2024, Vol. 45
2. 黑龙江省黑土保护利用研究院, 哈尔滨 150086;
3. 福建师范大学地理科学学院, 碳中和未来技术学院, 福州 350117
, MA Xing-zhu2 , LIU Zi-kai1 , LIU Yan-ji1 , HAO Xiao-yu2 , ZHAO Yue2 , HE Ji-zheng1,3 , SHEN Ju-pei1,3
2. Heilongjiang Academy of Black Soil Conservation and Utilization, Harbin 150086, China;
3. School of Geographical Sciences, School of Carbon Neutrality Future Technology, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China
为满足日益增长的粮食需求, 农业化肥用量日渐增加, 据预测2030年全球施肥总量将增加至2.21亿t[1]. 施肥是农业生产中维持土壤肥力和提高作物产量的关键管理措施. 氮和磷是植物生长所必需的两种重要养分元素[2], 但过量施用会造成一系列环境问题[3, 4], 如地下水污染、水体富营养化、土壤酸化和盐渍化等[5]. 随着全球粮食需求的增加和饮食习惯的改变, 到2050年全球对磷的需求预计将增加50% ~ 100%[6]. 然而, 由于磷主要来自磷矿, 是一种稀缺的不可再生资源[7]. 根据全球范围内磷消耗速度, 磷矿预计将在1~2个世纪内耗尽. 因此, 合理施肥对农田生态系统可持续利用具有重要战略意义和生态意义.
土壤酶与能量传递、外源性物质的解毒和土壤结构稳定等有关, 通常被认为是土壤质量的生物标志物[8, 9]. 土壤酶活性是养分循环的主要驱动者, 在土壤肥力、土地利用方式和环境污染等方面应用较为广泛[10]. 有研究表明土壤酶活性对环境变化或耕作措施等因素造成的变化十分敏感, 能快速反映土地管理措施的生态效应[11]. 近期, Jian等[12]对65篇施氮处理的研究结果利用模型进行整合分析, 发现氮肥输入促进碳和磷相关水解酶活性, 而对氮相关水解酶无显著影响, 且碳循环相关水解酶与微生物生物量显著正相关. 因此, 结合长期定位站的控制实验, 可从土壤生物学过程深入理解和预测未来氮磷输入对土壤环境质量和功能的变化趋势[13].
生态酶化学计量法可评价微生物资源利用策略的优劣[14, 15], 特别是与碳、氮和磷循环紧密相关的酶, 如酸性磷酸酶（AP）、β-D-葡萄糖苷酶（BG）、β- N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）和L-亮氨酸氨基肽酶（LAP）[16]. 2008年, Sinsabaugh等[17]提出BG/（NAG + LAP）和BG/AP的值可以分别反映土壤微生物对氮和磷养分的相对需求, 并且指出在全球尺度上酶化学计量比：BG/AP为0.62, BG/（NAG+LAP）为1.41[18]. Moorhead等[19]进一步通过酶化学计量法得到酶矢量长度和角度, 用于反映土壤微生物碳和磷的限制. 笔者前期对不同土地利用方式下土壤酶活性进行矢量分析, 发现土壤酶矢量角度均 > 45°, 说明土壤受磷限制的影响[20]. 作物在生长过程中由于化肥的大量投入, 会改变土壤养分及生态酶化学计量关系, 进而可能影响微生物资源利用. 近期有研究从微生物群落组成的角度解析了酶化学计量比和磷限制的关系, 指出长期施肥处理引起土壤养分不平衡现状[21], 用于判定施肥措施与养分利用的契合度. 然而对长期施肥措施下土壤肥力状况和养分限制的年际动态变化特征还不清楚.
我国黑土区主要分布在东北地区, 有机质含量高, 土层厚, 结构良好, 是我国重要的粮食基地. 前人研究发现不同施肥处理下东北黑土区微生物主要受到碳和磷的限制[22], 而不是氮的限制. Hou等[23]基于全球农田生态系统磷利用现状的整合分析也得出类似结论. 因此, 为进一步解析长期施肥措施下黑土养分限制状况, 本文以典型黑土长期试验样地为研究对象, 探讨长期氮磷输入背景下土壤酶化学计量特征及与土壤养分的关系, 探究土壤微生物资源利用策略, 以期为科学施肥、提高土壤肥力和作物产量提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 样地概况本实验样地位于黑龙江省哈尔滨市道外区民主乡实验基地（126°35′E, 45°40′N）, 海拔151 m, 属松花江二级阶地. 地处中温带, 一年一熟制, 冬季寒冷干燥, 夏季高温多雨, ≥ 10℃平均有效积温2 700 ℃, 年均日照时数2 600 ~ 2 800 h, 年降雨量533 mm, 无霜期约135 d. 实验地为旱地干土, 成土母质为洪积黄土状黏土. 长期实验开始于1979年, 1980年按照小麦-大豆-玉米顺序轮作. 1979年实验初始部分土壤基本性质：pH为7.2、ω [有机质（SOM）]为26.62 g·kg-1、ω[全氮（TN）]为1.39 g·kg-1、ω[碱解氮（AN）]为151 mg·kg-1、ω[全磷（TP）]为0.47 g·kg-1和ω[速效磷（AP）]为22.2 mg·kg-1.
1.2 实验设计和采样选择上述实验样地中4种处理, 即施氮（N）、施磷（P）、氮磷混施（NP）和不施肥（CK）, 每种处理3次重复, 共计12个样方, 每个样方36 m2. 小麦种植年和大豆种植年均在秋季施肥, 玉米种植年氮肥50%秋施, 50%于大喇叭口期追施. 其中氮肥为尿素（含N量为46%）, 磷肥为重过磷酸钙（含P2O5量为46%）、磷酸二铵（含N量为18%, 含P2O5量为46%）, 每年肥料施用量分别为N 150 kg·hm-2和P 75 kg·hm-2（种植小麦或玉米）, 或N 75 kg·hm-2和P 150 kg·hm-2（种植大豆）.
土壤样品分别采集于2021年4月和2022年4月, 分别为玉米年和小麦年, 采用五点取样法, 在每个样方的核心区随机选取5个点, 清除地表枯枝落叶, 用直径5 cm的土钻取表层0~20 cm土壤混匀, 冰盒保鲜条件下带回实验室. 挑去碎石及可见的植物根系, 过2 mm筛后, 将样品分为两部分：一份置于4℃冰箱用于鲜样指标测定；一份风干后过100目筛用于土壤C、N和P等元素的全量测定.
1.3 土壤理化性质测定土壤化学性质采用常规土壤农化分析方法测定[24]：土壤pH值以水土比2.5∶1, 使用pH计测定. 土壤NH4+-N和NO3--N测定步骤是取5 g鲜土用1 mol·L-1 KCl浸提, 浸提后用连续流动分析仪（San++System, Skalar, Holland）测定. 土壤总碳（TC）和总氮（TN）含量用风干土样研磨过100目筛后, 利用碳氮元素分析仪（VarioMAX, Elementar, Germany）采用燃烧法测定. 土壤全磷（TP）含量测定采用H2SO4-HClO4消煮法, 使用钼蓝比色法, 用酶标仪（SPARK A-5082 Grodig Austria）在880 nm波长处测定吸光值. 土壤可溶性有机碳（DOC）和可溶性有机氮（DON）的测定过程如下：称取10 g鲜土加入40 mL去离子水, 25 ℃恒温振荡30 min, 离心后过0.45 μm滤膜, 用岛津碳氮分析仪（TOC Vcph, Shimadzu, Kyoto Japan）和连续流动分析仪（San++System, Skalar, Holland）测定. 土壤速效磷（AP）采用盐酸氟化铵提取法, 用0.03 mol·L-1 NH4F-0.025 mol·L-1 HCl溶液, 以土水比为1∶10浸提, 振荡30 min后使用定量滤纸过滤, 钼蓝比色法测定.
1.4 土壤微生物生物量碳氮磷的测定土壤微生物生物量碳（MBC）、氮（MBN）和磷（MBP）测定采用氯仿熏蒸法[20]：在氯仿熏蒸前称取相同量的两份土壤样品于玻璃培养皿中, 将其放入真空干燥器, 一份通过抽真空使氯仿充分沸腾, 气态氯仿在土壤孔隙中扩散, 另一份不做真空抽气处理, 在黑暗条件下培养24 h, 培养后的土壤用0.5 mol·L-1 K2SO4浸提, 浸提液过0.45 μm滤膜, 用岛津碳氮分析仪和连续流动分析仪测定MBC和MBN；用0.03 mol·L-1 NH4F-0.025 mol·L-1 HCl溶液, 以土水比1∶10浸提, 钼蓝比色法测定其含量, 最后用熏蒸样品减去未熏蒸样品, 再除以转换系数, 其中MBC的转换系数为0.45, MBN的转换系数为0.54, MBP的转换系数为0.4.
1.5 土壤酶活性的测定土壤ACP、BG、NAG和LAP采用荧光底物法测定[25]. 简要步骤如下：称取2.75 g鲜土于烧杯中并加入91 mL醋酸钠缓冲液（pH = 5.0）, 使用磁力搅拌器破碎摇匀10 min, 吸取上清液转移至不透明96孔板中, 以甲基伞型酮（MUB）和甲基香豆素（MUC）分别制定不同梯度浓度标准曲线并设置相应样品和以醋酸钠缓冲液代替样品上清液的阴性对照重复, 最后在样品和阴性对照中加入50 μL相应水解酶的特定底物溶液, 在室温（25℃）黑暗条件下培养4 h, 使用酶标仪（SPARK A-5082 Grodig Austria）在450 nm波长进行荧光读数, 根据制定的标准曲线计算土壤酶活性, 其单位为nmol·（g·h）-1.
1.6 酶化学计量分析采用矢量分析法来评估微生物资源限制. 较长的矢量长度表示更大的碳限制；矢量角度 < 45°和 > 45°分别表示氮限制和磷限制[26]. 矢量长度（vector length, VL, 无单位）和矢量角度[vector angle, VA, （°）]的计算公式[15]如下：
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(1) |
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(2) |
式中, Degrees为角度转换函数, ATAN2为反正切函数. VL越长, 表示C限制越大；VA < 45°和VA > 45°分别表示N限制或P限制的相对程度, 偏离程度越大, 限制越强.
1.7 数据处理不同施肥处理下土壤性质、酶活性差异检验采用双因素方差分析（two-way ANOVA）. 采用Canoco 4.5对土壤理化性质和土壤酶活性作冗余分析（redundancy analysis, RDA）, 可视化通过R 4.2.0软件的ggplot2包完成.
2 结果与分析 2.1 不同施肥处理对黑土土壤性质的影响如表 1所示, 长期施肥处理对黑土土壤性质产生显著影响. N和NP处理土壤pH显著低于P和CK处理（P < 0.05）, 而土壤TC和TN在不同处理间无显著差异（P ≥ 0.05）. 施磷显著增加土壤TP和AP含量. 与CK和P处理相比, 土壤NH4+-N、NO3--N和DON在N和NP处理显著增加. 如表 2所示, 所有施肥处理土壤DOC含量显著高于CK. 除2022年N和NP处理MBC含量显著低于其他处理外, MBC和MBN含量在各处理间均无显著差异. P和NP处理与CK相比显著增加土壤MBP含量.
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表 1 不同施肥处理下土壤理化性质1） Table 1 Soil properties in different fertilization treatments |
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表 2 不同施肥处理下可溶性有机碳氮和微生物生物量碳氮磷含量/mg·kg-1 Table 2 Soil DOC, DON, MBC, MBN, and MBP in different fertilization treatments /mg·kg-1 |
氮磷输入对黑土土壤理化性质的双因素方差分析如表 3所示. 施氮在2年内均对pH、NO3--N和DON含量产生显著影响, 而施磷显著影响TP、DOC、AP和MBP含量, 氮和磷的交互作用仅对AP产生显著影响.
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表 3 氮磷输入对土壤性质影响的双因素方差分析（F值）1） Table 3 Two-way ANOVA (F values) of nitrogen and phosphorus inputs on black soil properties |
2.2 不同施肥处理下土壤酶活性 2.2.1 不同施肥处理土壤酶活性的年际变化特征
不同施肥处理下土壤酶活性如图 1所示. 2021年和2022年土壤酶活性变化基本相似, 即N和NP处理ACP和BG酶活性均显著高于无N处理（CK和P, P < 0.05）, 其酶活性比CK分别增加68% ~ 158%和26% ~ 222%. 与氮循环相关的NAG酶活性在P和NP处理显著高于CK和N处理, 其酶活性最高达75.48 nmol·（g·h）-1和106.81 nmol·（g·h）-1. N处理下LAP酶活性显著高于其他处理, 其酶活性最高为13.68 nmol·（g·h）-1, 而CK和P处理间无显著差异.
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不同小写字母表示同一年不同处理间差异显著（P < 0.05） 图 1 不同施肥处理下土壤酶活性年际变化 Fig. 1 Changes in soil enzyme activities in different fertilization treatments |
氮磷输入对黑土土壤酶活性的双因素方差分析如表 4所示. 施氮和施磷在2年内均对4种酶活性产生显著影响, 氮和磷的交互作用除2021年BG和2022年ACP酶外对其他酶活性均产生显著影响.
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表 4 氮磷输入对土壤酶活性的双因素方差分析（F值）1） Table 4 Two-way ANOVA (F values) of nitrogen and phosphorus inputs on black soil enzyme activity |
2.2.2 不同施肥处理下土壤酶活性的主要影响因子
采用RDA分析方法进一步探究不同土壤性质对酶活性的影响, 结果如图 2所示. 土壤性质对酶活性变化总的解释量为86.71%, 其中第一和第二轴分别解释了酶活性变化的55.63%和27.26%. 土壤性质对酶活性变化的贡献从高到低为：pH > MBP > AP > DOC > NO3--N. 其中pH（F = 19.9, P = 0.002）为最显著影响因子, 解释了47.5%的酶活性变化, 其余依次是MBP（20.5%, F = 13.5, P = 0.002）、AP（4.9%, F = 4.2, P = 0.046）、DOC（4.7%, F = 3.4, P = 0.05）和NO3--N（4.3%, F = 4.2, P = 0.026）. 此外不同土壤性质与土壤酶活性的相关性差异很大, 如ACP和BG酶活性与pH显著负相关, 与NO3--N、DON和NH4+-N显著正相关. NAG酶活性与AP、MBP和TP及DOC、TN呈正相关, 而与pH呈显著负相关. LAP酶活性与MBP、AP和TP、DOC呈负相关, 并与NO3--N和DON正相关.
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红色箭头连线表示具有显著影响的理化因子（P < 0.05）, 蓝色箭头连线表示4种水解酶 图 2 土壤性质与酶活性的冗余分析 Fig. 2 Redundancy analysis of soil properties and enzyme activities |
为更好解析土壤酶化学计量特征, 设定lnBG/ln（NAG+LAP）为酶C∶N, ln（NAG+LAP）/lnACP为酶N∶P, lnBG/lnACP为酶C∶P. 结果如表 5所示, N处理显著增加酶C∶N, 即施氮增强了微生物的碳限制. N处理下酶N∶P值显著小于其他处理. 此外, 不同处理矢量长度均值的变化范围为1.32 ~ 1.52（图 3）, 各处理间差异显著, N和NP处理下矢量长度增加. 不同施肥处理下的土壤酶矢量角度均 > 45°, 并在N处理中出现最大值. 根据酶化学计量比假说, 说明该农田生态系统土壤微生物主要受碳和磷限制.
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表 5 不同施肥处理下土壤酶化学计量比1） Table 5 Characteristics of soil enzymatic stoichiometry in different fertilization treatments |
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不同小写字母表示同一年不同处理间差异显著（P < 0.05） 图 3 不同施肥处理下土壤酶活性矢量长度和矢量角度 Fig. 3 Enzyme activity vector length and vector angle in different fertilization treatments |
近年来由于环境变化和高强度的农业管理方式, 黑土质量持续下降. 本研究发现施肥措施对土壤性质产生显著影响（表 1）. 施用氮肥显著降低土壤pH值, 导致土壤酸化. 这主要与外源氮的输入有关, 施氮加快了土壤硝化过程, 产生大量氢离子, 从而降低土壤pH值[27]. 同时研究发现氮的输入显著影响可溶性氮和硝态氮含量. 土壤DOC和DON含量在很大程度上受到施肥、种植方式和耕作等人为方式的影响[28]. 夏文建等[29]研究发现施用化肥可显著增加可溶性有机氮含量, 这是由于施用化肥可以增加作物产量, 继而有更多的作物残体等碳源返回土壤. 土壤微生物生物量作为相对易分解和周转较快的营养库, 对碳、氮和磷的生物地球化学循环起着重要的驱动作用. 本研究发现氮输入均降低了MBC含量, 且在2022年达到显著水平, 而对MBN的影响不显著, 主要原因是由于氮肥的长期施用引起土壤pH降低, 进而抑制了微生物特别是细菌的生长, 这与以往的研究结果一致[22, 30]. 另外, 相比自然生态系统, 在高度集约化管理的农田生态系统中由于缺乏可利用的碳资源, 微生物无法利用额外的氮肥, 从而影响微生物生长, 同时也会加剧土壤氮以硝酸盐的形式淋失[31]. 这也说明有机无机配施可以显著促进微生物生长[32], 但单纯施用化肥的影响却因土壤类型和环境而异. 另外, 有研究发现土壤MBP含量与土壤TP和AP含量的变化一致, 即施用磷肥显著提高TP、AP和MBP含量[33], 这与以往长期施用磷肥的研究结果一致[34]. 土壤AP反映植物易吸收利用的磷含量, 有研究发现其含量在N处理时也升高, 这可能与施氮导致土壤酸化增加土壤中磷的溶解性有关[35]. 土壤MBP是重要的活性磷库, 在P处理下, MBP越高, 表明土壤磷固定量越少, 即提高了磷供应能力, 同时降低了磷淋溶风险. 本研究中外源磷的输入显著增加MBP含量, 推测主要原因是微生物以多聚磷酸盐的形式大量富集在细胞体内, 以此适应外界环境变化[36, 37].
3.2 不同施肥处理对土壤酶活性的影响微生物作为土壤水解酶的主要驱动者, 会根据外界环境养分可利用性调控酶的产生[38]. 施氮显著提高ACP酶活性, 因氮添加后土壤主要受磷限制, 微生物需要分泌大量磷酸酶以获取更多的磷来减轻这一限制, 继而维持土壤酶的内稳态[39], 而在NP处理中, 磷大部分被细胞所富集, 继而表现为与N处理类似的结果. 这种养分的添加改变不同酶活性来影响另一种养分的方式被称为资源分配原则[40], 有研究发现施磷也显著影响氮相关水解酶活性[41]. BG酶是纤维二糖参与纤维素降解的水解酶[42]. 有研究发现施氮显著提高BG酶的活性, 主要是由于氮肥的大量输入加大了微生物对碳的需求, 促进了微生物分泌碳获取酶[15]. NAG酶和LAP酶是分解氮有机化合物的主要水解酶, 通过本研究发现氮输入显著增加了两者的活性, 特别是NAG酶, 这和前人基于64个研究工作的整合分析结论一致, 主要原因是受土壤pH变化的影响[43]. 而有研究证实氮获取酶NAG酶活性与土壤pH呈负相关关系[17], 而氮肥显著降低了土壤pH值[44], 这也可以从RDA结果中得到验证. 有研究表明, 土壤pH、有机质和微生物生物量是驱动土壤酶活性变化的主要因子[45, 46]. 本研究发现对土壤酶活性影响最大的土壤性质为pH. ACP和NAG酶活性与pH值呈显著负相关关系. 王涵等[45]也发现pH值变化对酶活性具有抑制作用. BG酶活性与可溶性有机氮显著正相关, 这与前人研究的结果一致[46], 因为氮有效性可能会改变微生物群落组成, 如较高的氮有效性可能会促进富营养型微生物的生长, 从而刺激纤维素酶活性, 提高有机物的降解. LAP酶与NO3--N和DON呈正相关[47], 这也解释了施氮对LAP酶活性的促进作用.
3.3 土壤酶化学计量比与养分限制土壤酶活性在一定程度上反映土壤微生物活性的强度. 单一酶活性的变化不能完全反映出微生物资源的限制情况, 因为资源限制是由多种营养元素的相对可利用性决定的[48]. 通过计算土壤酶化学计量比, 本研究发现酶N∶P在N处理中显著降低, 施氮显著增强ACP酶活性, 表明施用氮肥会加剧土壤养分的磷限制. 这一现象在以往研究中已被证实[49]. 酶C∶N在N处理显著增加, 与土壤受碳限制影响有关. 因为本研究表明未施肥处理lnBG/ln（NAG+LAP）值> 1, 说明研究样地存在碳限制的现象, 而施用氮肥则加剧微生物的碳限制, 这也与Chen等[14]在其整合分析中发现氮的添加加剧微生物碳限制的结论一致. 本研究酶矢量长度在1.32 ~ 1.52, 说明该黑土土壤在长期化肥处理下呈现碳限制, 而酶矢量角度均 > 45°, 说明土壤呈现磷限制[19], 尤其是在N处理中. 酶化学计量学结果表明, 土壤微生物群落整体受到碳和磷限制, 本研究结果和前人在公主岭黑土的结果一致[21]. 以上结果说明施氮会使磷限制成为黑土区一个普适性问题[21, 23], 在受磷限制的环境中, 通过调节微生物功能或丰度来分泌大量磷酸酶以获取更多的磷元素, 同时加速过量元素（如氮）的周转[50]. 另外, 微生物也可以通过氮获取酶如NAG和LAP酶获取更多的碳, 减缓土壤碳限制问题[51]. 可见, 长期施肥改变了微生物资源限制的模式和程度, 这一研究结果对认识和研究农业生态系统养分供应和地上植物生产力的关系具有重要参考价值.
4 结论（1）施氮在2年内均对pH、NO3--N和DON含量产生显著影响, 而施磷显著影响TP、DOC、AP和MBP含量, 氮和磷的交互作用仅对AP产生显著影响.
（2）N、P处理对4种土壤酶活性均产生了极显著的影响. RDA分析发现土壤因子对土壤酶活性变化的贡献从高到低为：pH > MBP > AP > DOC > NO3--N. pH对ACP和BG酶活性具有抑制作用.
（3）酶化学计量比结果发现BG/（NAG+LAP） > 1, 酶矢量角度均 > 45°, 且施氮显著增加酶C∶N、减少酶N∶P和增加矢量长度和角度, 则表明黑土土壤微生物受到碳和磷的共同限制, 施氮会加剧微生物的碳和磷限制.
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