2024, Vol. 45
2. 贵州喀斯特环境生态系统教育部野外科学观测研究站, 贵阳 550025
2. Guizhou Karst Environmental Ecosystem Observation and Research Station, Ministry of Education, Guiyang 550025, China
氮循环是湖泊生态系统的物质循环和能量流动的重要过程, 是微生物和化学过程介导的生物地球化学循环[1], 湖泊沉积物中的大量微生物是其主要驱动力[2].对于自然环境中的氮循环, 国内外学者开展了大量研究, 包括森林土壤、海洋和湖泊等自然环境.如徐婷婷等[3]研究了长白山阔叶红松林土壤的硝化、反硝化过程及其功能微生物, 证明了降雨减少在一定程度上抑制了长白山阔叶红松林土壤净硝化作用, 氮的交互作用促进了土壤净硝化作用.Yu等[4]研究了南海浅湾和深海沉积物的氮循环微生物群落, 发现存在固氮、硝化、反硝化和异化硝酸盐还原为铵和厌氧氨氧化5个过程, 在浅湾和深海测得的丰度较高的功能微生物种类存在较大差异.Li等[5]探究了苏必利尔湖不同深度沉积物的氮循环, 估算了沉积物-水界面的硝酸盐和氨氮通量, 计算了沉积物的硝化和反硝化速率, 并发现大型淡水湖沉积物氮的循环与海洋系统相似.此外, 盐碱湖泊的氮循环也是研究热点, 如Feng等[6]通过探究温暖季节滨海富营养化湖泊沉积物中微生物群落的动态变化及其多种环境因子对氮循环的影响, 证实了海水入侵引起盐度升高, 进而增加了反硝化、异化硝酸盐还原和氨氧化作用相关基因的丰度, 降低了固氮和同化硝酸盐还原相关基因的表达.孙小溪[7]从反硝化、厌氧氨氧化和硝化这3条氮代谢途径定量研究青藏高原不同盐度湖泊沉积物氮素转化、相关功能微生物群落结构及环境因子的影响规律, 证明盐度是氮移除和氮荷载的决定性因素.
活性氮作为农业肥料被过度施用, 会对下游生态环境产生不利影响[8, 9], 淡水湖是活性氮的有效汇, 可将高达90%的活性氮转化为氮气[10].在湖泊生态系统中, 不同形态的氮素营养物质通过各种途径进入水体和沉积物并参与湖泊氮素生物地球化学循环, 使湖泊生态系统中富含氮物质[11].但是, 过量的营养物质（如氮、磷和有机物等）输入也会导致湖泊富营养化、水华和赤潮等问题, 进而影响沉积物中微生物群落特征和功能[12].因此, 研究湖泊沉积物中的氮代谢微生物、功能基因和代谢途径, 对了解湖泊的生物地球化学功能至关重要.
本研究选择贵州省喀斯特地区的典型湖泊（红枫湖）作为研究对象, 采集湖泊沉积物进行理化性质分析, 然后利用宏基因组学技术分析沉积物中的氮代谢微生物、功能基因和代谢途径, 识别主要的氮代谢功能微生物和功能基因, 进一步分析氮代谢功能基因与环境因子和微生物之间的关系, 以期进一步阐释贵州喀斯特地区典型湖泊的氮循环过程, 并为贵州省贵阳市的饮用水源地保护提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 样品采集贵州省贵阳市红枫湖位于106°20′19″~106°27'53″E, 26°24′39″~26°34'24″N之间.红枫湖的控制集流水域面积为1 551 km2, 正常库容为6.01亿m3, 相应水面面积为57.2 km2, 设计正常水位高程为1 240 m, 死水位高程为1 227.5 m, 现为贵阳市的重要集中式饮用水源地.根据红枫湖的水域分区特点, 于2023年2月, 在红枫湖选取5个典型干流水域, 3个典型支流水域进行样品采集, 共设置8个采样点, 如图 1所示.每个样点选取3.0 m×3.0 m作为1个样方, 利用沉积物采样器抓取湖底0~10 cm的表层沉积物, 每个样方内随机采集3次样品, 并进行混合, 然后分为2份, 一份装入50 mL灭菌离心管后立即放入干冰桶（-80℃）中保存, 用于宏基因组学分析, 另一份装入无菌采样袋中, 冷藏带回实验室, 用于常规理化指标分析.
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图 1 红枫湖采样点分布示意 Fig. 1 Distribution of sampling sites in Hongfeng Lake |
取过筛后的沉积物进行理化指标的测定.沉积物pH使用pH计（Pocket Pro+ Multi2）测定, 电导率（EC）采用电极法（HJ 802-2016）测定, 硫酸根（SO42-）采用硫酸钡沉淀法测定, 有机质（SOM）和有机碳（TOC）采用重铬酸钾容量法-外加热法测定, 全氮（TN）采用半微量凯氏定氮法测定, 全磷（TP）采用碱熔-钼锑抗分光光度法测定, 氨氮（NH4+-N）采用KCl浸提-靛酚蓝比色法测定[13], 硝酸盐氮（NO3--N）采用紫外分光光度法（GB/T 32737-2016）测定, 亚硝酸盐氮（NO2--N）采用氯化钾溶液提取-分光光度法（HJ 634-2012）测定[14].
1.3 宏基因组学分析将采集的沉积物样品在低温条件下送至上海某生物医药科技有限公司进行宏基因组学分析.主要的测试步骤包括：采用Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒（MP bio, CA, USA）进行样品DNA抽提；完成DNA抽提后, 检测DNA浓度和纯度, 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性；使用Covaris M220将检测合格的DNA剪切为约400 bp的片段, 用于构建PE文库；文库构建完成后进行桥式PCR, 最后利用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行高通量测序.
宏基因测序数据分析参照曲疆奇等的方法[15], 高通量测序后, 首先使用fastp进行质量剪切, 保留高质量的pair-end reads和single-end reads；然后使用MEGAHIT对优化序列进行拼接组装；使用MetaGene对拼接结果中的contigs进行ORFs预测；使用CD-HIT软件将所有样品中预测出来的基因序列进行聚类（默认参数为：90%一致性, 90%覆盖度）, 构建非冗余基因集；使用SOAPaligner软件分别将每个样品的高质量reads与非冗余基因集进行比对（95%一致性）, 统计基因在对应样品中的丰度信息；使用Diamond将氮代谢基因集的氨基酸序列与KEGG数据库进行比对（BLASTP比对参数设置期望值e-value为1e-5）, 获得氮代谢物种和功能注释, 然后基于物种对应的基因丰度总和计算该物种的相对丰度.
1.4 数据处理本文基于代谢途径建立了氮代谢基因集, 该基因集包含所有氮代谢微生物.利用Excel 2019软件进行数据处理, 使用Origin 2021软件绘制功能基因丰度图, 通过美吉生物云平台（https://cloud.majorbio.com）计算氮代谢功能基因与环境因子间的Pearson相关关系并进行可视化分析, 采用Tbtools软件绘制门水平和属水平氮代谢微生物群落丰度图, 采用R语言psych包生成微生物与氮代谢功能基因相关性矩阵, 再利用Gephi软件绘制二者网络图, 进行可视化分析.
2 结果与讨论 2.1 沉积物理化指标分析红枫湖沉积物的理化性质如表 1所示, 沉积物的pH在8.08~8.36之间, 平均值为8.24, 总体上呈弱碱性.EC为454.0~1 324.0 μS·cm-1, ω（TP）为457.96~1 186.09 mg·kg-1, ω（TN）为1 742.83~4 134.17 mg·kg-1, ω（SOM）为44.35~153.37 g·kg-1.与贵阳市的另外一座典型湖泊阿哈水库[16]相比, 红枫湖沉积物有机质和总氮均偏低, 总磷略高.采样点H1的有机质含量最高, 湖泊沉积物有机质来源分为内源和外源, 此处人为活动少, 因此可能主要是内源输入, 如水生植物腐烂和鱼类、底栖动物、浮游动物的代谢产物长期积累[17].除采样点H5以外, 各点亚硝酸盐氮明显高于氨氮和硝酸盐氮, 表明亚硝酸盐氮是红枫湖沉积物中主要的无机氮存在形式.且pH值越高的位置亚硝酸盐浓度普遍更高, 如采样点H3和H6, 这一规律也与徐亚同[18]的研究结果相似, 即当pH偏离最适反硝化的值时, 反硝化速率降低, 亚硝酸盐逐渐积累.采样点H5附近有大量农田、种植园、农场和一家农业科技企业, 人类的大量活动使得此处沉积物TN、TP和氨氮含量相对较高.
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表 1 沉积物基本理化性质 Table 1 Basic physical and chemical properties of sediments |
2.2 沉积物氮代谢功能基因
在红枫湖沉积物中共检测出6条氮代谢途径, 分别为固氮、硝化、反硝化、同化硝酸盐还原、异化硝酸盐还原和完全硝化, 如图 2所示.氮代谢功能基因的丰度大小表现为：反硝化 > 异化硝酸盐还原 > 完全硝化 > 硝化 > 同化硝酸盐还原 > 固氮, 且反硝化基因丰度远高于固氮基因丰度, 可能是由于硝酸盐氮的去除主要依赖于反硝化和异化硝酸盐还原过程, 且以反硝化过程为主.丰度前3的氮代谢功能基因分别是narG、nrfA和napA, 相关研究表明较高丰度的narG和napA可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐, 且这两种基因广泛存在于反硝化菌中, 在反硝化过程中占主导地位[19].当河流和湖泊等汇入海洋系统之前, 接近一半的活性氮在反硝化的作用下, 以N2的形式释放到大气中[20].反硝化过程作为去除水体中硝态氮的主要途径之一, 能够将硝酸盐氮永久地转化为氮气[21], 这一作用对于饮用水源地来说是非常有益的, 有利于湖泊水体中氮素指标维持在良好的水平.
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图 2 红枫湖沉积物中氮代谢功能基因丰度 Fig. 2 Abundance of functional genes of nitrogen metabolism in sediments of Hongfeng Lake |
此外, 在红枫湖沉积物中未检测到厌氧氨氧化途径的功能基因, 韩雪恪等[22]总结了厌氧氨氧化过程的影响因素主要有底物浓度、有机物、溶解氧、温度和pH值等.结合当时的季节和红枫湖的实际情况, 表明这可能与高浓度亚硝酸盐和高浓度TOC的作用有关.红枫湖沉积物ω（NO2--N）平均值为235.88 mg·kg-1, Strous等[23]的研究表明在亚硝酸盐浓度高于100 mg·L-1时, 就会完全抑制厌氧氨氧化过程.红枫湖沉积物ω（TOC）平均值为48.14 g·kg-1, 与其他淡水湖泊相比, 如平寨水库[24]、太湖[25]和鄱阳湖[26, 27]等, 沉积物有机质的TOC含量较高.根据高美云等[28]研究的结果可知, 随着有机碳的含量增高, 对厌氧氨氧化过程具有抑制作用, 同时减少了厌氧氨氧化菌的活性.由于多个因素的综合作用, 使得厌氧氨氧化过程受到抑制, 因而检测不出相关的功能基因.
2.3 氮代谢微生物群落结构红枫湖沉积物中细菌、古菌和真核生物的群落结构组成如图 3所示.细菌共获得41门、90纲、158目、245科和413属, 细菌是介导红枫湖沉积物氮代谢的主要微生物类群.相对丰度前3的优势菌门分别是变形菌门（Proteobacteria, 72.77%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae, 5.73%）和未分类的细菌（unclassified_d__Bacteria, 4.16%）.相对丰度前3的优势菌属分别是硫杆菌属（Thiobacillus, 16.64%）、红长命菌属（Rubrivivax, 9.43%）和硝化螺旋菌属（Nitrospira, 7.09%）.而岱海沉积物中的优势菌属为硫杆菌属（Thiobacillus）、丙酸杆菌属（Gammaproteobacteria）和暖绳菌属（Caldilinea）[29], 二者的优势菌属具有一定差异. 岱海属于咸水湖, 且位于中高纬度地区, 而红枫湖属于淡水湖泊, 且位于喀斯特低纬度地区, 因此湖泊的生境会使沉积物中的微生物存在差异.
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（a）门水平细菌丰度, （b）门水平古菌和真核生物丰度, （c）属水平细菌丰度, （d）属水平古菌和真核生物丰度；仅展示细菌、古菌和真核生物在各氮代谢途径丰度前5的门和丰度前10的属, 其余归为others；门属水平物种丰度进行lg（X+1）转化；A.完全硝化路径, B.硝化路径, C.反硝化路径, D.异化硝酸盐还原路径, E.固氮, F.同化硝酸盐还原路径；1、2、3、4、5、6、7和8对应采样点H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7和H8 图 3 氮代谢微生物群落丰度 Fig. 3 Abundance of nitrogen-metabolizing microbial community |
固氮路径的细菌群落多样性最低, 其中, 甲基杆菌属（Methylobacter）为固氮途径优势菌属, 在H5样点占比最高, 达到45.7%, 该菌属是湖泊中通常存在的好氧甲烷氧化菌, 可以在水生系统的食物网中发挥关键作用, 促进甲烷衍生碳向更高营养水平的转移[30].该结果与草海沉积物的优势甲烷氧化菌菌属[31]和三峡库区夏季万州段底泥中优势甲烷氧化菌菌属[32]一致.
反硝化和异化硝酸盐还原路径具有丰富的细菌群落组成, 且两个路径的细菌群落组成相似, 主要优势菌属均为硫杆菌属（Thiobacillus）、红长命菌属（Rubrivivax）和硝化螺旋菌属（Nitrospira）.Thiobacillus中的细菌具有自养反硝化功能, 在厌氧或缺氧的条件下能以硫元素或硫化物为电子供体, 以NO3-为电子受体, 通过自养反硝化作用, 可以起到良好的硫、氮脱除效果[33]. Rubrivivax在氮代谢路径中作为优势菌属的研究报道较少, 能在光照条件下具有脱氮的功能[34], 可能对红枫湖水体的脱氮起到了至关重要的作用. Nitrospira具有硝化作用, 可将亚硝酸盐氧化成硝酸盐.以上结果表明氮、硫代谢在红枫湖沉积物生态系统中联系紧密, 并为氮硫的去除做出了较大贡献.此外, 嗜氢菌属（Hydrogenophilus）和硫单胞菌属（Thiomonas）分别是反硝化和异化硝酸盐还原路径的特有菌属, 且以上菌属只存在于部分采样点.Hydrogenophilus多在石油、煤矿区等有机物丰富的环境以优势菌属形式存在, 属于有机污染物降解菌[35].同化硝酸盐还原路径优势菌属主要是Parasulfuritortus和硫杆菌属（Thiobacillus）, 且在湖区分布均匀.
古菌共获得7门、10纲、12目、14科和18属, 其中, 异化硝酸盐还原路径相比其他5条路径拥有更丰富的古菌群落, Candidatus_Thermoplasmatota是该途径主要的优势古菌门.Candidatus_Prometheoarchaeum是异化硝酸盐还原路径的特有古菌属.
除了细菌和古菌外, 真核生物也参与了红枫湖沉积物的氮循环, 分别是异化硝酸盐还原路径、反硝化路径和完全硝化路径. 根霉菌属（Rhizopus）是完全硝化路径的优势真核生物属, 在此路径中占比为28.6%, 属于毛霉菌门（Mucoromycota）.蜉蝣属（Ephemera）是异化硝酸盐还原路径和反硝化路径共同的的优势真核生物属, 在以上路径中占比分别为4.7%和58.1%, 属于节肢动物门（Arthropoda）.根据已有的证据, 真核生物可能有助于氮循环中的还原部分, 以上证据来自原生动物属（Loxodes）的纤毛虫, 它们生活在淡水湖中缺氧的深度以下[36, 37].Kamp等[38]认为在反硝化和异化硝酸盐还原途径中, 真核生物的作用很大, 在某些特殊的环境中, 它们的贡献甚至超过了原核生物.
2.4 沉积物环境因子与氮代谢功能基因的关联分析为了解红枫湖沉积物样本中的氮代谢功能基因与主要环境因子（SOM、NO2--N、pH、TN、NH4+-N、TP、NO3--N和EC）的关系, 进行Pearson相关性分析, 结果如图 4所示.SOM、NO2--N、pH和TN与红枫湖沉积物中氮代谢功能基因之间相关性不显著.在氮代谢基因中, NO3-同化还原成NO2-过程中的narB基因仅与NO3--N呈正相关（P < 0.05）；NH4+氧化为NH2OH过程中的pmoA-amoA基因与NH4+-N和TP正相关（P < 0.05）, 与NO3--N负相关（P < 0.05）；NO2-同化还原成NH4+过程中的nirA基因仅与NH4+-N正相关（P < 0.05）；NH4+氧化为NH2OH过程中的pmoB-amoB基因与NH4+-N正相关（P < 0.05）；N2氧化为NH4+过程中的nifK基因仅与NH4+-N正相关（P < 0.05）, 与NO3--N负相关（P < 0.05）；N2氧化为NH4+过程中的nifD基因与NH4+-N显著正相关（P < 0.01）, 与NO3--N显著负相关（P < 0.01）, 与TP正相关（P < 0.05）；N2氧化为NH4+过程中的nifH基因仅与TP正相关（P < 0.05）；NO2-还原成NO过程中的nirS基因仅与NH4+-N正相关（P < 0.05）；NH2OH氧化为NO2-过程的hao基因仅与NO3--N正相关（P < 0.05）；NO2-异化还原成NH4+过程中的nrfA基因仅与EC负相关（P < 0.05）.说明显著影响红枫湖沉积物中氮代谢功能基因分布的主要环境因子为NH4+-N、NO3--N和TP, 这与谭秋阳等[39]的研究结果相似.
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∗表示P＜0.05, ∗∗表示P＜0.01 图 4 红枫湖沉积物中氮代谢功能基因与环境因子的关联分析 Fig. 4 Relationships between functional genes and factors of nitrogen metabolism in sediments of Hongfeng Lake |
nirS和nirK是反硝化路径中编码亚硝酸盐还原酶（Nir）的功能基因, Nir能将亚硝酸盐还原为一氧化氮, 是反硝化过程的标志性反应[40].本研究中, 仅nirS与NH4+-N呈正相关, NO3--N和TN与nirS和nirK基因并无显著相关性, 而在俞琳等[41]的研究中得出NO3--N含量是影响河流沉积物反硝化作用的重要因素, 反硝化速率与NO3--N含量呈显著正相关关系.在李佳霖等[42]的研究中得出弥河的反硝化作用与沉积物的TN呈正相关.以上差异说明NO3--N和TN对反硝化过程及其功能基因的影响在不同的环境条件下响应不同.NO3--N和NH4+-N对固氮路径功能基因（nifD、nifK和nifH）的影响表现出一致的相关性, 且影响最大.TP对固氮基因也表现出一致的相关性, 杨文焕等[43]研究发现, 较高的C/N和TP是固氮菌生存的必要营养条件, 可以促进固氮反应的顺利进行.NH4+-N的增加会抑制固氮微生物的生长, 因此NH4+-N和TP会显著影响固氮作用相关基因丰度.在生物脱氮过程中, 由氨单加氧酶将铵根（NH4+）氧化为羟胺（NH2OH）, 氨单加氧酶是由amoA、amoB和amoC这3个基因编码的α、β和γ这3个亚基组成[44], 且amoA基因被广泛用于生态系统中氨氧化菌AOA和AOB的研究[45].羟胺是完全硝化过程的中间产物, hao是编码羟胺氧化还原酶的基因, 可以将羟胺氧化为亚硝酸盐[46].相关研究表明, 沉积物NH4+-N和TP对硝化作用影响较大, 是硝化过程的关键影响因素[47].而磷是微生物生长所必须的营养元素, 沉积物中磷的存在有利于氨氧化细菌的生存, 并且磷酸盐的存在也能够形成磷酸盐缓冲体系, 可暂时性延缓因硝化作用造成的沉积物pH值下降, 有利于硝化作用的进行[48].
2.5 微生物与氮代谢功能基因共现性网络分析在属水平下, 基于Spearman相关性系数（P）计算, 选择0.8作为相关系数阈值, 构建总丰度前40的氮代谢微生物（不包括未分类的细菌）与氮代谢功能基因的共现网络, 分析氮代谢功能基因与微生物的共现性关系[49]（图 5）, 并绘制出红枫湖沉积物中氮循环过程示意图（图 6）.共现网络由60个节点和141条边组成, 平均加权度为11.267, 密度为0.08, 模块化指数为0.481（大于0.4）, 证明网络图具有较强的模块化结构, 对环境变化具有较高的抵抗力[50].模块性分析发现氮代谢微生物与功能基因共现性网络存在6个模块, 前3个模块占比高达75%, 主要归属于变形菌门, 变形菌门是水环境中主要的原核生物[51], 具有丰富的生态功能, 能够通过介导硫、甲烷氧化, 硫酸盐还原和反硝化等作用驱动碳、氢、硫、氮等物质循环[52].功能基因与微生物之间正相关性（95.04%）的占比远大于负相关性（4.96%）, 样本中丰度较高的功能基因如norB、norC、narI、narV、nasA和napA与Sulfurisoma呈显著正相关, nirS与Zoogloea和Lysobacter呈显著正相关, narG、narZ、nxrA与Pelomonas呈显著正相关, 以上结果意味着在该系统中氮代谢微生物的主要生存方式为互利共生.vnfK与厌氧粘菌属（Anaeromyxobacter）呈显著负相关, 虽然二者丰度不高, 但为网络中负相关最强的边.相关研究表明, 大多数不利连接被认为是由不相容的生态位或直接的食物竞争引起的[53]. narG、narZ、nxrA、narH、narY和nxrB与narI和narV连接程度较高, 为该网络的枢纽基因[54]. narG、narZ和nxrA这三者属于同源基因[1], 在该网络中宿主最多, 共有11个属.与narG相关性最强的前3种微生物分别是Pelomonas（0.95）、Sulfuritalea（0.90）和Sulfurisoma（0.88）, 其中嗜糖假单胞菌属（Pelomonas）参与了同化硝酸盐还原途径、反硝化途径和厌氧氨氧化途径, 在亚硝酸盐向一氧化氮的转化中发挥了重要作用.
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每个节点大小与连接数成正比, 红色连接表示正相关, 绿色连接表示负相关, 括号内的数值表示每个模块的占比 图 5 属水平上氮代谢功能基因与微生物群落关系的网络分析 Fig. 5 Network analysis of the relationship between nitrogen metabolism functional genes and microbial community at the genus level |
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图 6 红枫湖沉积物氮代谢过程示意 Fig. 6 Schematic of nitrogen metabolism in sediments of Hongfeng Lake |
（1）红枫湖沉积物中氮代谢微生物主要为细菌, 其中相对丰度前3的优势菌属分别为硫杆菌属（Thiobacillus, 16.64%）、红长命菌属（Rubrivivax, 9.43%）和硝化螺旋菌属（Nitrospira, 7.09%）.古菌在异化硝酸盐还原途径丰度最高, 真核生物参与了异化硝酸盐还原途径、反硝化途径和完全硝化途径.
（2）红枫湖沉积物中存在6条氮代谢途径, 分别为固氮、硝化、反硝化、同化硝酸盐还原、异化硝酸盐还原和完全硝化.丰度前3的氮代谢功能基因分别是narG、nrfA和napA.反硝化和异化硝酸盐还原是红枫湖沉积物中氮去除的主要途径.
（3）氮代谢功能基因主要的环境影响因子为NH4+-N、NO3--N和TP, 与其他环境的驱动因子存在差异.微生物与氮代谢功能基因之间主要呈正相关关系, 占比为95.04%.氮代谢枢纽基因分别为narG、narZ、nxrA、narH、narY、nxrB、narI和narV.
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