2024, Vol. 45
蔬菜种植土壤是我国农业土壤的主要类型之一[1], 因其化肥施用量大、灌水频繁及复种指数高等特点, 极易造成土壤酸化和土壤菌群失调[2, 3], 同时也是大气中氧化亚氮（N2O）的主要来源[4]. 有研究估计, 全球70%的N2O排放来自土壤[5]. N2O作为一种长效温室气体, 在百年尺度上其全球增温潜势是CO2 的265倍[6]. 此外, N2O还能对臭氧层造成破坏, 进一步增加人类的健康风险[7].
土壤微生物是农田生态系统的主要组成部分, 是土壤质量变化最敏感的指标, 在土壤元素循环中扮演着极其重要的角色[8]. 由土壤微生物驱动的硝化过程在土壤氮转化中发挥着关键作用, 是农田生态系统中N2O产生的重要路径[9]. 硝化过程是指在有氧条件下, 微生物将氨（NH3）氧化, 最终生成硝态氮（NO3--N）的过程. 有研究发现, 在高氮投入的碱性菜地土壤中, 硝化过程贡献了65%~86%的N2O排放量[10]. 其中, 含氨单加氧酶基因（amoA）的氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea, AOA）和氨氧化细菌（ammonia-oxidizing bacteria, AOB）驱动的氨氧化过程是硝化过程的第一步, 也是限速步骤. 该过程的中间产物NH2OH会发生化学分解而释放N2O, 同时最终生成的NO3- 可以作为反硝化微生物的反应底物间接影响N2O的释放[11, 12]. 虽然最近在陆地氮循环中发现了全程硝化菌, 但通常认为氨氧化过程主要由AOA和AOB控制[13]. 因此, AOA和AOB作为执行硝化过程的重要功能微生物, 在土壤氮循环中起着十分重要的作用. 如何通过AOA和AOB来调控N2O转化成为了许多学者关注的焦点.
AOA和AOB的丰度及群落结构在很大程度上受到作物种类、种植方式及氮素含量等多种因素的影响[14], 且随种植年限的增加, 土壤理化性质的年际差异也相应增大[15]. 设施菜地作为一种经济效益高、受季节变化影响小的种植模式, 近年来在我国发展迅速, 但其种植方式单一、农业生产资料投入量大和生产环境相对封闭, 使得土壤质量随种植年限的延长出现了不同程度的退化[3, 16], 并导致土壤氨氧化微生物群落结构变化[17]. 目前, 国内外学者更多关注设施菜地土壤微生物群落的整体变化或部分土传病害相关的微生物, 而针对设施蔬菜生产中, 土壤功能微生物群落结构对蔬菜长期种植的响应研究较少, 尤其是与氮循环相关的微生物. 高邑县是河北设施蔬菜产业发展早、规模较大的生产基地之一, 该地不同种植年限设施菜地为开展AOA和AOB与环境相互作用的研究提供了理想场所.
本文以河北省高邑县不同种植年限（1、5、10和20a）设施菜地土壤为研究对象, 运用化学方法和二代高通量测序技术对不同种植年限下AOA和AOB丰度、群落结构差异及其养分驱动因子进行分析, 揭示AOA和AOB对设施蔬菜长期种植过程的响应趋势, 以期为深入了解设施菜地土壤氮循环过程和实现蔬菜可持续生产提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况研究区位于河北省石家庄市高邑县（37°34′N, 114°35′E）, 是全国农村综合改革示范区之一. 该地区位于华北平原西部边缘, 为暖温带半湿润大陆性季风气候, 年均降水量513 mm, 设施菜地中夏季气温18~38 ℃, 冬季气温16~28 ℃. 土壤质地为黏土, 土壤类型为黄褐土. 设施菜地每年种植蔬菜类型一致, 主要作物为番茄, 基肥施用量分别为农家肥4.5 t·hm-2、有机肥1.8 t·hm-2 和复合肥8 t·hm-2.
1.2 土壤样品采集及处理供试土壤采自研究区不同种植年限的设施菜地. 各设施大棚长100~106 m、宽12~18 m, 至取样时, 种植年限分别为1、5、10和20 a, 每个种植年限选择3个大棚取样, 每个大棚均按照蛇形布点法在0~20 cm土层中采集5个点样品并将样品均匀混合. 不同种植年限设施菜地的施肥、灌溉等管理措施按当地农民习惯进行. 根据采样前调查结果, 采样时选择作物类型和品种、施肥及管理等相对一致的大棚.
于2023年3月在研究区采集土壤样品, 将采集的新鲜土壤低温保存并迅速带回实验室. 新鲜土样去除石块和植物根系后过2 mm筛, 一部分用于测定土壤硝态氮（NO3--N）和铵态氮（NH4+-N）；一部分置于-80 ℃超低温冰箱保存用于测定AOA和AOB基因群落结构和丰度；最后一部分土壤样品自然风干, 研磨后分别过1 mm和0.25 mm筛, 用于除土壤硝态氮和铵态氮之外的土壤其他理化性质测定.
1.3 土壤理化性质测定土壤pH值采用水土比为2.5∶1的电位法测定；电导率（EC）采用水土比为5∶1的电极法测定；速效磷（AP）采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定；速效钾（AK）采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定；NO3--N采用紫外分光光度法测定；NH4+-N采用靛酚蓝比色法测定；有机质（SOM）含量采用重铬酸钾容量法-外加热法测定；全氮（TN）采用凯氏定氮法测定. 碱解氮（AN）用碱解扩散法测定.
1.4 土壤DNA提取及高通量测序采用TGuide S96磁性土壤/粪便DNA试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取土壤DNA. 以提取的DNA片段为模板进行PCR扩增. AOA扩增引物为amoA-26F（5'-GACTACATMTTCTAYACWGAYTGG GC-3'）和amoA-417R（5'-GGKGTCATRTATGGWGGY AAYGTTGG-3'）. AOB扩增引物为AOB-F（5'-GGGGT TTCTACTGGTGGT-3'）和AOB-R（5'-CCCCTCKGSAA AGCCTTCTTC-3'）. 扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳检测. 将符合要求的PCR产物使用VAHTSTM DNA Clean Beads磁珠进行纯化, 采用TruSeq DNA Kit（Illumina公司）进行文库构建. 使用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测, 检测合格的文库送至北京百迈客生物科技有限公司, 利用Illumina NovaSeq 6000测序平台测序.
1.5 数据分析使用QIIME2 2020等软件, 对测序得到的原始数据进行过滤、拼接、去噪并去除嵌合体序列, 将相似度 > 97% 的序列聚类到同一操作分类单元（ASV）中, 结合R语言软件统计各个样品的α多样性指数并进行评估. 采用SPSS 27.0软件通过单因素ANOVA方差分析对不同年限土壤理化性质、土壤中AOA和AOB的多样性指数、相对丰度及群落组成进行差异显著性分析（α=0.05）和相关性分析. 采用R软件进行主成分分析（principal component analysis, PCA）和冗余分析（redumdancy analysis, RDA）.
2 结果与分析 2.1 不同种植年限土壤理化性质变化由表 1可知, 土壤中全氮、速效磷、速效钾、有机质和碱解氮含量都随着种植年限延长先增加后减小, 且都在10 a达到最高. 其中全氮、速效磷和速效钾含量在不同年限的土壤中差异显著（P < 0.05）. 与1 a相比, 10 a土壤中全氮、速效磷、速效钾、有机质和碱解氮含量分别升高了27.05%、185.98%、19.58%、37.78%和50.71%. 此外, 硝态氮、铵态氮含量和电导率都随着种植年限呈先减小后增加的趋势, 硝态氮含量和电导率在5 a达到最低, 铵态氮含量在10 a达到最低. 且硝态氮和铵态氮含量在不同种植年限间具有显著差异（P < 0.05）. 5 a的硝态氮含量和电导率比1 a分别降低了52.10%和43.74%；10 a铵态氮含量与1 a相比降低了14.77%. 土壤pH图值随着种植年限延长显著降低（P < 0.05）, 20 a土壤pH值较1 a相比下降了0.27个单位.
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表 1 不同种植年限的设施菜地土壤理化性质1） Table 1 Physical and chemical properties of soils with different planting ages |
2.2 不同种植年限下AOA和AOB群落的变化 2.2.1 不同种植年限下AOA和AOB群落丰度和α多样性的变化
由表 2可知, 随着种植年限的延长, AOA和AOB的群落丰度呈现先减少后增加的趋势. 5、10和20 a土壤中AOA群落的ASV数量与1 a呈现显著差异（P < 0.05）, 但3种年限土壤之间差异不显著. 5、10和20 a土壤中AOA群落的ASV数量相比于1 a分别减少了45.23%、34.02%和31.53%. 不同种植年限土壤中AOB群落的ASV数量具有显著差异（P < 0.05）. AOB群落的ASV数量在1 a土壤中达到最高, 在5 a土壤中达到最低, 5 a相比于1 a减少了62.66%.
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表 2 不同种植年限AOA和AOB丰度与多样性统计和影响方差分析1） Table 2 Statistics and variance analysis of AOA and AOB abundance and diversity in different planting ages |
种植年限对AOA群落和AOB群落的多样性指数有极显著影响（P < 0.01）, AOA和AOB群落的多样性指数都随种植年限的延长先减小后增加, 在5 a达到最低. 5 a土壤中AOA的Simpson指数和Shannon指数分别比1 a降低了8.42%和23.60%；AOB的Simpson指数和Shannon指数分别比1 a降低了43.75%和60.93%.
2.2.2 不同种植年限下AOA和AOB群落组成的变化设施菜地不同种植年限土壤中AOA群落纲、属水平的优势菌测序分析结果见图 1. 在纲水平[图 1（a）]上的优势纲主要是亚硝基菌纲（Nitrososphaeria, 10.5%~90.7%, 相对丰度, 下同）和未分类的奇古菌纲（unclassified Thaumarchaeota, 2.85%~37.96%）.Nitrososphaeria随着种植年限的延长先减少后增加. 在属水平上[图 1（b）], 优势属主要是亚硝酸念珠菌属（Candidatus Nitrosocaldus, 5.67%~61.76%）、亚硝基古菌属（Nitrosoarchaeum, 1.99%~42.37%）、未分类的奇古菌属（unclassified Thaumarchaeota, 2.85%~37.96%）、未分类的硝化菌属（unclassified Nitrososphaeria, 4.39%~23.45%）、氨氧化古菌属（Nitrosopumilus, 1.61%~27.98%）和亚硝化念珠菌属（Candidatus Nitrosotalea, 0~16.78%）. Candidatus Nitrosocaldus 相对丰度随着种植年限的延长呈先减少后增加的趋势, 在10 a土壤中相对丰度最低. Nitrosoarchaeum 的相对丰度在10 a土壤中达到最高. 除了Candidatus Nitrosocaldus、unclassified Thaumarchaeota和unclassified Nitrososphaeria外, 其余古菌相对丰度都在20 a土壤中达到最低.
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（a）纲水平；（b）属水平 图 1 不同种植年限土壤中AOA水平组成 Fig. 1 Level composition of AOA in soils of different planting ages |
在AOB群落分布中（图 2）, 在纲水平上[图 2（a）], 优势纲主要是变形菌纲（Betaproteobacteria, 29.8%~85.5%, 相对丰度, 下同）, 其相对丰度随着种植年限的延长呈现先减少后增加的趋势. 在属水平上[图 2（b）], 优势属主要是亚硝化螺菌属（Nitrosospira, 66.4%~18.2%）、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas, 4.05%~10.30%）、亚硝化弧菌属（Nitrosovibrio, 0.86%~9.83%）和未分类的变形杆菌属（unclassified Nitrosomonadaceae, 0.48%~3.47%）. 其中, Nitrosospira是最优势属, 其相对丰度随着种植年限的延长呈先减少后增加的趋势, 在5 a土壤中达到最低.
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（a）纲水平；（b）属水平 图 2 不同种植年限土壤中AOB水平组成 Fig. 2 Level composition of AOB in soils of different planting ages |
通过AOA群落中相对丰度前10属的聚类热图分析[图 3（a）], 将1、5、10和20 a的设施菜地土壤分别聚类. 1 a土壤中未分类的亚硝基蕨属（unclassified Nitrosopumilaceae）、嗜油念珠菌属（Candidatus Nitrosocosmicus）、Candidatus Nitrosocaldus和unclassified Nitrososphaeria 相对丰富. 5 a土壤中氨氧化奇古菌（Nitrosopumilus）和unclassified Thaumarchaeota 相对丰富. 10 a土壤中亚硝基念珠菌（Candidatus Nitrosotenuis）相对丰富. 20 a土壤中Candidatus Nitrosotalea 相对丰富.
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图 3 不同种植年限土壤氨氧化微生物群落物种丰度的聚类热图分析 Fig. 3 Clustering heat map analysis of species abundance of ammonia-oxidizing microbial communities in soil of different planting ages |
通过AOB群落中相对丰度前10属的聚类热图分析发现[图 3（b）], 除5 a土壤中的unclassified Betaproteobacteria、unclassified Thaumarchaeota、Nitrosomonas、未分类的泉古菌属（unclassified Crenarchaeota）和10 a土壤中的亚硝化球菌属（Nitrosococcus）相对丰富外, 其余不同年限间几乎没有丰富的细菌属.
2.2.4 不同种植年限下土壤AOA和AOB群落结构的变化AOA与AOB群落结构随种植年限的延长表现出不同的变化规律, AOA的群落结构较AOB分异明显. 在对不同年限土壤中AOA群落的PCA分析中[图 4（a）, R2 = 0.92, P = 0.001], 主成分1和主成分2共解释了82.81%的AOA群落变异. AOA群落在不同年限内聚集相对集中, 4个年限土壤中AOA群落结构相对独立, 表明1、5、10和20 a土壤中AOA群落结构具有明显差异.对不同年限土壤中AOB群落的PCA分析中[图 4（b）, R2 = 0.74, P = 0.001], 主成分1和主成分2共解释了91.14%的AOB群落变异. 结果表明, 1 a和20 a土壤中AOB群落集中且部分重叠, 5 a和10 a土壤中AOB群落有部分重叠. 这说明1 a和20 a土壤中AOB群落结构相似度较大, 5 a和10 a土壤中AOB群落结构相似度较大. 总体而言, 随着种植年限的延长AOA群落结构较AOB群落结构差异更明显.
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图 4 不同种植年限土壤氨氧化微生物群落主成分分析 Fig. 4 Principal component analysis of soil ammonia-oxidizing microbial communities for different planting ages |
将不同种植年限土壤AOA群落结构和土壤养分因子作为指标进行RDA分析获得二维排序图[图 5（a）].由结果可以看出, AOA的RDA1和RDA2轴分别为54.98%和25.51%, 养分因子可以解释80.49%的微生物群落结构变化.RDA分析结果表明, 土壤中电导率（P = 0.014）和速效磷（P = 0.018）对AOA群落结构有显著影响, 且都呈正相关关系. 铵态氮（P = 0.001）、碱解氮（P = 0.003）和硝态氮（P = 0.003）对AOA群落结构有极显著影响, 其中, 碱解氮和硝态氮与不同种植年限AOA群落结构呈正相关关系, 铵态氮与不同种植年限AOA群落结构呈负相关关系.
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带*的环境因子表示“envfit”函数检验P < 0.05, 带**的环境因子表示“envfit”函数检验P < 0.01 图 5 土壤环境因素与土壤氨氧化微生物群落结构相关性分析 Fig. 5 Correlation analysis between soil environmental factors and soil ammonia-oxidizing microbial community structure |
将不同种植年限土壤AOB群落结构和土壤养分因子作为指标进行RDA分析获得二维排序图[图 5（b）]. 由结果可以看出, AOB的RDA1和RDA2轴分别为35.95%和18.24%, 养分因子可以解释54.19%的微生物群落结构变化. RDA分析表明, 土壤中pH（P = 0.046）与不同种植年限AOB群落结构呈显著负相关关系；电导率（P = 0.008）和硝态氮（P = 0.001）与不同种植年限AOB群落结构呈极显著正相关关系, 速效钾（P = 0.004）与不同种植年限AOB群落结构呈极显著负相关关系.
3 讨论 3.1 设施菜地不同种植年限对土壤理化性质的影响长期种植设施蔬菜对土壤理化指标有显著影响. 此前已有研究发现设施蔬菜长期种植在显著增加速效磷和硝态氮含量的同时造成全氮、速效钾、铵态氮含量和pH的亏损[18]. 本试验条件下, 碱解氮、速效磷和速效钾含量都随着种植年限的延长呈现先增加后减少的趋势, 且在10 a达到最高. 可能由于设施栽培集约化种植, 化肥施用量过高, 且长期连作限制植物生长, 影响植物对养分的吸收, 使土壤中大部分养分在前10 a不断富集[19, 20]. 而造成其含量在10 a后降低的原因可能是种植过程中有机肥投入较少, 土壤速效养分没有得到有效补充. 祝海燕等[21]和张敬智等[22]研究发现, 设施菜地土壤养分随种植年限的增加不会持续累积, 而是先升高后降低, 这与本研究的结果一致. 另外设施菜地磷钾肥施用量相对较低, 作物在吸收氮素的同时大量吸收速效磷和速效钾, 以上都会导致10 a之后土壤中速效磷和速效钾含量降低[23]. 土壤有机质含量随种植年限延长先升高后降低, 与前人研究结果相反[24], 但与Yang等[25]的研究结果相似, 可能与该区域很少施用有机肥及植物残体归还较少等因素有关.
随着设施菜地种植年限延长, 土壤中铵态氮、硝态氮含量和电导率都先减少后增加. 硝态氮含量在5 a达到最低可能是由采集土壤前浇水所致. 受灌水影响, 土壤中硝态氮向深层土体运移[26], 导致表层土中的硝态氮含量降低. 同时表层盐分也随水进入到深层土壤中, 使表层土壤含盐量降低[27], 这可能是造成5 a土壤电导率过低的原因之一. 铵态氮在前10 a减少的原因可能是大棚内温度过高, 导致氨挥发速率增大[28], 造成铵态氮的损失. 随着种植年限延长, 土壤中微生物不断死亡, 其所固持的养分被再次释放出来转化成铵态氮和硝态氮, 这使得铵态氮和硝态氮含量逐渐增加.
本研究表明土壤pH值随种植年限延长逐渐降低, 与已有研究结果相同[29], 可能是由于长期过量施肥导致SO42-、NO3-和Cl-等不断积累, 最终引起土壤酸化加剧. 同时, pH的下降可能还与植物根系分泌及残体分解释放有机酸等因素有关[30]. 综上所述, 种植年限对土壤理化性质影响较大.
3.2 设施菜地不同种植年限对土壤中AOA和AOB群落结构及相对丰度的影响关于长期种植对土壤氨氧化微生物群落组成及相对丰度影响的报道较多, 土壤中AOA和AOB多样性伴随种植年限延长呈现相同的变化规律. 本研究表明, 随着种植年限的延长, AOA和AOB的丰度和多样性都先减少后增加, 且在种植10 a以后AOB的群落丰度高于AOA. 这与Leininger等[31]和贺纪正等[32]研究结果一致, 表明随着种植年限的延长, AOB对环境的适应性高于AOA, 在土壤环境中相对稳定.
在AOA群落的纲水平上, Thaumarchaeota和Nitrososphaeria为主要优势纲, 这与杜颖等[33]对AOA群落组成的研究结果一致. 俞姗姗等[34]在研究菜子湖湿地土壤古菌群落结构变化中发现, 与其他古菌相比, Thaumarchaeota更偏好养分较高的土壤环境. 这可能是造成5 a和10 a土壤中Thaumarchaeota的相对丰度比1 a显著增加的原因之一. 目前有研究发现Nitrososphaeria对pH降低有耐受性[35], 造成在10 a土壤中Nitrososphaeria的相对丰度高于Thaumarchaeota. AOA优势属为Candidatus Nitrosocaldus, 其随着种植年限的延长呈现先增加后减少的趋势, 这可能与土壤中电导率变化有关. 土壤中电导率的变化可以反映土壤中盐分含量的变化, 有研究表明一定盐度可促进氨氧化微生物的生长, 超出盐度范围会抑制氨氧化微生物的生长[36]. 通过PCA分析可知, AOA群落结构在各年限中相对独立, 具有明显差异.
AOB群落在纲水平上优势纲主要是Betaproteobacteria. 有研究发现Betaproteobacteria具有嗜营养的特点[37]. 随着设施菜地种植年限的不断延长, 土壤中养分不断富集, 可能是造成10 a和20 a土壤中Betaproteobacteria相对丰度高于5 a的原因之一. 在属水平上, Nitrosospira 相对丰度显著高于其他菌属. 随着种植年限不断增加, Nitrosospira 相对丰度变化趋势与铵态氮和硝态氮含量变化一致, 这与Yao等[38]发现氮的浓度是Nitrosospira 群落结构的主要影响因子的结果一致. 铵态氮和硝态氮含量变化可能是导致Nitrosospira 为AOB优势属的原因之一, 同时也是AOB群落结构在1 a和20 a集中且部分重叠的原因之一.
3.3 设施菜地土壤理化性质与AOA、AOB群落结构及相对丰度的关系土壤理化性质在一定程度上决定着土壤微生物结构. 有研究表明, 种植年限延长造成的土壤理化性质变化与AOA和AOB群落结构及相对丰度有一定的相关性[39]. AOA和AOB群落结构的改变受到土壤中氮有效性的驱动. 在Tang等[40]的研究中发现硝态氮显著影响了酸性水稻土中AOA和AOB的群落结构. 杨亚东等[41]在研究施氮肥对华北平原土壤AOA和AOB的影响时发现, 增施铵态氮显著改变了AOA和AOB的群落结构. 本文中通过RDA分析发现, 不论是AOA还是AOB, 其群落结构都与土壤中硝态氮含量显著正相关. 这与前人的研究结果一致[42]. 同时分析结果也表明, AOA群落结构与铵态氮呈显著负相关关系, 这可能是因为AOA的优势纲更适合在低水平铵态氮的环境中生长[43]. 同时, 这也导致了AOA群落结构在属水平上的变化. 电导率与不同种植年限AOB群落结构呈正相关关系, 速效钾与不同种植年限AOB群落结构呈负相关关系. 这与Di等[44]对AOB的研究结果一致. 罗培宇等[45]在研究长期施肥对棕壤AOB丰度的影响时发现, 速效钾对土壤中AOB群落相对丰度有显著影响, 这与本研究结果中速效钾含量对AOB群落的影响结果相似. 出现这一现象的原因可能是由于长期耕作和施肥等人类活动改变了土壤的理化性质[46], 从而影响了AOB的群落结构及相对丰度对环境的响应. 因此, 设施菜地长期种植土壤中氨氧化微生物群落结构的变化并非单一因子驱动, 受多种因子共同影响.
4 结论（1）土壤中pH随着种植年限延长不断降低；硝态氮、铵态氮含量和电导率随着种植年限延长先减少后增加；全氮、有机质、碱解氮、速效磷和速效钾含量都随着种植年限延长先增加后减少. 以上养分因子的变化引起土壤中AOA和AOB的群落丰度和结构的变化.
（2）不同种植年限的AOA群落结构较AOB群落结构差异更为显著. AOA和AOB群落丰度和多样性都随设施种植年限延长先减少后增加. AOA群落在纲水平上优势纲主要为Nitrososphaeria和Thaumarchaeota, 属水平上的最优势属主要是Candidatus Nitrosocaldus；AOB群落的优势纲和优势属分别为Betaproteobacteria和Nitrosospira.
（3）土壤铵态氮、碱解氮和硝态氮是影响设施菜地AOA群落结构变化的主要养分因子, 其中AOA与碱解氮和硝态氮含量变化正相关, 与铵态氮含量变化负相关；电导率、速效钾和硝态氮是影响设施菜地AOB群落结构变化的主要养分因子, 其中AOB与电导率和硝态氮含量变化正相关, 与速效钾量变化负相关.
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