2024, Vol. 45
2. 青海省高寒草地适应性管理重点实验室, 西宁 810016;
3. 青海大学三江源区高寒草地生态教育部重点实验室, 西宁 810016;
4. 西北师范大学地理与环境科学学院, 兰州 730070
, ZHANG Chun-ping1,2,3 , YU Yang1,2,3 , CAO Quan1,2,3 , YANG Zeng-zeng1,2,3 , ZHANG Xiao-fang1,2,3 , WANG Min4 , DONG Quan-min1,2,3
2. Qinghai Provincial Key Laboratory of Adaptive Management on Alpine Grassland, Xining 810016, China;
3. Key Laboratory of the Alpine Grassland Ecology in the Three Rivers Region, Ministry of Education, Qinghai University, Xining 810016, China;
4. School of Geography and Environmental Science, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China
土壤是植物生命维持的物质基础, 是植物获取水肥气热的重要源泉[1].20世纪以来, 由于工业、农业和畜牧业等支柱行业的高速发展, 化学燃料和氮肥的需求量日益加剧, 导致全球陆地生态系统的氮沉降速率逐年增加[2 ~ 4].据统计, 在1860~1995年期间, 全球氮沉降量增加了3~5倍, 预计到2050年将达到2×1011 kg·hm-2[5].长期氮输入不仅引发了土壤酸化、生物多样性损失和生态系统化学元素平衡破坏等问题[6, 7], 并且导致土壤微生物群落和土壤理化性质发生改变.高寒草地是青藏高原主要的植被类型, 具有调节碳氮循环和水文气候等生态功能[8].在高寒草地生态系统中, 土壤养分严重匮缺, 氮是限制植物生长的重要因素[9, 10].青藏高原地区气候寒冷, 氮矿化速率极低, 长期氮添加给生态系统带来了显著的影响, 尤其对土壤养分循环和微生物活性产生了深刻的影响[11].目前, 多年生高寒栽培草地在恢复青藏高原退化草地和缓解草畜矛盾等方面已经取得了显著成效, 对维持生物多样性和生态系统元素平衡起着重要的调节作用.然而, 在建植后的3~5 a期间其生产功能开始退化, 解决该问题的直接手段便是氮素添加.
土壤微生物是土壤的重要组成部分, 是土壤中最丰富的有机物, 在植物残体分解和氮素转化利用等环节发挥着关键作用[12, 13], 对环境变化极其敏感[14].氮添加直接增加了土壤中的可利用氮素含量, 从而导致土壤养分的变化, 进一步影响土壤微生物群落结构[15].土壤pH和碳氮比是影响微生物活性的关键因子[16], 施氮量的增加会改变这些关键因子的大小, 从而直接或间接影响土壤微生物群落结构[17].有研究表明, 短期内低水平氮添加可有效缓解植物生长所受的N限制, 但长期输入化学氮肥会导致土壤环境恶化, 造成微生物群落结构改变和多样性丧失的严重后果[18, 19].事实上, 长期氮添加所引发的负面效应同等于过量氮添加, 最终造成的后果均是显著改变土壤理化性质和微生物群落结构[20], 导致土壤生产力下降和环境污染等一系列问题.因此, 在全球氮沉降持续升高的背景下, 开展区域性短期氮添加试验, 并确定适宜的氮添加量是实现青藏高原地区多年生高寒栽培草地可持续利用和环境保护双赢目标的关键一环.
以往研究大多以天然草地为主体, 开展了多项短期或长期的氮水平控制试验, 而不同氮形态和氮水平对多年生高寒栽培草地土壤和微生物群落结构的影响研究鲜见报道.多年生高寒栽培草地在生态系统功能恢复和维持畜牧业发展方面发挥着关键作用, 但目前尚未有支撑高寒栽培草地氮添加技术借鉴的科学证据.鉴于上述研究背景, 为探究环青海湖地区多年生高寒栽培草地的土壤和微生物特性对短期氮添加的响应, 本研究以4龄人工草地为研究对象, 通过比较分析不同施氮梯度处理下的土壤理化性质和微生物群落结构的差异, 以及二者之间的关系, 进一步明确土壤理化性质和微生物群落结构对短期氮添加的响应, 阐明氮添加对土壤微生物群落结构的影响及潜在机制, 以期为氮沉降增加背景下的土壤养分循环和多年生高寒栽培草地的科学施氮提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况本试验区位于青海省海南藏族自治州共和县巴卡台农牧场（100°55'E, 36°17'N）, 平均海拔3 300 m, 年平均降水量为300 mm, 年蒸发量在2 000~2 400 mm之间, 年平均气温为4.1℃.试验区冬季寒冷漫长, 夏季温和短暂, 年内干旱少雨且温度偏低, 气温垂直分布明显, 太阳辐射强, 属高原大陆性气候特征.降水季节性分布不均, 主要集中在7~10月.试验地土壤为高山草甸土和黄绵土[21].
1.2 试验设计以建植4龄的青海草地早熟禾（Poa pratensis Qinghai）+青海中华羊茅（Festuca sinensis Qinghai）混播草地为研究对象, 以尿素为氮源, 设置4个施氮梯度, 分别为T0：0 kg·hm-2·a-1、T1：22.5 kg·hm-2·a-1、T2：45 kg·hm-2·a-1和T3：67.5 kg·hm-2·a-1.采用随机区组设计, 每个处理设有3个重复, 共12个小区, 小区面积为4 m×4 m, 小区间间隔5 m.将称好的肥料分为等量的2份, 分别于6月上旬和下旬加到2 L水中溶解摇匀后装入喷壶, 均匀喷洒在相应的小区内, T0处理喷洒相应的水.在2022年8月上旬对土壤样品进行取样[22].
1.3 样品采集与分析 1.3.1 土壤样品采集在每个小区内以对角线取样法设置5个采样点, 在采样过程中, 小心清除杂草和较大的砾石, 之后用直径3.5 cm的土钻采集0~20 cm土层土壤, 混合均匀后分为3份, 其中1份被风干和研磨, 自然风干后一部分过1 mm筛用于测定速效养分含量, 1份过0.25 mm筛用于测定全量养分含量, 将另外1份混匀土样装满50 mL灭菌离心管并在-80℃保存进行微生物高通量测序[22].
1.3.2 土壤理化性质测定参照鲍士旦[23]的土壤农化分析, 进行土壤理化性质的测定.土壤pH值和电导率（EC）分别使用pH计和电导率仪进行测定（水土比为5∶1）；采用重铬酸钾（K2Cr2O7）氧化法和硫酸亚铁（FeSO4）反滴定法测定土壤有机碳（SOC）；全磷（TP）含量采用碱熔-钼锑抗比色法测定；碱解氮（AN）含量采用碱解-扩散法原理进行测定；速效磷（AP）采用碳酸氢钠（NaHCO3）浸提, 分光光度计法进行测定；利用元素分析仪对土壤全碳（TC）和全氮（TN）进行测定.铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）采用全自动间断化学分析仪（Clever Chem 380）测定.另用烘干法测定0~20 cm土层土壤含水量（SWC）, 重复3次[22].
1.3.3 土壤微生物群落的测定委托杭州联川生物科技有限公司, 选用带有Barcode信息的引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWG CAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）分别对土壤细菌和真菌进行基因序列测定.采用CTAB法对样本进行微生物组总DNA的提取, 通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量, 同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量.进行引物PCR扩增时, PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳确证.PCR产物由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA, USA）纯化, PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测, 回收采用AMPure XT beads回收试剂盒.对纯化后的PCR产物使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent, 美国）和Illumina（Kapa Biosciences, Woburn, MA, 美国）的文库定量试剂盒进行评估, 检验合格后上机测序[22].
本文报道的原始序列数据已存放在中国生物信息中心/中国科学院北京基因组研究所国家基因组学数据中心（核酸研究中心2022）基因组序列档案（基因组学、蛋白质组学和生物信息学2021）（GSA：CRA014635；CRA014636）, 可在https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa上公开获取.
1.4 数据分析与作图采用Microsoft Excel 2010进行原始数据的整理, 运用SPSS 27.0进行数据统计分析：采用单因素方差分析（P < 0.05）检验不同氮素添加方式下土壤理化性质和微生物群落结构的差异.Venn图通过在线平台https://www.omicstudio.cn/tool/112完成；主坐标分析（principal coordinates analysis, PCoA）通过在线平台https://www.omicstudio.cn/tool/24完成；LEfse分析（linear discriminant analysis effect size, LEfSe）由在线平台https://www.omicstudio.cn/tool/60完成；冗余分析（redundancy analysis, RDA）通过在线平台https://www.omicstudio.cn/tool/65完成；土壤理化性质和微生物群落组成图由Origin 2022制作[22].
2 结果与分析 2.1 不同施氮水平对土壤理化性质的影响由图 1可知, 与T0处理相比, 氮添加提高了SWC、SOC、NH4+-N、NO3--N、AN、AP、TP、TN和TC含量, 且随着施氮水平提高有增加趋势.SWC在不同氮水平处理间差异不显著（P > 0.05）, 与氮有关土壤化学指标的含量在不同氮水平处理间差异显著（P < 0.05）, 尤其是土壤TN变化最明显, T1、T2和T3处理的土壤TN含量较T0处理分别提高了101.92%、115.99%和169.82%.此外, 氮添加降低了土壤容重（BD）, 且随施氮水平的提高逐渐降低.T3处理显著降低了土壤pH, T1和T2处理间土壤pH差异不显著（P > 0.05）.
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同一扇形中不同小写字母表示差异显著（P < 0.05） 图 1 不同施氮水平下土壤理化性质 Fig. 1 Soil physicochemical properties under different nitrogen application levels |
对不同施氮处理下土壤细菌和真菌的OTU数量进行了韦恩分析, 并绘制了韦恩图（图 2）.由图 2（a）可以看出, 4个处理中共识别出的细菌OTU有13 764个, 其中T0、T1、T2和T3处理样地分别识别出5 224、5 358、5 543和5 127个OTU.不同施氮处理样地的土壤样品中共有的细菌OTU总数有1 316个, 占比为9.56%.CK、U、A和N所特有的OTU数目分别为2 538、2 545、2 666和2 124个, 占比分别为18.44%、18.49%、19.37%和15.43%. 4种处理下土壤中细菌OTU分布数目由大到小为：T2 > T1 > T0 > T3.由图 2（b）可以看出, 所有样本共识别出的真菌OTU数量有1 253个, 其中T0、T1、T2和T3处理样地分别识别出712、785、841和654个OTU.不同施氮处理样地的土壤样品中共有的真菌OTU总数有198个, 占比为15.80%. CK、U、A和N所特有的OTU数目分别为298、307、345和197个, 占比分别为23.78%、24.50%、27.53%和15.72%. 4种处理下土壤中真菌OTU分布数目由大到小为：T2 > T1 > T0 > T3.
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每个点分别对应横向的处理, 不同点之间的连线代表不同处理的交集, 每个点或线条分别对应于柱形图中的数据集 图 2 不同施氮水平下土壤细菌和真菌的OTU Venn图 Fig. 2 OTU Venn plots of soil bacteria and fungi under different nitrogen application levels |
基于OTU水平, 对不同施氮水平下的土壤细菌和真菌群落的Alpha多样性做了分析（表 1）.从表 1可以看出, 不同施氮水平对土壤细菌和真菌群落的Alpha多样性均没有显著影响.
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表 1 不同施氮水平下微生物群落多样性指数1） Table 1 Microbial community diversity index under different nitrogen application levels |
基于PCoA的Bray-Curtis距离, 对不同施氮水平处理下土壤细菌和真菌群落的组成做了PCoA分析（图 3）.不同施氮水平下, 对于细菌群落, 两个主成分的方差累计解释率为36.02%, 组间差异显著[P=0.002, 图 3（a）], 群落显著聚集成4个类群, 对应于4个不同的施氮水平.对于真菌群落而言, 两个主成分的方差累计解释率为38.72%, 组间差异显著[P=0.018, 图 3（b）], 群落分离不明显, 重合度较高.
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图 3 土壤细菌和真菌PCoA分析 Fig. 3 PCoA analysis of soil bacteria and fungi |
对不同氮素处理下的细菌群落组成进行分析, 共得到放线菌门（Actinobacteriota）、变形杆菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和芽单胞菌门（Gemmatimonadota）等10个细菌优势门[图 4（a）]和Geminicoccaceae_unclassified、Gemmatimonadaceae_unclassified、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Vicinamibacteraceae_unclassified等10个细菌优势属[图 4（b）].不同氮素水平对细菌优势门和优势属相对丰度的影响有所差异.氮添加提高了放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、Gemmatimonadaceae_unclassified属、Vicinamibacteraceae_unclassified属、Vicinamibacterales_unclassified属、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、芽球菌属（Blastococcus）和WD2101_soil_group_unclassified属的相对丰度, 降低了变形杆菌门、拟杆菌门（Bacteroidota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）和鞘氨醇单胞菌属的相对丰度.T2处理显著提高了酸杆菌门和绿弯菌门（Chloroflexi）的相对丰度, 显著降低了Geminicoccaceae_unclassified属的相对丰度.
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a1~a11分别表示Actinobacteriota、Proteobacteria、Acidobacteriota、Gemmatimonadota、Chloroflexi、Planctomycetota、Firmicutes、Bacteroidota、Verrucomicrobiota、Myxococcota、Others；b1~b11分别表示Geminicoccaceae_unclassified、Gemmatimonadaceae_unclassified、Sphingomonas、Vicinamibacteraceae_unclassified、Vicinamibacterales_unclassified、Actinomarinales_unclassified、Gemmatimonas、Actinobacteriota_unclassified、Blastococcus、WD2101_soil_group_unclassified、Others；c1~c8分别表示Ascomycota、Basidiomycota、Fungi_unclassified、Glomeromycota、Zygomycota、Chytridiomycota、Olpidiomycota、Aphelidiomycota；d1~d11分别表示Gibberella、Fungi_unclassified、Ascomycota_unclassified、Mortierella、Fusarium、Claroideoglomus、Fusicolla、Agaricomycetes_unclassified、Conocybe、Neonectria、Others 图 4 不同施氮水平下土壤微生物群落组成 Fig. 4 Soil microbial community composition under different levels of nitrogen application |
对不同氮素处理下的真菌群落组成进行分析, 共得到子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、未分类真菌门（Fungi_unclassified）和球囊菌门（Glomeromycota）等8个优势真菌门[图 4（c）]以及赤霉菌属（Gibberella）、未分类_真菌属（Fungi_unclassified）、未分类_子囊菌属（Ascomycota_unclassified）和被孢霉属（Mortierella）等10个优势真菌属[图 4（d）].氮添加提高了接合菌门（Zygomycota）、被孢霉属和镰刀菌属（Fusarium）的相对丰度, 降低了近明球囊霉属（Claroideoglomus）、Agaricomycetes_unclassified和锥盖伞属（Conocybe）的相对丰度.与T0处理相比, T1处理显著降低了担子菌门和Agaricomycetes_unclassified属的相对丰度, 显著提高了未分类真菌门、赤霉菌属、未分类真菌属、未分类_子囊菌属、镰刀菌属和Neonectria属的相对丰度；T2处理显著降低了担子菌门、Agaricomycetes_unclassified属和锥盖伞属的相对丰度, 显著提高了接合菌门、赤霉菌属、被孢霉属和Neonectria的相对丰度；T3处理显著降低了壶菌门（Chytridiomycota）的相对丰度, 显著提高了镰刀菌属的相对丰度.
LEfSe分析鉴定了不同氮添加处理下微生物群落的生物标记物（图 5）.在细菌群落中, LDA分析检测到17个（T0 = 5, T1 = 4, T2 = 7, T3 = 1）具有显著生物统计学意义的生物标志物[图 5（a）].在分类水平上, T0、T1、T2和T3处理得分最高的生物标记物分别为f_Rhodobacteraceae、o_Thermomicrobiales、p_Chloroflexi和s_Solirubrobacter_unclassified[图 5（a）].
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（a）细菌；（b）真菌 图 5 土壤细菌和真菌群落的LEfSe分析 Fig. 5 LEfSe analysis of soil bacterial and fungal communities |
在真菌群落中, LDA分析检测到14个（T0 = 2, T1 = 4, T2 = 6, T3 = 2）具有显著生物统计学意义的生物标志物[图 5（b）].在分类水平上, T0、T1、T2和T3处理得分最高的生物标记物分别为g_Tricharina、s_Knufia_unclassified、s_Arachnomyces_unclassified和g_Dendryphion[图 5（b）].
2.3 环境因子与微生物群落的相关性采用冗余分析对土壤理化因子和土壤细菌、真菌群落之间的相互关系做了进一步分析（图 6）.图 6（a）是细菌群落与土壤理化因子的RDA分析, 从中可以看出, 两个排序轴解释率分别为50.66%和23.68%, 共解释了细菌群落74.34%的变异.其中, 对土壤细菌群落具有显著影响的土壤理化因子有：SOC（r2=0.678 8, P < 0.01）和EC（r2=0.582 5, P < 0.05）.图 5（b）是土壤真菌群落与土壤理化因子之间的RDA分析, 从中可以看出, 两个排序轴解释率分别为49.71%和25.6%, 共解释了真菌群落75.31%的变异, 具有较强的统计学意义.从图 5（b）中还可以看出, 土壤pH是影响真菌群落分布的关键土壤理化因子.
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红色箭头表示环境因子, 蓝色箭头表示微生物丰度；A1~A10分别表示Actinobacteriota、Proteobacteria、Acidobacteriota、Gemmatimonadota、Chloroflexi、Planctomycetota、Firmicutes、Bacteroidota、Verrucomicrobiota和Myxococcota；B1~B7分别表示Ascomycota、Basidiomycota、Fungi_unclassified、Glomeromycota、Zygomycota、Chytridiomycota和Olpidiomycota 图 6 土壤细菌和真菌群落与土壤理化因子的RDA分析 Fig. 6 RDA analysis of soil bacterial and fungal communities with soil physical and chemical factors |
综合以往氮沉降研究发现, 氮输入可降低土壤pH, 导致土壤酸化, 但pH较高的土壤具有一定的酸缓冲能力, 因此, 对氮添加的响应较小, 这与本研究结果相吻合[24, 25].本研究中, 低氮和中氮水平并未对土壤pH造成显著影响, 而高氮水平显著降低了土壤pH.这是由于高氮添加显著提高了土壤NH4+-N和NO3--N含量. NH4+-N和NO3--N与土壤胶体表面的金属离子结合在一起, 导致大量的H+被释放到溶液中, 从而降低了土壤pH[26].本研究中不施氮处理下土壤pH值大于9, 说明研究区土壤盐碱化严重, 板结程度较高, 而高氮输入恰好改善了土壤盐碱化的趋势, 为植物营造了更加健康的土壤环境.本研究中, 随着施氮水平的提高, 土壤BD有降低趋势, SWC有升高趋势.这是因为氮添加直接提高了SOM含量, 增加了土壤孔隙度和保水能力, 这种效应在一定的氮阈值内是逐渐增大的. NH4+-N和NO3--N是植物可利用氮素的主要形式, 对植物生长具有重要的作用[27].随着施氮水平的提高, 土壤NH4+-N和NO3--N含量也呈增加趋势, 该结果与已有的研究结论相吻合, 土壤中NH4+-N和NO3--N含量与氮素水平有着直接关系, 氮添加量越高, 土壤中NH4+-N和NO3--N含量也越高[28], 提高氮水平导致土壤氨挥发能力和微生物硝化能力增强, 使土壤中的NH4+-N和NO3--N含量增加[29].外源氮添加导致土壤氮素的转化过程发生改变, 从而改变了SOC含量[30].本研究中, 氮添加提高了SOC含量, 这可能是因为氮添加通过促进枯枝落叶的分解和降低微生物生物量碳含量, 从而提高了SOC含量[2, 31].此外, 氮添加显著提高了土壤速效养分和全量养分的含量, 这与曹文侠等[32]研究结果一致.一方面氮肥添加刺激了土壤微生物活性, 加速了土壤有机氮的分解[33]；另一方面, 氮添加通过提高SOC含量使其内部发生矿化作用的有机磷被释放到土壤中, 导致AP含量提高[34].当然, 也有研究表明, 氮添加并未显著提高土壤TN含量和TP含量, 这可能与植物的吸收能力和取样时间等因素相关[35].综合而言, 本研究中高氮水平显著改善了土壤理化性质, 为植物的生长创造了良好的生存环境.
当然, 氮添加对高寒人工草地土壤理化性质的影响涉及到多种因素, 在后续的研究中, 应逐步控制种植模式、温度和降水等变量, 以确保试验结果的可靠性.
3.2 不同施氮水平对土壤微生物群落的影响土壤微生物对环境变化比较敏感, 适宜的环境条件有利于土壤微生物的生长.高寒地区气候寒冷, 氮矿化速率较低, 因此氮限制比较严重, 外源添加氮素必然影响土壤微生物群落结构.本研究中, 氮添加未显著改变土壤细菌和真菌群落的多样性, 这与以往大多研究的结果一致[15, 22], 这可能是因为高寒地区气温低, 氮矿化速率较慢, 外源氮添加不足以影响微生物的多样性.当然, 也有研究表明, 氮添加降低了微生物的多样性[36], 原因可能是高寒草地氮素匮乏, 氮添加促进了地表植被生长, 大部分土壤养分被植物所吸收, 细菌用于自身生长繁殖的养分受到限制, 从而抑制了细菌多样性[2].通过对微生物OTU数量的比较发现, 低氮添加下真菌和细菌的OTU数量有所增加, 但高氮添加降低了真菌和细菌的OTU数量, 说明适宜的氮添加才有利于真菌和细菌的生长.PCoA分析发现, 不同水平氮添加后, 土壤细菌群落发生明显分离, 而真菌群落重合度较高.这一现象说明, 相比真菌群落而言, 高寒地区土壤细菌群落对氮添加的响应更为敏感, 这与前人研究的结果相似[10, 16], 真菌对养分贫瘠的土壤表现出更强的适应性[37], 这可能与菌群自身的繁殖条件和不同菌群对氮素的需求差异有关.
本研究中, 不同水平氮添加引起了微生物结构的改变, 具体表现为优势真菌和细菌门相对丰度的变化.放线菌门、变形杆菌门和酸杆菌门是研究区主要的三大优势细菌菌群, 子囊菌门、担子菌门和球囊菌门是主要的优势真菌菌群.放线菌具有降解纤维素, 产生多种有益胞外酶的作用, 氮添加提高了放线菌门的相对丰度, 这可能与氮添加后土壤铵态氮和硝态氮有效性提高有关[38].酸杆菌门属于寡营养型菌群, 本研究中氮添加提高了酸杆菌门的相对丰度, 可能是因为氮添加提高了土壤全氮含量[39].氮添加降低了变形杆菌门的相对丰度, 这与刘桂要等[12]研究结果相似, 可能与环境因素和植物根系分泌物等因素有关.此外, 氮添加提高了接合菌门的相对丰度, 低氮和中氮处理提高了子囊菌门和担子菌门的相对丰度, 高氮处理下其相对丰度与不施氮处理无显著差异, 这与以往研究相似[15].土壤中的大多数接合菌门、子囊菌门和担子菌门充当着有机质分解者的角色[40], 在土壤养分充沛的条件下, 它们会迅速生长, 但是也存在一定的氮素阈值.
3.3 氮添加条件下土壤微生物与土壤理化因子之间的关系关于土壤微生物和土壤理化因子之间的关系, 以往研究有两种结论.首先, 土壤微生物促进土壤形成优良的团聚体结构, 可以分解动植物残体和枯枝落叶, 进一步调节土壤理化性质[41].其次, 外因诱导的土壤理化性质变化使土壤微生境发生改变, 从而影响了微生物群落结构和多样性[42].之所以出现这种情况, 是因为土壤微生物和土壤理化性质存在相互作用关系, 二者共同塑造健康的土壤环境.本研究通过冗余分析发现, SOC和EC是影响土壤细菌群落变化的关键土壤理化因子, 这与以往研究结果相似[43].这是因为碳元素是微生物繁殖的必要条件, 土壤有机碳被视为是土壤细菌分布的决定因素, 与细菌存在显著相关性.另外, 有研究已证实, 土壤pH是影响土壤真菌群落分布的主要因素[44], 本研究也证实了该观点.本研究中, 土壤pH与担子菌门呈负相关, 与其他优势菌门呈正相关.土壤pH的变化会影响土壤酶活性和碳氮元素的利用率, 氮添加引起的土壤pH降低会抑制土壤微生物的活性, 进而影响喜酸或喜碱的微生物菌群丰度[45].值得注意的是, 担子菌门与土壤物理性质（SWC、pH、EC）呈负相关, 与土壤化学性质呈正相关, 这可能与担子菌门的生长习性有关, 具体原因有待进一步揭示.子囊菌门以腐生菌居多, 凭借强大的菌丝来吸收营养底物, 可分解多种难降解物质, 在土壤中广泛分布[46].杨虎等[44]研究发现, 子囊菌门在pH较高的土壤中相对丰度更高, 本研究进一步证实了该结论.本研究中, 子囊菌门主要受土壤含水量和pH的影响.
本研究重点探讨了氮添加对高寒人工草地土壤理化性质和微生物学特性的影响, 可为多年生高寒人工草地的生产和生态功能维持提供理论指导.此外, 土壤微生物群落不仅受土壤理化性质的影响, 还与根系分泌物和植物的化感作用相关.因此, 今后的研究应重点关注不同草地类型植物、土壤和微生物之间的耦合关系研究, 以便更加准确地明晰氮添加对土壤微生物群落的影响机制.
4 结论（1）随着施氮水平的提高, SWC、SOC、NH4+-N、NO3--N、AN、AP、TP、TN和TC含量有增加趋势, T3水平显著降低了土壤pH.
（2）T3水平降低了土壤微生物数量, T1和T2水平增加了土壤微生物数量.氮添加未改变土壤微生物的Alpha多样性, 但显著改变了土壤微生物的Beta多样性.
（3）不同氮素水平对土壤微生物群落结构的影响存在差异, 细菌群落对氮添加的敏感程度大于真菌群落.
（4）土壤细菌群落分布主要受SOC和EC的影响, 土壤真菌群落分布主要受土壤pH的影响.
（5）T3水平（67.5 kg·hm-2·a-1）有利于改善多年生高寒栽培草地的土壤环境.
致谢: 本试验在青海大学高原特色农牧业综合试验示范基地开展, 在青海省高寒草地适应性管理团队的指导下完成, 在此表示感谢.
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