2024, Vol. 45
2. 旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室, 西安 710054;
3. 水利部旱区生态水文与水安全重点实验室, 西安 710054
, YUE Xiao-qiong1,2 , AN Jing-yue1,2 , ZHANG Si-yi1,2 , SUN Jia-yuan1 , LI Zhao-he1 , CHAI Li-hong1,2,3
2. Key Laboratory of Subsurface Hydrology and Ecological Effect in Arid Region of the Ministry of Education, Chang'an University, Xi'an 710054, China;
3. Key Laboratory of Eco-hydrology and Water Security in Arid and Semi-arid Regions of Ministry of Water Resources, Chang'an University, Xi'an 710054, China
采矿、冶炼、工业、污水灌溉、城市化发展和化肥的大量施用造成农田土壤重金属污染日益严重. 中国环境保护部《全国土壤污染状况调查公报》显示, 全国土壤样品中Cd超标率高达7.0%, 远远高于其他重金属. 农田土壤中的Cd移动性强、毒性高, 易被农作物吸收, 通过食物链累积于人体中, 进而威胁人体健康[1, 2]. 因此, Cd污染农田土壤的修复对保证农产品安全生产和实现生态农业可持续发展具有重要意义.
原位钝化修复技术因具有原位性、经济性和操作便捷性等优点, 已成为修复重金属污染农田土壤的有效措施之一[3]. 近年来, 针对其钝化材料的研究备受关注[4]. 生物炭是在限氧条件下对生物质热解形成的一种富碳固体物质[5]. 它富含碳、氢、氧、氮和硫等多种元素, 具有独特结构特征(如大比表面积、高孔隙率和表面官能团丰富等), 在土壤改良[6]、温室气体减排[7]和污染控制[8]等领域具有巨大的应用潜力. 已有研究证明, 生物炭可以通过静电吸附、阳离子交换、络合和共沉淀等方式降低土壤中重金属的迁移率, 减轻其对植物的毒害[9 ~ 11]. 生物炭还可以通过影响土壤pH、有机质和营养元素含量等改善土壤肥力质量和功能, 提高作物产量和品质[12, 13]. 此外, 生物炭的多孔结构可为土壤微生物的定植提供适宜的栖息地[14], 其内部的活性有机碳和矿质养分可作为微生物的能量来源[15], 从而间接或直接影响微生物代谢活动, 改变土壤微生物群的丰度和多样性[16]. 由此可见, 生物炭正成为一种可行的土壤污染修复材料.
然而, 由于原始生物炭在土壤中的修复能力有限, 通过改性制备高效功能型生物炭受到越来越多的关注[17, 18]. 壳聚糖是自然界中最丰富的多糖, 具有良好的生物相容性、无毒无害和易化学修饰等特点, 其分子长链上的羟基、氨基和酰胺基, 可借助配位键、氢键和离子键与重金属形成稳定的配合物[19]. 已有研究证明, 将壳聚糖负载到生物炭表面, 可显著提升生物炭表面的官能团数量、吸附位点和稳定性等[20, 21]. 此外, 壳聚糖作为土壤调整剂, 能够激活根际细胞、增强抗氧化酶活性、促进养分溶解和吸收, 有利于种子发芽和幼苗生长, 提高植物对重金属胁迫的耐受性[22]. 因此, 将壳聚糖负载到生物炭表面应用于土壤修复是改善土壤理化条件和生物特性的可行方法. 然而, 壳聚糖改性生物炭对重金属的钝化机制及其在镉污染农田土壤修复中的应用仍未得到充分研究. 特别是相对于化学性质而言, 壳聚糖改性生物炭对土壤细菌群落结构及酶活性的综合影响及其相互作用仍有待进一步研究.
因此, 本文以陕西眉县实际Cd污染农田土为研究对象, 壳聚糖改性生物炭作为钝化剂, 黑麦草为供试作物, 通过盆栽试验, 研究了不同施用量下钝化剂对土壤有效态Cd含量、黑麦草生物量和Cd累积的影响, 确定钝化剂的最佳施用量；并从钝化剂本身结构特性、土壤理化性质、土壤细菌群落结构和酶活性变化等方面探讨了钝化剂对土壤Cd污染的修复作用机制, 以期为Cd污染农田土壤的高效修复提供科学的替代方案和理论依据.
1 材料与方法 1.1 供试土壤和钝化剂的制备供试土壤采自陕西省关中平原西部的眉县农田耕层土壤(0 ~ 20 cm). 风干, 拣去动植物残体, 用木棍研细, 过5 mm尼龙筛, 混合均匀用于盆栽试验, 取适量供试土壤, 研磨分别过2 mm和0.5 mm尼龙筛用于土壤理化性质分析. 土壤类型为褐土, 质地为粉(砂)壤土(其中含砂粒14.1%、粉粒64.3%和黏粒21.6%), 其他理化性质见表 1.
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表 1 供试土壤和钝化剂基本理化性质1) Table 1 Basic physical and chemical properties of the tested soil and passivator |
钝化剂为壳聚糖改性生物炭, 制备过程如下：玉米秸秆60 ℃干燥24 h, 粉碎后过40目筛. 置于管式炉中, 氮气气氛下, 以10 ℃·min-1升温至600 ℃保温2 h, 冷却至室温后研磨过100目筛, 用6 mol·L-1盐酸酸化后, 得到酸活化玉米秸秆生物炭. 称取一定质量的壳聚糖溶解2%乙酸溶液中, 超声均匀分散, 加入酸活化生物炭(壳聚糖∶生物炭=1∶5, 质量比), 在60 ℃下搅拌30 min, 加入2%的戊二醛溶液继续搅拌30 min, 用1 mol·L-1 NaOH调节pH至11后搅拌1 h, 抽滤、洗涤至中性, 烘干, 得到壳聚糖改性生物炭, 标记为钝化剂, 基本理化性质见表 1.
1.2 盆栽试验设计盆栽试验设置4个处理, 钝化剂施用量(质量分数)为：无添加(C0, 对照)、0.5%(C1)、1%(C2)和3%(C3), 每个处理重复3次, 共计12盆. 按确定的质量分数将钝化剂与土壤混合均匀, 称取2 kg样品装入塑料花盆中(底径12 cm, 顶径17 cm, 高14 cm), 一次性施入底肥(含150 mg·kg-1N、23 mg·kg-1 P2O5和58 mg·kg-1 K2O), 用去离子水饱和土壤, 计算田间持水量, 平衡10 d. 黑麦草(Lolium perenne.L.)种子用0.5% NaClO室温下消毒10 min, 用去离子水冲洗后, 点播于2~3 cm深度, 每盆30粒, 2周后定苗, 保留长势相近的15株幼苗. 将盆栽随机放置在日光温室, 温度控制在16 h/28℃和8 h/24℃, 隔天夜间浇水一次且变换位置, 使土壤含水量保持为田间持水量的60%左右, 观察记录生长情况, 50 d后采收.
1.3 植物样品采集与分析收集植物样品, 用自来水冲洗干净后, 再用去离子冲洗3次, 晾干后测量鲜重和株高. 分离根系和茎叶, 分别装入干燥纸袋, 在烘箱中105 ℃杀青30 min后, 65 ℃烘干至恒重, 自然冷却后测量干重. 根和茎叶分别粉碎过80目筛, 装入封口袋中, 备用. 称取植物样品0.500 0 g, 置于消解罐中, 采用HNO3-H2O2(5∶2, 体积比)微波消化(GB 5009.15-2014), 用原子吸收光谱仪(WFX-120, 北京瑞利分析仪器有限公司, 中国)测定Cd质量浓度.
采用富集系数(bioaccumulation factor, BCF)和转运系数(transport factor, TF)评价植物对重金属的累积和转移能力[20], 计算公式为：BCF = Croot/Csoil, TF = Cshoot/Croot, 其中, Cshoot、Croot和Csoil分别表示黑麦草茎叶、根系和土壤中的总Cd含量(mg·kg-1).
1.4 土壤样品采集与分析收集土壤样品分成两部分, 一部分被风干, 研磨, 过100目筛, 用于土壤基本理化性质和重金属含量测定；另一部分储存于-80 ℃用于土壤微生物量和酶活性测定.
参照《土壤农化分析》[23]的方法, 使用玻璃电极(PHS-3C, Leici, China)测量土壤pH值(土∶水= 1∶2.5), 采用重铬酸钾容量法测定土壤有机质(SOM), 采用乙酸铵交换法测定土壤阳离子交换量(CEC), 碱解扩散法测定碱解氮(AN), NH4F-HCl法测定速效磷(AP), NH4OAc浸提-火焰光度法测定速效钾(AK). 有效态Cd采用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)浸提(GB/T 23739-2009), 全Cd采用HNO3-HF-HClO4(5∶1∶1, 体积比)消化(GB/T 17141-1997), 利用原子吸收光谱仪(WFX-120, 北京瑞利分析仪器有限公司, 中国)测定Cd质量浓度. 以国家土壤成分分析标准物质(GBW07408)和土壤有效态标准物质(GBW07460：ASA-9)分别作为全Cd和有效态Cd内标控制样品, 回收率为96.74%~102.03%.
按试剂盒(索莱宝科技有限公司)说明书测定土壤酶活性：脲酶、纤维素酶和蔗糖酶均采用可见分光光度法测定, 过氧化氢酶采用紫外分光光度法测定.
参照E.Z.N.A.® Soil试剂盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)说明书提取根系土壤细菌的基因组DNA, 通过1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000分光光度计分别检测DNA的完整性及DNA的浓度与纯度, 每个处理组设置5个重复试验. 使用338F-806R引物对16S rRNA的V3-V4区进行扩增并构建文库, 引物序列为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′). 使用上海美吉生物有限公司Illumina MiSeq平台进行测序分析.
1.5 数据处理采用Origin 2021和Excel 2019进行试验数据分析和绘图, 采用SPSS 20进行数据显著性检验和相关性分析. 不同处理之间数据显著性分析采用方差分析法(ANOVA), 不同处理之间多重比较采用最小显著差异法(LSD法, p < 0.05). 采用Canoco5进行冗余分析(redundancy analysis, RDA).
2 结果与分析 2.1 钝化剂对土壤有效态Cd含量和基本理化性质的影响 2.1.1 土壤有效态Cd含量图 1反映了钝化剂施用量对土壤DTPA-Cd含量的影响. 从中可知, 在C1、C2和C3处理下, DTPA-Cd含量分别较对照(C0)降低了2.75%、9.12%和9.92%, 且在C2和C3处理时达到极显著性水平(p < 0.01). 说明钝化剂的施加能够降低土壤中有效态Cd的含量, 即对土壤中的Cd起到钝化作用, 并且随着施用量的增加, 钝化效果越发明显.
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*表示p < 0.05, **表示p < 0.01 图 1 钝化剂施用量对土壤DTPA-Cd含量的影响 Fig. 1 Effects of passivator addition on soil DTPA-Cd contents |
钝化剂施加量对pH值、CEC、SOM和速效养分(AN、AP和AK)的影响如图 2所示. 在C1、C2和C3处理下, 土壤pH值分别为4.62、4.79和5.26, 与对照相比, 分别增加了0.02、0.18和0.66个单位, C3处理时增加幅度最大, 达到极显著水平(p < 0.01). 土壤CEC和SOM随着施用量的增加而增大, 与对照相比, 在C2和C3处理时均达到极显著水平(p < 0.01). AN、AP和AK在C3处理时增幅最大, 与对照相比, 分别增加了6.12%、32.62%和9.25%.
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*表示P<0. 05，**表示P < 0. 01 图 2 钝化剂施用量对土壤理化性质的影响 Fig. 2 Effects of passivator addition on physical and chemical properties of soil |
对有效态Cd含量(DTPA-Cd)与土壤理化性质(pH、CEC、SOM、AN、AP和AK)之间进行皮尔逊相关性分析, 结果如图 3所示. 从中可知, DTPA-Cd含量与pH、CEC、SOM、AP和AK呈极显著的负相关性(p < 0.01), 与AN呈显著的负相关性(p < 0.05). 以上结果表明, 钝化剂的施用改变了土壤的基本理化性质, 进而影响了有效态Cd的含量, 且随着施用量的增加, 影响越发显著, 在C3处理时, 有效态Cd含量降低最多, 为9.92%.
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椭圆越窄说明两者之间的显著性越强, 椭圆越宽说明两者之间的显著性越弱；椭圆为蓝色说明两者之间呈负相关, 椭圆为红色说明两者之间呈正相关；*表示P < 0.05, **表示P < 0.01 图 3 土壤DTPA-Cd含量与理化性质的皮尔逊相关矩阵 Fig. 3 Pearson correlation matrix of DTPA-Cd content and physicochemical properties of soil |
表 2反映了钝化剂施用量对黑麦草地上部分(茎叶)和地下部分(根)Cd含量、生物量及富集系数和转运系数的影响. 由表可见, 在C1、C2和C3处理下, 地下和地上部分中Cd含量分别较对照降低了6.33%、16.46%、24.05%和15.79%、26.32%、47.37%, 在C3处理时, 达到显著水平(p < 0.05). 黑麦草地下和地上部分干重分别是对照的1.00~1.68倍和1.08~1.56倍, 且在C3处理下, 地上和地下部分均达到极显著性水平(p < 0.01). 黑麦草的富集系数较对照分别降低了6.15%、21.54%和30.00%, 运转系数降低了10.42%、12.50%和31.25%. 由此可见, 钝化剂的施加可以降低黑麦草地上和地下部分中Cd含量, 促进黑麦草的生长, C3处理时效果最佳.
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表 2 钝化剂施用量对黑麦草镉含量、生物量及富集系数和运转系数的影响1) Table 2 Effects of passivator dosage on cadmium content, biomass, enrichment coefficient, and operation coefficient of ryegrass |
2.3 钝化剂对土壤细菌群落结构的影响 2.3.1 土壤细菌群落的OTUs数目分析
对4个处理组20个样本的16S rRNA基因序列进行分析, 共得到594 692条高质量序列, 平均每个样本有效序列数目为17 617条, 序列平均长度为416 bp. 根据97%的相似性标准, 序列样本共检出36门、98纲、231目、373科、677属、1 364种和3 378个OTUs. 各样品的Shannon指数稀释曲线随着序列数量增多而趋向平坦(图 4), 说明测序数据量合理, 可以充分反映样品中绝大部分的细菌多样性信息. 对各组样品的独特和组间样品的重叠OTUs进行Venn图分析可见(图 5), C0、C1、C2和C3的OTUs总数分别为2 913、2 806、2 805和2 787个, 而不同处理下特有的OTUs的数目分别100、50、46和59, 分别占总OTUs数量的2.96%、1.48%、1.36%和1.75%. 各组样品中检测到共有的OTUs数量为2 128个, 占总OTUs数量的63.00%.
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图 4 不同钝化剂施加量处理下土壤细菌群落稀释曲线 Fig. 4 Rarefaction curves of bacterial community under the treatments with different passivator application amounts |
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图 5 不同钝化剂施加量处理下土壤细菌群落的OTUs数量 Fig. 5 OTUs numbers of bacterial communities in soil under the treatments with different passivator application amounts |
采用Alpha多样性中的Ace、Chao1、Shannon和Simpson指数对土壤细菌群落的丰富度和多样性进行表征, 结果如图 6所示. 在C1、C2和C3处理中, Ace指数显著低于对照组[p < 0.05, 图 6(a)], Chao1指数相较于对照组均有所降低, 且在C1处理时, Chao1指数显著低于对照组[p < 0.05, 图 6(b)]. 然而, Shannon指数和Simpson指数在处理组与对照组间均无显著差异[P0.05, 图6(c)和6(d)]. 说明钝化剂的添加降低了土壤细菌丰富度, 对多样性的影响不显著.
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*表示p < 0.05, **表示p < 0.01 图 6 不同钝化剂施加量处理下土壤细菌群落Alpha多样性指数 Fig. 6 Alpha-diversity of soil bacterial communities in soil under the treatments with different passivator application amounts |
采用层级聚类分析研究了不同样本群落结构的相似性或差异关系, 构建了样本层级聚类树[图 7(a)]. 所有样本分为两个大簇, 一簇为对照组(C0), 另一簇为添加钝化剂组(C1、C2和C3), 表明与对照相比, 钝化剂的添加改变了细菌群落结构. 此外, 添加了钝化剂的样本也分成了3个小簇, 且每个处理组内相似性较强. 表明土壤细菌群落结构(Beta多样性)以钝化剂施用量不同而分离.
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(a)层级聚类分析, (b)非度量多维尺度分析 of bacterial communities in soil under the treatments with different passivator application amounts 图 7 不同钝化剂施加量处理下土壤细菌群落层级聚类分析和非度量多维尺度分析 Fig. 7 Hierarchical cluster analysis(HCA)and non-metric multidimensional scaling analysis (NMDS) |
NMDS分析结果显示, 各处理组间在NMDS1水平上分离, 组间距离较远, 差异显著(R=0.890 3, P=0.001). 且添加钝化剂的3个处理组(C1、C2和C3)与C0组区别明显, 各处理组之间置信范围没有相交. 由此说明钝化剂的添加改变了土壤细菌群落结构.
2.3.3 土壤细菌群落结构特征分析各处理组土壤细菌中共鉴定出36个门、373个科和677个属(图 8). 各处理组的优势菌门均为放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteriota). 与C0相比, C1和C3处理组放线菌门的相对丰度分别提高了5.54%和3.59%, C2处理组相对丰度降低了4.19%；C1和C3处理组变形菌门的相对丰度分别降低了0.58%和15.71%, 而C2处理组相对丰度提高了4.77%；酸杆菌门的相对丰度(43.29%)在C3处理组中提高, 而在C1和C2处理组降低(3.17%和0.77%). C3处理组中拟杆菌门(Bacteroidota)、芽单胞菌门(Gemmatimonadota)和粘球菌门(Myxococcota)的相对丰度均显著降低[P < 0.05, 图 8(b)].
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(a)相对丰度, (b)组间差异；*表示p < 0.05, **表示p < 0.01 图 8 不同钝化剂施加量处理下土壤细菌门分类水平的相对丰度和组间差异 Fig. 8 Relative abundance of soil bacterial at the phylum level under the treatments with different passivator application amounts |
此外, 各处理的优势科为鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、微球菌科(Micrococcacea)和类诺卡氏菌科(Nocardioidacea)[图 9(a)]. 优势属为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomona)、节杆菌属(Arthrobacte)和芽球菌属(Blastococcu). 与C0相比, C1、C2和C3处理时鞘氨醇单胞菌属(Sphingomona.)和芽球菌属(Blastococcu)的相对丰度均有所提高, 节杆菌属(Arthrobacte)的相对丰度降低[图 9(b)].
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(a)科水平, (b)属水平 图 9 不同生钝化剂施加量处理下土壤细菌群落科和属水平的相对丰度 Fig. 9 Relative abundance of soil bacteria at the family and genus level under the treatments with different biochar application amounts |
在门水平上, 选择相对丰度前10的优势菌门与土壤理化性质(pH、CEC、SOM、AN、AP、AK和DTPA- Cd)进行冗余度分析. RDA1和RDA2分别能够解释土壤细菌群落结构的37.52%和5.8%. 在所有的理化性质中, SOM和DTPA-Cd与细菌群落结构显著相关(P < 0.05). 由图 10(a)可知, 放线菌门的相对丰度与pH、AP和AN正相关；变形菌门、芽单胞菌门和厚壁菌门与SOM呈负相关；酸杆菌门和绿弯菌门与DTPA-Cd呈负相关, 与pH、CEC、SOM、AN、AP和AK呈正相关.
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(a)土壤理化性质与细菌群落结构的RDA分析(红色箭头表示土壤理化性质, 蓝色箭头表示相对丰度前10的优势菌门) (b)土壤理化性质与α多样性的RDA分析(红色箭头表示土壤理化性质, 蓝色箭头表示α多样性指数) 图 10 土壤理化性质与细菌群落结构及α多样性的RDA Fig. 10 RDA of soil physicochemical properties, bacterial community structure, and α diversity |
细菌群落多样性与土壤理化性质的RDA结果见图 10(b), RDA1和RDA2解释了所有土壤理化性质的68.00%, 能较为完整地体现土壤理化性质的作用. 对α.多样性指数影响最大的是AP, 解释率为31.5%(P < 0.05), AP与Chao1指数和Ace指数呈强负相关, AN与Shannon指数呈正相关.
2.3.5 土壤细菌群落功能预测使用PICRUSt2对各处理组土壤细菌群落功能进行预测. 各处理组土壤细菌群落共富集到了6条KEGG一级通路, 富集程度最高的是新陈代谢(78.64%~79.08%, 占比, 下同), 其后依次是遗传信息处理(6.38%~6.51%)、环境信息处理(5.06%~5.28%)、细胞过程(4.15%~4.33%)、人类疾病(3.37%~3.59%)和有机系统(1.83%~1.86%). 由图 11(a)可知, C3相较于C2处理显著增加了新陈代谢的相对丰度, 显著降低了人类疾病的相对丰度, C3相较于C0、C1和C2处理显著增加了遗传信息处理的相对丰度, C3相较于C1、C2和C0处理显著降低了环境信息处理的相对丰度, C3相较于C1和C2处理显著降低了细胞过程, 随着钝化剂施加量的增加, 有机系统的相对丰度无显著性变化.
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红色表示通路相对丰度高, 蓝色表示通路相对丰度低, 不同小写字母表示处理间差异显著(p < 0.05)；正值表示通路的相对丰度高于平均水平, 负值表示通路的相对丰度低于平均水平 图 11 不同处理组土壤细菌群落一级代谢通路和二级代谢通路相对丰度热图 Fig. 11 Heatmap of metabolism pathways at level 1 and level 2 of bacterial community in different treatments |
各处理组土壤细菌群落功能共有46条二级通路, 相对丰度前10的功能包括6类新陈代谢、2类遗传信息处理和2类环境信息处理, 分别为碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅因子和维生素代谢、膜转运、翻译、脂质代谢、信号转导、复制与修复和核苷酸代谢. 由图 11(b)可知, C3处理相较于C0、C1和C2处理, 显著增加了能量代谢、翻译、复制与修复和核苷酸代谢的相对丰度, 同时显著降低了膜转运和信号转导的相对丰度.
2.4 钝化剂对土壤酶活性的影响本研究分析了钝化剂施加对土壤脲酶、纤维素酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性的影响. 结果显示, 与对照组相比, 土壤脲酶的活性在各处理组中均显著增加[P < 0.05, 图 12(a)], 而纤维素酶的活性在C1和C2处理组中极显著增加[P < 0.01, 图 12(b)]. 此外, 所有添加钝化剂的处理组中蔗糖酶的活性均极显著降低[P < 0.01, 图 12(c)], 而过氧化氢酶的活性在C2和C3处理组中极显著降低[P < 0.01, 图 12(d)].
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*表示p < 0.05, **表示p < 0.01 图 12 钝化剂施加量对土壤酶活性的影响 Fig. 12 Effects of passivator application on soil enzyme activity |
钝化剂的添加显著改变了土壤理化性质. 随着钝化剂施用量的增加, 土壤pH值增加[图 2(a)], 有效态Cd含量降低(图 1). 这一方面是由于土壤pH值的升高影响土壤可变负电荷, CEC增大[图 2(b)], 离子交换作用增强, 导致有效态Cd含量降低. 另一方面, 土壤pH升高有利于CO32-、PO43-和OH-等碱性物质的溶解, 促进Cd3(PO4)2、CdCO3和Cd(OH2等沉淀的生成, 同时发生共沉淀作用, 形成的沉淀可以包覆游离的Cd2+, 并将其固定在沉淀内部, 从而降低其迁移性[7]. 此外, 生物炭作为富碳材料, 其本身所携带的有机物可以显著增加土壤有机质(SOM)含量[图 2(c)], 其特殊的表面结构, 有利于速效养分(AN、AP和AK)在土壤中的保留[图2(d)~2(f)]. 有机质和速效养分含量的增加, 有利于活性官能团与土壤中的Cd2+形成有机-金属配合物[11, 24]. 与此同时, 改性剂壳聚糖表面的官能团(氨基、羟基和N.-乙酰氨基等)可作为配体进一步增强对Cd2+的吸附容量和吸附稳定性. RDA分析结果表明, 土壤pH、CEC、SOM、AN、AP和AK与DTPA-Cd之间呈显著负相关关系(P. < 0.05, 图 3), 进一步说明钝化剂的施加通过改变土壤理化性质, 促进了对土壤中Cd的钝化.
土壤微生物是土壤理化性质变化的敏感指标. 土壤理化性质与细菌群落结构的冗余分析结果表明[图 10(a)], 放线菌门的相对丰度与pH、AP和AN呈正相关, 与DTPA-Cd呈负相关, 表明土壤pH是影响细菌群落结构的因素之一, 这与WU[25]等的研究结果一致. 土壤pH和速效养分的增加对于放线菌门的生长繁殖有促进作用；酸杆菌门和绿弯菌门与pH、CEC、SOM、AN、AP和AK呈正相关, 与DTPA-Cd呈负相关, 随着钝化剂施加量的增加, 提高了土壤pH以及CEC、SOM、AN、AP和AK含量, 降低了重金属的含量, 有利于酸杆菌门和绿弯菌门的生长繁殖, 进一步说明施加钝化剂改变了土壤理化性质进而影响细菌群落结构；变形菌门、芽单胞菌门和厚壁菌门与SOM呈负相关, 可能是因为变形菌门、芽单胞菌门和厚壁菌门都属于光合细菌[26], 以CO2为营养源进行光合生长, 因此在有机质含量较高的土壤中不利于这类细菌的生长繁殖, 这也说明除了土壤理化性质外, 光照等因素也会对土壤细菌群落造成影响. 土壤理化性质与α.多样性的冗余分析结果表明[图 10(b)], AP对α.多样性指数的影响远大于其他土壤理化性质, 土壤中AP含量增加使得土壤细菌群落结构的丰富度降低, 这说明随着钝化剂施加量的增加, 显著提高了土壤中速效磷的含量, 打破了土壤中原有的养分平衡, 只有利于特定细菌的生长繁殖, 使得土壤中细菌种类减少. AN含量增加使得细菌群落的多样性增加, 说明速效氮含量的增加有利于土壤中氮循环的进行, 使得土壤中细菌总数增加, 这与王硕等[27]的研究结果一致. 综上所述, 钝化剂通过影响土壤理化性质, 降低土壤DTPA-Cd含量, 从而改变了土壤细菌群落结构和多样性, 进而提高了土壤环境质量, 实现了对Cd污染土壤的修复作用.
3.2 钝化剂对黑麦草生物量和Cd含量的影响本研究结果表明, 随着钝化剂施用量的增加, 黑麦草地上和地下部分中Cd含量降低, BCF和TF因子降低, 生物量升高(表 2), 施用量为3%时, 差异均达到显著水平. 说明钝化剂能有效降低重金属对黑麦草的毒害作用, 促进植物生长, 且钝化剂的施用量直接影响植物的生物量. 这与Zhang等[16]的研究结果一致, 钝化剂的施加显著降低了土壤中Cd的生物有效性, 从而降低了Cd被植株吸收的风险, 缓解了Cd对植物的毒害作用. 尤其对地上部分降低效果显著, 可以预见, 如果种植小麦、玉米等食用籽粒的作物, 有望使作物可食用部分Cd含量显著降低. 此外, 离子交换作用释放出的阳离子(Mg2+、Ca2+、K+和Na+), 可作为营养物质对植物生长产生促进作用[28]. 综上, 本研究确定钝化剂的最佳施用量为3%, 这对碳基材料在农田Cd污染土壤修复中的应用具有一定指导意义.
3.3 钝化剂对细菌群落结构的影响微生物多样性和群落结构可作为评价重金属污染土壤修复效果的指标[10]. 高通量测序的结果显示(图 5), 与对照相比, 施加钝化剂的3个处理均导致细菌OTUs总数和特有OTUs数量下降, 说明土壤细菌群落间的特异性降低, 这可能是因为土壤微生物对土壤pH和有机碳等较为敏感, 为适应土壤环境的改变而调整自身的群落结构, 导致适应性较强或喜好这种环境的微生物得以保留[6]. 土壤细菌群落α.多样性分析结果显示(图 6), 钝化剂的施用降低了Ace和Chao1指数, 而对Shannon和Simpson指数无显著影响, 表明钝化剂的施加导致土壤细菌群落丰富度的显著下降, 而对细菌群落多样性无显著影响, 这与前人的研究结果不同[29]. 其原因一方面是钝化剂的添加显著提高了土壤pH值, 抑制了某类细菌的生长, 从而导致丰富度指数减小[30]；另一方面是由于壳聚糖是一种含氮高分子化合物, 钝化剂的添加显著提高了土壤碱解氮的含量[图 2(d)], 从而影响了微生物丰富度. 因此, 笔者推测, 钝化剂中氨基的引入是细菌群落丰富度下降的主要原因之一.
细菌群落结构是衡量土壤生态功能和肥力的重要指标[8]. 样本层级聚类分析结果显示, 各处理组之间菌群结构明显分离, 且NMDS分析表明各处理组间具有差异显著(图 7). 可见, 钝化剂的添加可对土壤细菌群落结构造成影响. 这与前人的研究结果一致, 生物炭的施加改变了土壤的孔隙度、抗拉强度和持水能力, 提高了土壤活性, 进而影响了土壤菌群结构[18]. 本研究结果显示, 放线菌门、变形菌门和酸杆菌门是土壤菌群中的优势门, 相对丰度超过全部菌门的80%(图 8). 而林少颖等[31]研究发现, 在施用生物炭的土壤中, 放线菌门、绿弯菌门和厚壁菌门是优势菌门, 这可能是因为酸杆菌门是嗜酸性细菌, 而施加的改性生物炭经过盐酸活化, 因此有利于酸杆菌门的生长繁殖. 此外, 由于变形菌门是细菌域中最大、最多样化的一门, 在土壤环境中广泛分布. 本研究中, 优势菌门在C1、C2和C3中表现不一致, 可能是因为放线菌门是寡营养型微生物, 而变形菌门是富营养型微生物[32]. 在低施加量(C1)下, 有利于放线菌门的生长繁殖；在中施加量(C2)下, 土壤中营养物质增加, 更加有利于变形菌门的生长繁殖；在高施加量(C3)下, 虽然土壤中养分增加, 但是由于生物炭中也含有一定量的苯酚等有毒化学物质, 可能会对细菌造成毒害[33], 因此变形菌门的相对丰度降低. 此外, 本研究结果显示, C3组中拟杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度较对照组显著降低. 拟杆菌可以编码大量水解酶[34], 芽单胞菌门的丰度与蔗糖酶和过氧化氢酶的活性之间存在显著相关关系[35]. 因此, 拟杆菌门和芽单胞菌门相对丰度的变化可能造成土壤中某些酶活性的改变.
本研究中土壤优势菌科为鞘脂单胞菌科、微球菌科、类诺卡氏菌科和地嗜皮菌科(图 9). 添加钝化剂后, 鞘氨醇单胞菌属和芽球菌属的相对丰度分别较对照提高了13.12%~40.75%和12.35%~42.52%. 由此可见, 钝化剂的施加导致部分有益微生物的相对丰度提高, 这也将大幅度提高土壤养分循环、促进植物生长、加速植物残体降解以及增加植物对病害抗性的潜在能力. 然而, 由于在本次试验中钝化剂的施用量不高, 施用时间较短, 某些种类的细菌可能需要时间来分解有机碳以维持微生物群的生存, 导致部分门属水平细菌群落丰度较低, 如节杆菌属的相对丰度较对照降低了20.22%~28.53%, 这可能是因为节杆菌属是土壤中的有机物分解者, 能降解多种环境污染物[36], 但是降解并利用有机物需要一定的时间；另一方面可能是因为节杆菌属适宜生活在偏碱性土壤环境[37], 因此在酸性土壤中节杆菌属的生长繁殖受限.
土壤细菌群落功能预测包括6个一级通路和48个二级通路, 在一级通路中, 代谢功能占主导地位, 其后依次是遗传信息处理和环境信息处理等[图 10(a)]；二级通路中相对丰度前10的功能以碳水化合物代谢为主, 其后依次为氨基酸代谢和能量代谢等[图 10(b)]. 与对照相比, 钝化剂的添加提高了代谢功能相关途径的相对丰度, 其中, 能量代谢和碳水化合物代谢与微生物呼吸有着密不可分的联系[38], 表明施加适量的钝化剂有利于提高土壤中微生物的活性, 从而增强对污染土壤中Cd2+的吸收. 核苷酸代谢和脂质代谢的增大, 反映了微生物细胞壁和核酸的合成能力增强[39]. 此外, 钝化剂的添加提高了遗传信息加工相关途径的相对丰度, 如翻译、复制与修复, 表明蛋白质合成和微生物细胞增殖效率增强. 而与环境信息处理相关的信号转导和膜转运通路相对丰度低于对照, 这有利于降低重金属向植物根系富集和转运的速度, 减弱重金属对植物的毒害作用[40].
3.4 钝化剂对土壤酶活性的影响土壤酶活性是反映土壤功能和质量的重要指标[41]. 脲酶活性对土壤氮素转化具有重要作用, 可作为重金属毒性指标[5]. 本研究中, 添加钝化剂处理组均导致土壤脲酶活性较对照显著增加[图 12(a)]. 这可能归因于生物炭在土壤溶液中释放出金属离子(K+、Na+、Ca2+和Mg2+等)可促进酶活性中心与底物间的配位结合, 形成酶-金属离子-底物三元复合物, 提高了土壤脲酶活性[42]. 此外, 生物炭支持氮的转化, 通过降低土壤中重金属的生物有效性来启动脲酶活性[20]. 本研究中使用的改性剂壳聚糖在一定程度上增加了土壤中的氮元素, 也是引起脲酶活性增加的原因之一.
纤维素酶可以影响疫霉菌的细胞壁并降低病原体产生孢子囊的能力, 从而显著抑制病原体的各项生理活动[43]. 在本研究中, 在C1和C2处理时, 均导致纤维素酶活性的显著增加. 已有研究表明, 鞘氨醇单胞菌具有高纤维素酶活性[44]. 因此, 笔者推测C1和C2处理组中鞘氨醇单胞菌属相对丰度的升高可能导致纤维素酶活性的增强.
过氧化氢酶和蔗糖酶是土壤中的重要酶类[45]. 本研究结果显示, 施加钝化剂后过氧化氢酶和蔗糖酶活性显著下降. 冯慧琳等[35]的研究表明, 过氧化氢酶和蔗糖酶的活性与芽单胞菌门细菌的丰度呈显著正相关关系. 在本研究中, 钝化剂添加后芽单胞菌门细菌的相对丰度降低, 故推测钝化剂添加后芽单胞菌门相对丰度的降低可能会导致蔗糖酶和过氧化氢酶的活性下降.
4 结论(1) 壳聚糖改性生物炭(钝化剂)的施加改善了土壤理化性质(pH、CEC和SOM), 提高了土壤养分含量(AN、AP和AK), 降低了有效态Cd含量, 进而影响了细菌群落结构和多样性.
(2) 增加钝化剂的施加量, 可以提高黑麦草根和茎叶生物量, 降低富集和运转系数, 从而降低Cd向植物体内的转移. 当施用量为3%时, 修复效果最佳. 这对壳聚糖改性生物炭在农田Cd污染土壤修复中的应用具有一定指导意义.
(3) 钝化剂的施加优化了土壤细菌群落结构, 提高了部分有益细菌的相对丰度, 促进了土壤代谢过程, 从而增强了土壤中微生物的活性, 抑制了重金属对植物的毒害作用.
(4) 钝化剂的表面官能团导致脲酶活性增加, 鞘氨醇单胞菌属相对丰度的升高导致纤维素酶活性增强, 芽单胞菌门相对丰度的降低导致蔗糖酶和过氧化氢酶的活性下降.
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