环境科学  2025, Vol. 46 Issue (1): 399-408   PDF    
引用本文
黄泽凯, 刀承娇, 马鹏翔, 李博, 阎凯. 兰坪主要铅锌矿复垦区氮循环相关细菌群落特征及其与土壤的响应[J]. 环境科学, 2025, 46(1): 399-408.
HUANG Ze-kai, DAO Cheng-jiao, MA Peng-xiang, LI Bo, YAN Kai. Characteristics of Nitrogen Cycle-related Bacterial Community and Its Response to Soil in the Main Lead-zinc Mine Reclamation Area of Lanping[J]. Environmental Science, 2025, 46(1): 399-408.
兰坪主要铅锌矿复垦区氮循环相关细菌群落特征及其与土壤的响应
黄泽凯, 刀承娇, 马鹏翔, 李博, 阎凯     
云南农业大学资源与环境学院, 昆明 650201
收稿日期: 2023-12-31; 修订日期: 2024-04-11
基金项目: 国家自然科学基金项目（32160304）；云南省基础研究专项（202201AT070271）；云南省农业联合专项（202301BD070001-103）；兴滇英才青年人才项目（XDYC-QNRC-2022-0011）；云南省院士（专家）工作站项目（202305AF150042）
作者简介: 黄泽凯（1999~）, 男, 硕士, 主要研究方向为矿区土壤氮循环微生物, E-mail：18013941913@163.com
通信作者: 李博, E-mail：libo@ynau.edu.cn
摘要: 氮循环对土壤生态系统元素循环具有重要影响, 理清氮循环微生物的关键环境因素对矿区生态恢复起着至关重要的作用.功能菌群可以通过参与矿区土壤元素生物地球化学循环, 调控植被生长, 有益于矿区复垦.兰坪铅锌矿是亚洲最大的露天铅锌矿开采区, 矿区土壤镉含量是云南省重金属含量背景值95.6~388.7倍, 亟需开展矿区生态恢复.为了探究铅锌矿复垦区氮循环细菌与土壤的响应, 以兰坪铅锌矿复垦区土壤样品为研究对象, 采用16S rRNA高通量测序技术、共现网络分析、PCoA、Manteltest和随机森林揭示兰坪铅锌矿复垦区在不同养分梯度下对氮循环功能微生物类群的影响.结果表明, 优势菌属均来自亚硝化单胞菌科（Nitrosomonadaceae）下的未标注到的物种.铅锌对铅锌矿区氮循环功能微生物影响有限, 更多的是有机质（SOM）和pH的影响.铵态氮（NH4+-N）、硝态氮（NO3--N）和pH分别是影响硝化作用、反硝化作用和固氮微生物的关键理化因子.
关键词: 氮循环      细菌      铅锌矿复垦区      高通量测序      共现网络分析     
Characteristics of Nitrogen Cycle-related Bacterial Community and Its Response to Soil in the Main Lead-zinc Mine Reclamation Area of Lanping
HUANG Ze-kai , DAO Cheng-jiao , MA Peng-xiang , LI Bo , YAN Kai     
College of Resources and Environment, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China
Abstract: The nitrogen cycle has an important impact on the element cycle of the soil ecosystem. Moreover, it is important to clarify the key environmental factors of nitrogen cycle microorganisms for ecological restoration in mining areas. The functional flora can regulate the growth of vegetation by participating in the biogeochemical cycle of soil elements in the mining area, which is beneficial to the reclamation of the mining area. The Lanping lead-zinc mine is the largest open-pit lead-zinc mining area in Asia. The content of Cd in the soil of the mining area was 95.6-388.7 times the background value of heavy metal content in Yunnan Province, and it is urgent to carry out ecological restoration in the mining area. To explore the response of nitrogen cycling bacteria to the soil in a lead-zinc mine reclamation area, soil samples from the Lanping lead-zinc mine reclamation area were considered as the research object, and the effects of different nutrient gradients on nitrogen cycling functional microbial groups in the Lanping lead-zinc mine reclamation area were revealed using 16S rRNA high-throughput sequencing technology, collinear network analysis, PCoA, Mantel test, and random forest. The results showed that the dominant bacteria were all from the unmarked species of Nitrosomonadaceae. The effect of lead and zinc on nitrogen cycling functional microorganisms in the lead-zinc mining area was limited, and the effects of organic matter and pH were greater. Ammonium nitrogen (NH4+-N), nitrate nitrogen (NO3--N), and pH were the key physical and chemical factors affecting nitrification, denitrification, and nitrogen-fixing microorganisms, respectively.
Key words: nitrogen cycle      bacteria      lead-zinc mine reclamation area      high-throughput sequencing      collinear network analysis     

矿产资源开采的同时会造成大面积的地面塌陷, 破坏了矿区周边的生态环境, 造成土地退化和植被破坏等生态问题[1].因此, 铅锌矿区土壤的生态恢复成为矿区复垦的研究热点之一.土壤微生物在土壤生态系统中起到了重要作用[2], 土壤中微生物的种类繁多, 能推动土壤系统中的生物化学过程[3], 维持生态系统功能[4].

矿区开采还会造成严重的重金属污染[5].重金属具有潜伏性、长期性、累积性和不可逆性[6].重金属污染不仅会对土壤和作物产生恶劣的影响, 还会危害人体健康[7].《全国土壤污染状况调查公报》[8]表明, 全国土壤重金属总体超标率为16.1%, Pb和Zn的超标率分别达1.5%和0.9%, 其中Pb因毒性极强, 是国家重点严控的重金属.

氮是所有生物的重要组成部分, 也是限制地球上生命的主要营养物质[9].因此, 氮循环对恢复重金属污染严重的矿区具有重要作用.目前, 土壤中的氮循环主要包括：①固氮作用（nitrogenfixation）；②硝化作用（nitrification）；③反硝化作用（denitrification）[10].微生物参与土壤氮循环会影响土壤质量和耕地的生产力可持续性, 并对全球气候产生重大影响.功能菌群可以通过参与矿区土壤元素生物地球化学循环, 调控植被生长, 有益于矿区复垦[11].通过探索土壤-微生物之间关系, 可揭示特定功能菌群对于土壤环境变化的响应, 有助于定向调控矿区生态系统自恢复能力, 反硝化微生物能对微生物生态网络复杂性和生态功能维持上产生重要作用.江晓亮[12]在青藏高原湿地的研究中发现反硝化微生物的丰度受有机碳（TOC）、含水率和硝态氮（NO3--N）影响, 但对反硝化微生物影响最大的环境因子没有研究.

不同的环境会对功能微生物产生不同的影响, 良好的生态环境会对微生物产生良好的影响[13], 反之, 恶劣的生态环境会限制微生物的生长.目前, 对矿区关键环境因素的研究较多, 主要的关键环境因子为SOM或pH, 如：平朔煤矿区的关键环境因素为硝态氮、铵态氮（NH4+-N）、速效磷（AP）、pH、全氮（TN）和含水量[14 ~ 17]；北京金矿的关键环境因素为有机碳、全氮、Cd和Hg[18,19]；在重庆潼南区汞矿的研究中发现, 有机质（SOM）、pH、As和Pb对微生物群落结构影响显著[20].但针对兰坪铅锌矿区氮循环微生物群落的关键环境因素的研究较少.因此, 本文以兰坪铅锌矿复垦区为研究区域, 采集该矿区不同开矿方式土壤, 通过16S rRNA高通量测序技术检测了氮循环不同功能微生物类群的基因丰度, 揭示不同养分含量对土壤氮循环相关功能微生物类群结构和组成的响应以及矿区氮循环功能微生物的关键环境因子, 以期为后续矿区功能菌群研究以及矿区复垦提供科学依据.本文提出以下假说：①环境变化对氮功能微生物群落结构影响大；②铅锌可能对铅锌矿区氮循环微生物的影响有限, 更多的是SOM和pH的影响；③硝态氮对反硝化作用微生物影响最大.

1 材料与方法 1.1 研究区域概况

云南兰坪铅锌矿（100.09°E, 22.27°N）位于云南省西北部的怒江州兰坪县金顶镇.兰坪铅锌矿床是亚洲最大的露天铅锌矿开采区, 也是世界第四大铅锌矿[21].铅锌储量达到1 500万t, 占全国铅锌储量的16%.矿区属于温带气候, 年平均气温10.4~11.8℃, 平均年降雨量为1 088.43 mm[22], 良好的气候条件有助于矿床的一系列化学风化作用.

1.2 样品采集及分析方法

2021年5月, 于兰坪铅锌矿区进行土壤样品的采集.如图 1, 在4个区域[凤凰山铅锌矿S1（露天大型矿区人工复垦区）、兔子山铅锌矿S2（洞采小型铅锌矿自然恢复区）、菜籽地铅锌矿S3（地下开采矿区）、采石场S4（非铅锌矿）]共采集50个土样, 随机采集土壤的深度为5~20cm.其中凤凰山和菜籽地铅锌矿属于边开采边修复的策略, 兔子山铅锌矿为上世纪90年代初开采, 2006年封存的遗留矿洞, 而采石场作为对照组.本研究将50个样点按照氮循环OTU总数或土壤养分含量梯度划分为2个组, L（低数量/含量）、H（高数量/含量）每个组各25个样.

图 1 兰坪铅锌矿复垦区采样点示意 Fig. 1 Setting of sampling sites in the reclamation area of Lanping lead-zinc mine

土壤元素测定方法均源自《土壤农化分析》[23], 土壤样品在用四分法研磨后, 分别过20目和100目的筛备用. 使用pH计测定土壤酸碱度, 将土壤和去离子水按照1∶2.5混合, 将金属杆的2/3没入混合液中, 待读数稳定后记录.全钾（TK）、全磷（TP）用NaOH熔融, 火焰光度法；AP采用0.5 mol·L-1 NaHCO3法；碱解氮（AN）采用碱解扩散法；速效钾（AK）采用NH4OAc浸提-火焰光度法；SOM采用30 min恒温水浴加热-重铬酸钾容量分析法测定；半微量（凯氏定氮法）测定总氮（TN）；氯化钾浸提-靛酚蓝比色法测定NH4+-N；酚二磺酸比色法测定NO3--N；镉（Cd）、锌（Zn）、铜（Cu）、铅（Pb）、铁（Fe）和锰（Mn）等重金属元素使用王水-高氯酸消解测定；重金属有效态采用DTPA浸提法（NY-T890-2004）测定.

1.3 土壤DNA提取与高通量测序

DNA的提取采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）, 之后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度, 在离心管中加入适量样品, 使用去离子水稀释样品至1 ng·µL-1.PCR扩增选择在V3+V4可变区, 引物用341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和806R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）.检测平台为Illumina NovaSeq, 通过DADA2对所有样品的原始序列进行质控, 去噪, 拼接, 去嵌合体, 形成OTU（operational taxonomic unit）[24].最后通过与数据库进行比对, 获得物种注释信息.

2 结果与分析 2.1 理化性质分析

针对矿区采集的50个样品理化性质, 进行显著性差异分析之后用不同字母标注显著差异, 结果如表 1所示.pH为3.82~8.24, 兔子山和菜籽地属于酸性土壤, 凤凰山和采石场属于中性土壤.土壤中有机质以及氮、磷、钾的含量直接决定了土壤可供给微生物生存和代谢的养分含量.通过土壤普查养分分级标准可知（表 2）：研究中的凤凰山铅锌矿（S1）、兔子山铅锌矿（S2）和菜籽地铅锌矿（S3）的SOM含量分别属于第三、第二和第一级别, 在露天开采的情况下, SOM含量低于洞采, 说明露天开采相对于洞采可能对土壤的危害更大.除了采石场（S4）属于第五级别, 其余采样点TP含量均属于第六级别, 而全钾含量属于第五级别, 说明这些采样点的土壤养分含量严重不足, 只能提供微生物少量的营养物质.矿区重金属污染严重, 其中ω（Cd）为26.78~108.84 mg·kg-1, 云南省ω（Cd）背景值为0.28 mg·kg-1[25], 研究区Cd含量是云南重金属含量背景值的95.6~388.7倍.

表 1 兰坪铅锌矿复垦区土壤重金属含量及其理化性质1） Table 1 Heavy metal content and physicochemical properties of soil in the Lanping lead-zinc mine reclamation area

表 2 全国第二次土壤普查养分含量分级标准/g·kg-1 Table 2 Nutrient content grading standards for the second national soil census/g·kg-1

2.2 土壤氮循环微生物多样性和群落组成

50个采样点中有49个样点检测到了微生物, 测序数据处理后共检测到了15种氮循环相关微生物, 包括固氮、硝化作用、反硝化作用、需氧氨氧化和需氧氮氧化等氮循环功能微生物.各采样点群落组成如图 2所示, 变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）为优势菌门, 相对丰度大于95%.其中, 变形菌门最丰富, 表明它在维持矿区复垦土壤复杂生态环境中起着重要作用.尽管群落中主要菌门相似, 但相对丰度变化明显.只有S2_8和S2_9的优势菌门为Cyanobacteria（蓝藻菌门）, 相对丰度分别为58.89%和81.24%.凤凰山矿区（S2）变形菌门的相对丰度显著低于其他矿区（P < 0.05）, 可能是由于凤凰山矿区的重金属污染比其他矿区更严重.

1. S1_1, 2. S1_10, 3. S1_12, 4. S1_13, 5. S1_14, 6. S1_15, 7. S1_16, 8. S1_2, 9. S1_3, 10. S1_4, 11. S1_5, 12. S1_6, 13. S1_7, 14. S1_8, 15. S1_9, 16. S2_1, 17. S2_10, 18. S2_11, 19. S2_12, 20. S2_13, 21. S2_14, 22. S2_15, 23. S2_16, 24. S2_17, 25. S2_18, 26. S2_19, 27. S2_2, 28. S2_20, 29. S2_3, 30. S2_4, 31. S2_5, 32. S2_6, 33. S2_7, 34. S2_8, 35. S2_9, 36. S3_1, 37. S3_2, 38. S3_3, 39. S3_4, 40. S3_5, 41. S3_6, 42. S3_7, 43. S4_1, 44. S4_2, 45. S4_3, 46. S4_4, 47. S4_5, 48. S4_6, 49. S4_7；S1为凤凰山铅锌矿的样点, S2为兔子山铅锌矿的样点, S3为菜籽地铅锌矿的样点, S4为采石场的样点 图 2 采样点群落组成 Fig. 2 Community composition of sampling sites

为探究矿区优势氮循环功能微生物, 对不同的SOM、有效态Pb、氮循环微生物OTU总数和pH梯度进行属水平的微生物共现网络分析.图 3（a）和图 3（b）分别表示低、高含量SOM, 图 3（c）和图 3（d）分别表示低、高含量有效态Pb, 图 3（e）和图 3（f）分别表示低、高数量氮循环微生物OTU总数, 图 3（g）和图 3（h）分别表示低、高pH, 并计算微生物共现网络参数（参数与图相对应）, 图例括号内为物种相对丰度.结果可知, 微生物优势菌属都为Nitrosomonadaceae（亚硝化单胞菌科）下的未标注到的MND1、Ellin6067和mle1_7物种, 其中MND1相对丰度最高, 达到20%~28.29%.

图 3 基于不同SOM、有效态Pb、氮循环微生物OTU总数和pH的共现网络分析 Fig. 3 Collinear network analysis based on different SOM, available Pb, total number of nitrogen cycling microbial OTUs, and pH

根据微生物共现网络参数发现（表 3）, 低SOM含量下的节点数、边、网络直径、平均聚类系数和平均路径长度多于高SOM含量, 平均度、平均加权度和图密度少于高SOM含量.通过单样本t检验发现, 节点数有显著差异, 分别为524和436, 低SOM的节点比高SOM含量多了20.1%.

表 3 氮循环微生物共发生网络参数 Table 3 Parameters of nitrogen cycling microbial co-occurrence network

为了探索样品中的氮循环微生物群落结构, 图 4分别表示对不同SOM、有效态Pb、氮循环微生物OTU数量和pH分类进行PCoA.各PC1轴的解释度均为17.88%, PC2轴的解释度为9.77%, 共解释度为27.65%.在PCoA图中, 点距离越近, 说明采样点的微生物群落结构越相似.在图 4（a）和图 4（d）中, 低浓度组和高浓度组位置距离较远, 说明低浓度和高浓度的微生物群落结构差异很大, 这是由于各采样点的环境因子不同造成的.而图 4（b）和4（c）部分采样点距离较近, 这是由于各采样点的环境因子不同造成的, 表明有效态Pb和氮循环微生物OTU数量不是导致微生物群落结构变化的原因.

图 4 基于不同SOM、有效态Pb、氮循环微生物OTU总数和pH梯度氮循环微生物PcoA Fig. 4 Gradient nitrogen cycling microorganisms PcoA based on different SOMs, available Pb, total number of nitrogen cycling microorganisms OTU, and pH

2.3 氮功能微生物类群与环境因子间相关关系

采用Mantel test探索主要氮循环功能微生物与理化因子的关系（图 5）, 对反硝化作用、氮呼吸、硝化作用和固氮作用微生物进行分析.红色表示正相关, 蓝色表示负相关, 颜色越深说明相关性越强.结果表明, 反硝化作用微生物受TN、AK和Mn显著影响；氮呼吸作用微生物主要受TN、AK、SOM和Mn的显著影响；固氮微生物主要受SOM、pH、Zn和有效态Mn的显著影响；硝化作用微生物主要受SOM、pH、Zn、Mn、pH、有效态Cd和有效态Fe的显著影响.

1. TN, 2. TP, 3. TK, 4. AN, 5. AP, 6. AK, 7. SOM, 8. Pb, 9. Cd, 10. Cu, 11. Zn, 12. Fe, 13. Mn, 14. pH, 15. NH4+-N, 16. NO3--N, 17.有效态Pb, 18.有效态Cd, 19.有效态Cu, 20.有效态Zn, 21.有效态Fe, 22.有效态Mn 图 5 土壤氮功能微生物类群与环境因子Mantel检验 Fig. 5 Mantel test of soil nitrogen functional microbial communities and environmental factors

为研究哪种环境因子对氮循环功能微生物的影响更重要, 分别对硝化作用、反硝化作用和固氮微生物做随机森林分析, 提取影响因素前5的环境因子做柱状图（图 6）.基尼函数平均下降（mean decrease gini, MNG）表示该环境因子对微生物的影响程度, 该值越高说明该环境因子对微生物的影响越关键.结果表明, 铵态氮、硝态氮和pH分别是影响硝化作用、反硝化作用和固氮微生物的关键理化因子.

图 6 基于随机森林模型环境因子对硝化作用、反硝化作用和固氮微生物的平均预测因子重要性 Fig. 6 Importance of average predictive factors for nitrification, denitrification, and nitrogen-fixing microorganisms based on random forest model environmental factors

3 讨论

本研究主要对兰坪铅锌矿区土壤微生物群落特征及氮循环微生物进行初步探究.氮循环对重金属污染矿区具有恢复作用, 氮循环微生物对矿区复垦有积极作用[25].矿区及周边土壤重金属超标严重, 各区域土壤中养分含量有显著差异, 影响土壤氮循环微生物的群落组成和丰度[26,27].

3.1 不同矿区优势菌群的比较

不同矿区的细菌都有差异, 这可能是由于环境差异造成的.本研究中, 矿区各区域采样点的优势菌属都是来自变形菌门下的亚硝化单胞菌科.有研究表明, 变形菌门是生物地球化学循环中高度多样化和活跃的类群[28].变形菌门是安徽哈密煤矿、安徽铜陵狮子山金属硫化物矿、广西柳州泗顶铅锌矿和贵州铜仁汞矿等的优势菌门[29 ~ 32].氮循环微生物广泛存在于土壤环境中, 如变形菌门、蓝藻菌门、厚壁菌门和疣微菌门（Verrucomicrobia）；根瘤菌属（Rhizobiaceae）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）和纤维素单胞菌（Cellulomonas）[33].而安徽省的罗河成矿带的黄铁矿主要是放线菌门、浮霉菌门[34].侯冬梅[35]在七宝山矿区发现叶杆菌属（Phyllobacterium）、拟杆菌属（Bacteroides）和硫卵化物属（Sulfurovum）可以修复重金属污染.本研究发现兰坪铅锌矿的氮循环功能微生物优势菌门为变形菌门与泗顶铅锌矿剖层土中固氮微生物的研究一致[36].土壤pH、养分含量与重金属含量在不同采样点下表现出显著差异（表 1）.各采样区域理化性质的不同可能是由于矿石处置时间、复垦年限以及不同采样深度的微生物代谢活动的水平和性质[15,27]所导致的.本研究中, 在低含量和高含量养分组, 共现网络参数中节点数、边、网络直径、图密度和平均路径长度有显著的差异（表 3）, 说明环境变化对氮功能微生物群落结构影响大.

3.2 不同矿区关键环境因素的比较

矿区氮循环微生物群落组成不仅受重金属污染的影响, 还受到土壤水分和理化性质等因素影响, 如表 4所示, 尤其是受到SOM、Pb、Cd和pH的影响, 这和李雨桐等[20]在重庆潼南区汞矿的研究中发现有机质、pH、As和Pb对古菌群落结构的影响显著相似.Wu等[37]的研究也发现SOM、TN和pH主要影响微生物群落相对丰度的变化.本研究中, 通过PCoA发现（图 4）, 氮循环OTU数量和有效态Pb含量不是影响兰坪铅锌矿氮循环微生物主要原因.在前人对泗顶铅锌矿区的研究中发现, SOM、TP、TN、pH和含水率是关键环境因子[29,36,38], 也证实了虽然是铅锌矿, 但不一定铅、锌对土壤修复影响大, 反而是有机质、pH的影响更关键, 这和本研究得出结果一致.未来可以采取相应的治理措施进行矿区恢复, 比如康明晖等[39]用生物炭修复镉铅污染土壤, 发现土壤养分含量显著提高.

表 4 不同矿区的关键环境因素 Table 4 Key environmental factors of different mining areas

3.3 不同氮循环微生物关键理化因子的比较

氮循环微生物在维持生态系统的氮元素平衡中起到重要作用[48], 研究主要的氮循环微生物有利于开展矿区复垦工作.在本研究中, 反硝化微生物的关键理化因子是NO3--N, 这和陈浮等[14]的研究中发现黄土高原氮相关功能微生物类群与NO3--N呈显著正相关基本一致.固氮和硝化作用微生物的关键理化因子分别为pH和NH4+-N, 而李君剑等[48]认为TN是固氮菌、硝化菌的重要驱动因素, 这是因为植被恢复方式通过影响生长代谢所需的有机碳和总氮间接影响土壤微生物群落.

4 结论

（1）不同采样点重金属污染严重, 土壤理化差异明显, 镉含量是云南省背景值的95.6-388.7倍.养分含量低, 土壤受重金属污染严重.

（2）不同养分梯度下, 氮循环微生物群落结构差异较大, 在各组采样点中, 优势菌门为变形菌门, 亚硝化单胞菌科均为优势菌科, 优势菌属都是来自亚硝化单胞菌科下的未标注到的物种, 微生物数量取决于土壤环境.

（3）土壤有机质和pH是影响氮循环微生物的关键环境因子.

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