碳源给微生物提供能量和营养物质, 微生物进行生长代谢发育, 改变了土壤理化性质. 其中, 未加入外源菌的空白对照组J0在培养过程中土壤理化性质也会改变, 说明土壤中的土著微生物也可以改善土壤理化性质；而加入了外源菌的H、HK、HN和HKN组中土壤各理化成分下降更明显, 说明加入外源复合菌群后土壤中微生物组成更加丰富, 相较于土著微生物对土壤性质改变更明显.
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图 1 合成种群对石油污染土壤理化性质影响 Fig. 1 Effect of synthetic populations on the physicochemical properties of petroleum-contaminated soil |
土壤中各环境因子之间相关关系如图 2所示, 土壤中石油烃（THP）含量与TN和TP呈显著正相关（P < 0.01）, THP与EC和SOM呈显著正相关（P < 0.05）, THP与土壤脱氢酶（S-DHA）呈显著负相关（P < 0.01）；TN与EC和SOM呈显著正相关（P < 0.05）, TN与S-DHA呈显著负相关（P < 0.05）；TP与TN和EC呈显著正相关（P < 0.01）；SOM与S-DHA呈显著负相关（P < 0.01）；TP和EC与S-DHA呈显著负相关（P < 0.05）.
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不同星号表示相关性值的显著性：P≥0.05, 无标记, *表示0.01≤P < 0.05, **表示0.001≤P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 2 土壤中各个环境因子间相关性分析 Fig. 2 Correlation analysis between various environmental factors in soil |
混合菌群的加入对石油降解情况如图 3所示. 空白对照J0组在不加任何菌剂的情况下, 土壤石油烃的降解率达到9.82%, 表明土壤中的土著微生物对石油烃也有一定的降解效果；已有研究表明添加外源菌剂可显著提高降解效果[31 ~ 33], 当各菌株复配后, 各体系对石油的降解率均有提高, 添加不同复合菌剂的实验组中石油烃降解率分别为：H组33.22%、HK组41.36%、HN组47.93%和HKN组61.06%. 实验中添加外源混合菌群的H、HK、HN和HKN组对石油烃的降解能力明显高于空白对照J0组, 且随着添加外源菌的种类增加, 石油烃的降解率逐渐提高, 其中HKN组降解率最高, 达到61.06%. 周敏等[34]采用酸沉法从芽孢杆菌（Bacillus sp.）ZG0427培养液中提取了生物表面活性剂, 结果表明利用芽孢杆菌与其他菌构成的复合菌剂对石油有良好的降解效果, 这与本实验的结果相一致. 本实验结果表明加入外源混合菌群对石油烃的降解效果优于自然降解组, 且加入芽孢杆菌能促进石油烃的降解, 混合菌群的添加能更好地修复石油污染土壤.
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图 3 各处理组对土壤中石油降解情况 Fig. 3 Petroleum degradation in the soil by each treatment |
图 4（a）为各样本中门分类水平上种群的组成. 其中在自然降解J0组（未添加外源菌种）中相对丰度较高的有拟杆菌门（Bacteroidota, 29.98%）和变形菌门（Proteobacteria, 22.69%）等；实验组H（只添加氮代谢菌群）中相对丰度较高的有拟杆菌门（Bacteroidota, 35.41%）和变形菌门（Proteobacteria, 26.24%）等；HK组中相对丰度较高的有变形菌门（Proteobacteria, 30.65%）等；HN组中相对丰度较高的有拟杆菌门（Bacteroidota, 36.41%）和变形菌门（Proteobacteria, 30.73%）等；HKN组相对丰度较高的分别为拟杆菌门（Bacteroidota, 31.69%）和变形菌门（Proteobacteria, 29.14%）等.
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图 4 不同复合种群门水平和属水平的相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of different composite populations at the phylum and genus levels |
由于各处理中添加的菌种各不相同, 因此在培养完成后各组中优势菌群的种类及相对丰度也各有差异：在5组样品处理中, 变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）的相对丰度都很高, 说明这3类菌在石油污染土壤中均可以大量繁殖生长, 也对石油烃有良好的降解能力；而在降解率最高的HKN组（添加3种外源复合菌种）中蓝细菌[35]（Cyanobacteria）的相对丰度明显高于其余4组处理, 说明蓝细菌在石油污染土壤中可以更好地利用石油烃进行生长发育, 也从另一方面说明这类菌可以高效降解石油烃等污染物.
图 4（b）为各样本中属分类水平上种群的组成. 自然降解J0组中相对丰度较高的菌分别为橙黄褐指藻杆菌属（Phaeodactylibacter, 18.17%）和芽孢杆菌属（Bacillus, 5.58%）等；实验组H中相对丰度较高的有橙黄褐指藻杆菌属（Phaeodactylibacter, 25.1%）等；HK组中相对丰度较高的有芽孢杆菌属（Bacillus, 5.74%）和噬氢菌属（Hydrogenophaga, 4.23%）等；HN组中相对丰度较高的有橙黄褐指藻杆菌属（Phaeodactylibacter, 29.73%）等；HNK组中相对丰度较高的分别为橙黄褐指藻杆菌属（Phaeodactylibacter, 24.3%）和unidentified-Chloroplast（9.36%）等.
综合各实验组中菌群的门属水平分析, 各组处理土壤中均含有橙黄褐指藻杆菌属（Phaeodactylibacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）, 且物种相对丰度较高；随着各组处理中土壤石油降解率的提高, 橙黄褐指藻杆菌属（Phaeodactylibacter）相对丰度逐渐提高；而石油降解率最高的HNK组出现unidentified-Chloroplast菌属相对丰度较高, 说明该菌属对土壤中石油烃的降解起到了关键作用, 也表明该菌更具有研究价值.
2.5 复合菌群Heatmap热图分析由图 5各组中热图聚类分析可知, 不同处理组之间物种差异明显, 各组间优势菌各不相同. J0组主要优势菌有：卟啉单胞菌（Porphyromonas）和拉里杆菌（Laribacter）；HK组主要优势菌有鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、MND1和节细菌（Arthrobacter）等；HN组主要优势菌有梭杆菌（Fusobacterium）、单胞菌（Brevundimonas）和大肠杆菌志贺菌（Escherichia⁃Shigella）；H组主要优势菌有沉积物袁其朋氏菌（Qipengyuania）和帕加罗杆菌（Pajaroellobacter）等；HKN组主要优势菌有丰佑菌（Opitutus）、沃斯氏菌（Devosia）和缓生根瘤菌（Bradyrhizobium）等. 本实验结果表明, 各处理组中加入菌群不同, 物种丰度也各不相同, 各组之间优势菌差异较大.
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图 5 不同复合菌群门水平和属水平热图 Fig. 5 Heatmaps at different phylum and genus levels of composite microbial communities |
由Venn图分析可知（图 6）, 5组处理中共有586种菌, 空白对照J0组独有的菌种数为111种, H组独有的菌种数为58种, 额外加入枯草杆菌（HK组）和加入多粘芽孢杆菌（HN组）独有的菌种数分别为848、141种, 加入3种混合菌群的HKN组单独具有的菌种数为80种；比较不同样品处理中菌种数大小, 其中HK组处理中具有更多的细菌种类（2 289种）, J0组、H组、HN组和HKN组中细菌种类数相差不大, 分别为1 288种、1 105种、1 295种和1 098种.
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图 6 不同复合菌群Venn图 Fig. 6 Venn diagram of the different complex bacterial groups |
稀释性曲线是生态学领域的一种常用方法, 通常用来探究样本alpha多样性随抽取深度的变化趋势, 评估样本中物种的丰富度分布情况. 如图 7所示, 不同群落的稀释性曲线是分离的, 在不同尺度上, 不同群落的多样性变化趋势是一致的. 比较图 7中各组稀释性曲线可知, 在相同的测序深度下, 各实验组中物种多样性从大到小依次为：HK组 > HN组 > J0组 > HKN组 > H组.
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图 7 不同复合菌群稀释性曲线 Fig. 7 Dilution curves of different compound consortia |
Rank-abundance曲线可用来表述群落的物种组成和多样性, 通常用来分析群落中不同种类的物种相对丰度和物种均匀度[36]. 将每个样本中的OTU按相对丰度由大到小排序得到相应的排序编号, 再以OTU的排序编号为横坐标, OTU中的相对丰度为纵坐标绘制曲线. 在水平方向上, 物种的丰富度由曲线的宽度反映, 曲线在横轴上范围越大表明物种丰富度越高；在竖直方向上, 曲线的平滑程度反映样品中物种的均匀程度, 曲线越平缓, 物种分布越均匀. 由图 8中曲线可以分析各组样品的多样性：随着5种样本中OTU数量的提高, 曲线下降趋于平缓, 物种分布较均匀. 通过比较图 8中5种处理样本的Rank-abundance曲线, 可明显看出HK组在横轴的跨度最大, 曲线下降最平缓, 表明HK组物种组成最为丰富, 该样本中OTU数量最多；而其余3组（HN、H和HKN）与空白对照组J0相比曲线差异不大, 说明在物种相对丰度上差异不明显, 3组实验处理土壤中物种相对丰度大小表现为：HK组 > HN组 > J0组 > HKN组 > H组.
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图 8 合成种群的层级丰度曲线 Fig. 8 Hierarchical abundance curve of the composite population |
图 1加入复合菌群的实验组中对土壤理化性质均有不同程度的改变, 本实验开始初期土壤的pH、SOM、TN、TP和盐度均有明显下降. 理化性质的改变对菌群结构产生了影响. 由于微生物降解石油过程中产生羧酸类物质, pH总体呈现降低趋势, 这与Chakravarty等[37]关于土壤pH变化的研究结果一致. 在实验至20~30 d时pH保持在7.87~8.20之间, 为烃类物质矿化提供了更好条件[38]. 随着微生物对石油烃的降解, 菌群的代谢物使得土壤pH略微升高, 而土壤SOM、TN、TP和EC逐渐稳定, 表明微生物在土壤中生长代谢趋于饱和, 土壤理化性质逐渐稳定；图 2反映土壤中石油烃（THP）含量与TN、TP、EC和SOM之间均有显著相关性. 微生物的高活性促进了石油烃的降解, 这与Devi等[39]和张博凡等[40]研究的结论一致. HKN组对石油烃的降解效果最好, 最高达61.03%, 即加入外源复合菌群可显著提高石油烃的降解率, 这与Chaudhary等[41]运用生物强化和生物刺激等手段提高土壤修复效率结果一致. 图 4和图 5结果显示, 由于在处理组中加入氮代谢菌群和芽孢杆菌群, 各实验组中变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）为优势门类, 这4类微生物在修复石油污染土壤中促进碳氮循环过程, 从而加速了大分子污染物的降解和转化[42]；在属水平上, 橙黄褐指藻杆菌（Phaeodactylibacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）和噬氢菌属（Hydrogenophaga）为优势菌属, 在培养过程中氮代谢菌群和芽孢杆菌菌群逐渐成为关键功能菌属, 其中噬氢菌属（Hydrogenophaga）具有反硝化作用[43], 利用硝化菌与反硝化菌氧化分解大分子有机物；氮代谢菌群可促进石油烃的降解, 董甜姿等[44]采用芳烃降解菌, 通过反硝化培养基获取能够进行反硝化作用的芳烃降解菌. 多粘芽孢杆菌的加入也提高了石油降解率, 王海峰等[45]以稠油为唯一碳源, 从被稠油污染过的土壤中筛选到一株芽孢杆菌为高效石油烃降解菌, 该菌主要降解稠油中C9~C40的烷烃组分；且在石油降解率最高的HKN组中优势菌丰佑菌[46]、沃斯氏菌[47]和缓生根瘤菌[48]是土壤中常见菌种, Sánchez等[49]研究表明蓝细菌与存在于蓝细菌鞘内的异养细菌形成一个联合体, 该联合体可以在原油存在的条件下生长, 因此在修复石油污染土壤中适当添加蓝细菌及其代谢物可有效改善土壤环境. 各组间物种丰富度的差异和图 6表明不同实验组之间种群的逻辑关系：在HKN组中菌种数最少, 但石油降解率最高, 说明在石油污染土壤中由于环境恶劣造成微生物大量死亡, 剩余微生物可以利用石油烃中组分生长代谢, 最终组成石油降解的优势菌群；稀释性曲线（图 7）和均匀度曲线（图 8）分析结果表明, 添加外源复合菌剂各组相比于空白对照组物种丰富度会有不同程度地提高, 物种群落组成更丰富稳定, 且均能提高土壤修复效果.
4 结论（1）复合菌群的引入改变了石油污染土壤中菌落的组成结构, 微生物利用石油烃作为唯一碳源进行生长发育代谢, 改善了土壤理化性质. 石油污染土壤中石油烃的含量与总氮、总磷、盐度、有机质都呈显著正相关；与土壤脱氢酶呈显著负相关.
（2）复合石油降解菌对石油烃的降解效果明显好于单一土壤的降解作用. 加入3种复合石油降解菌群的降解率可达61.03%, 比单一土壤中微生物降解效率最多提高51.76%.
（3）通过在石油污染土壤中添加外源菌群, 微生物物种丰富度和物种均匀度均有不同程度的提高；经过长时间的富集筛选, 存活下来的菌群与土壤中原有的土著微生物构成对石油烃具有良好降解效果的复合菌群, 为微生物降解石油污染土壤提供理论依据.
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