锑（Sb）是第五周期第VA族的类金属元素, 其化学性质与砷（As）类似, 在阻燃剂、电池、合金和催化剂等工业产品中应用广泛^{[1, 2]}. Sb污染主要来源于采矿、冶炼和工业排放等过程, As常作为共同污染物出现. 欧洲联盟理事会（CEC）和美国环境保护署（USEPA）已将Sb及其化合物列为优先污染物^{[3 ~ 5]}. 我国已探明的锑矿114个, 主要分布于湖南、贵州和广西等省份, Sb储备量占全球产量的53%^[6], 在锑矿周围土壤中发现了高含量的Sb和As, Sb含量升高时对大多数生物体有毒害^{[7 ~ 9]}.

微生物是土壤生态、环境、免疫等功能的重要参与者, 对土壤中重金属的迁移转化及修复具有重要意义. 微生物能够通过氧化还原和甲基化等生化反应实现重金属原位固化, 减少其对环境造成的危害. Wang等^[10]研究发现脱硫弧菌（Desulfovibrio spp.）介导了S氧化与Sb（Ⅴ）还原耦合. 脱硫弧菌的分布与S和Sb含量相关, 随着S和Sb含量的变化而改变, 在Sb矿尾矿中的相对丰度高于周边地区. 微生物群落结构及其代谢活动也容易受到极端地球化学条件的影响. 尾矿中的pH、EC以及Cd、Mn、Pd和V元素是调节微生物群落组成的重要影响因子^[11]. 高含量Cu、Cd、Pb、Zn和As降低了土壤细菌群落的丰富度和多样性, 增加了特殊细菌的数量^[12]. 有研究表明, 重金属对微生物的毒害作用与其生物可利用的有效态密切相关. Sun等^[13]在西南半坡锑矿开展了Sb污染组分和土壤微生物的交互作用研究, 确定了微生物群落的关键成员和功能基因, 表明微生物群落与Sb和As污染组分之间存在较强的相关性, 可能在As（Ⅲ）和Sb（Ⅲ）氧化还原中发挥重要作用. 目前, 对锑矿不同功能分区（采矿区和冶炼区）中Sb形态分布特征及其有效态对微生物群落生态效应的研究还比较匮乏. 本研究旨在：①明确锑矿不同功能分区中Sb的形态分布特征和污染现状；②识别微生物群落结构变化的主导环境因子. 通过深入研究重金属有效态对微生物群落的生态效应, 以期为锑矿区生态修复和生态环境管理提供重要参考.

研究区位于甘肃省东南部的陇南市北端西和县, 地处长江流域西汉水上游. 境内平均海拔为1 692 m, 年平均气温为8.4℃, 无霜期为183 d, 降水量为533 mm. 锑矿种类为辉锑矿（硫化锑, Sb₂S₃）, ω（Sb）平均值为2.86%, Sb储量为14.9万t, 占全国储量8%, 居全国第三^[14]. 使用便携式XRF土壤重金属检测仪初步查明土壤中超标重金属主要是Sb和As. 依据《土壤环境监测技术规范》（HJ/T 166-2004）, 采用“网格法”结合实际情况布点, 在采矿区布设9个样点, 冶炼区布设12个样点, 对照区布设3个样点（见图 1）. 每个样点采用五点法取样, 取0~20 cm的表层土壤均匀混合, 共采集24个土壤样品. 一部分土壤样品用自封袋装好放入4℃保温箱, 带回实验室放在-80℃冰箱保存, 用于16S rDNA高通量测序, 另外一部分土壤样品经过筛后测定土壤理化性质和重金属的化学形态. 在采样过程中, 使用GPS精确记录样点位置.

图 1

Fig. 1

图 1 研究区地理位置与采样点位分布示意 Fig. 1 Geographical location of the study area and the distribution of sampling sites

土壤pH、氧化还原电位（Eh）和电导率（EC）用电位法测定^[15], 含水率（WAF）用烘干法测定^[16], 阳离子交换量（CEC）用分光光度法测定^[17], 有机质（SOM）用高温灼烧法测定^[18], 总氮（TN）、总磷（TP）和总钾（TK）用高氯酸-氢氟酸联合消解法测定^[19], 锑（Sb）和砷（As）由原子荧光法测定（HJ 680-2013）^[20].

Wenzel连续提取法是由土壤砷（Zenien-Brummer法）与土壤磷（Change-Jascon法）提取方法联合优化得到, 提取步骤如表 1所示^[21].

表 1 (Table 1)

表 1 Wenzel连续提取法的提取步骤 Table 1 Sequential extraction procedure of Wenzel methods 重金属的化学形态 提取剂和提取条件 水土比（mL∶g） 非专性吸附态（F1） 0.05mol·L-1（NH4）2SO4, 25 ℃振荡4 h 25∶1 专性吸附态（F2） 0.05mol·L-1 NH4H2PO4, 25 ℃振荡16 h 25∶1 无定型铁铝氧化物结合态（F3） 0.2 mol·L-1草酸铵缓冲液（pH=3）, 25℃振荡4 h 25∶1 晶质铁铝氧化物结合态（F4） 草酸铵（0.2 mol·L-1）+抗坏血酸（0.1 mol·L-1）, pH=3, 96 ℃振荡30 min 25∶1 残渣态（F5） 消解后测定 25∶1

表 1 Wenzel连续提取法的提取步骤 Table 1 Sequential extraction procedure of Wenzel methods

潜在生态风险指数法用于评估土壤（沉积物）中单一或多种重金属的潜在生态风险, 潜在生态风险评价等级如表 2所示^[22]. 计算公式如下：

(1)

表 2 (Table 2)

表 2 潜在生态风险评价等级 Table 2 Classification of potential environmental risk assessment Er 风险等级 RI 风险等级 < 40 轻微 < 65 轻微 40~80 中等 65~130 中等 80~160 较强 130~260 很强 160~320 很强 > 260 极强 > 320 极强

表 2 潜在生态风险评价等级 Table 2 Classification of potential environmental risk assessment

式中, RI土壤中多种重金属元素的潜在生态危害指数（无量纲）；E_r为第i种重金属的潜在生态危害系数（无量纲）；C_i为第i种重金属实测含量（mg·kg^-1）；C_mⁱ第i种重金属参比值（mg·kg^-1）；T_rⁱ为第i种重金属生物毒性响应因子（无量纲）.

地累积指数法（I_geo）主要利用重金属含量与背景值的关系来描述污染程度, 地累积指数污染等级与污染程度如表 3所示^[22]. 计算公式如下：

(2)

表 3 (Table 3)

表 3 地累积指数污染等级与污染程度 Table 3 Pollution degree of the geo-accumulation index method Igeo 污染等级 污染程度 < 0 0 清洁 0~1 1 轻度污染 1~2 2 偏中污染 2~3 3 中度污染 3~4 4 偏重污染 4~5 5 重度污染 > 5 6 严重污染

表 3 地累积指数污染等级与污染程度 Table 3 Pollution degree of the geo-accumulation index method

式中, I_geo为重金属元素的地累积指数（无量纲）；C_n为某测量元素的含量（mg·kg^-1）；B_n为土壤中该元素的背景值（mg·kg^-1）；k为岩石成因效应（取值为1.5, 无量纲）.

样品的基因组DNA采用CTAB方法提取. 用341F（CCTAYGGGRBGCASCAG）和806R（GGACTAC NNGGGTATCTAAT）引物对V3+V4可变区进行PCR扩增. 用1XTAE 2%含量的琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物. 用Universal DNA（TiaGen, China）纯化回收试剂盒回收目的条带. 用NEB Next^®Ultra DNA Library Prep Kit建库试剂盒进行文库构建, 将构建好的文库使用安捷伦5400片段分析仪进行检测和Q-PCR定量, 并用NvaSeq 6000测序仪进行上机测序. 用QIIME2中的DADA2将高质量的reads聚为扩增子序列变异^[23]. 代表性序列使用SILVA数据库进行分类注释^[24].

采用单因素方差分析（ANOVA）计算统计学差异. 在QIIME2中进行计算α多样性（Chao1指数、PD指数、Observed指数和Shannon指数）. 基于偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）与置换多元方差分析（PERMANOVA）确定不同功能分区中微生物结构差异性. 使用线性判别效应分析（LEfSe）识别不同功能分区中的特征微生物（LDA判别阈值大于3, P < 0.05；http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）. 利用Spearman相关性和方差分解分析（VPA）解释各环境因子与微生物群落结构之间的关系, 随机森林（RF）预测各环境因子在不同功能分区中对微生物群落结构变化的贡献率, 冗余分析（RDA）分析确定重金属及其有效态对微生物群落结构的影响, 线性回归模型确定微生物指标与地累积指数（I_geo）之间的关系方程并证明指标的适用性.

如表 4所示, 土壤样品pH值介于7.89~8.27之间, WAF在14.13%~18.83%之间, Eh在296.14~322.77 mV之间, EC在148.17~238.52 μS·cm^-1之间, CEC在14.60~22.57 cmol·kg^-1之间, ω（SOM）在14.78 ~19.64 g·kg^-1之间. 不同功能分区中pH、WAF、Eh和CEC有所差异, 但未达到显著水平（P≥0.05）, EC和SOM具有显著差异（P < 0.05）. ω（Sb）在15.96~4 958.18 mg·kg^-1之间, ω（As）在14.17~418.39 mg·kg^-1之间. ω（Sb）大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区, ω（As）大小为：采矿区 > 冶炼区 > 对照区（P < 0.05）. 采矿区和冶炼区中ω（Sb）和ω（As）都超过了《土壤环境质量建设用地土壤环境污染风险管理标准（试行）》（GB 36600-2008）中的第二类管制值[ω（Sb）：360.00 mg·kg^-1, ω（As）：140.00 mg·kg^-1]^[25].

表 4 (Table 4)

表 4 不同功能分区土壤的理化性质1） Table 4 Soil physical and chemical properties in different functional areas 理化性质 对照区 采矿区 冶炼区 P值 pH 8.156 7 ± 0.083 3 8.272 2 ± 0.216 9 7.894 2 ± 0.349 9 0.222 0 WAF/% 0.188 3 ± 0.013 47 0.150 6 ± 0.043 21 0.141 3 ± 0.034 0 0.207 9 Eh/mV 322.766 7 ± 12.141 0 296.144 4 ± 26.355 5 318.366 7 ± 42.347 3 0.306 6 EC/μS·cm-1 148.166 7 ± 17.069 4 174.046 3 ± 133.978 5 238.519 4 ± 92.564 4 0.016 0 CEC/cmol·kg-1 22.570 0 ± 4.868 3 14.600 0 ± 8.040 4 21.440 0 ± 7.581 8 0.107 0 ω（SOM）/g·kg-1 19.643 2 ± 4.262 4 14.780 1 ± 4.867 34 48.269 0 ± 57.054 0 0.016 0 ω（Sb）/mg·kg-1 15.961 6 ± 15.290 2 630.619 3 ± 429.449 2 4 958.176 1 ± 9 023.249 6 0.000 4 ω（As）/mg·kg-1 14.171 6 ± 0.922 3 418.389 6 ± 505.782 7 163.903 3 ± 352.485 7 0.001 0 1）数据以“平均值±标准差”表示；数据间的差异显著水平为P < 0.05

表 4 不同功能分区土壤的理化性质1） Table 4 Soil physical and chemical properties in different functional areas

通过Wenzel连续提取法获得了Sb和As的非专性吸附态（F1）、专性吸附态（F2）、无定型铁铝氧化物结合态（F3）、晶质铁铝氧化物结合态（F4）和残渣态（F5）. 回收率常用来判断该提取法是否适用于目标元素的形态提取^[21]. 采用Wenzel连续提取法得到Sb的平均回收率为88.84%, As的平均回收率为94.10%, 说明Wenzel连续提取法适用于对Sb和As的化学形态进行提取. 如图 2所示, Sb和As的化学形态分布占比大小为：F3 > F4 > F5 > F2 > F1. Sb主要以无定型铁铝氧化物结合态（F3）赋存, 占比为48.37%, 非专性吸附态（F1）占比为0.56%, 专性吸附态（F2）占比为1.68%, 晶质铁铝氧化物结合态（F4）占比为20.35%, 残渣态（F5）占比为17.88%. As主要以无定型铁铝氧化物结合态（F3）赋存, 占比为39.77%, 非专性吸附态（F1）占比为0.48%, 专性吸附态（F2）占比为6.85%, 晶质铁铝氧化物结合态（F4）占比为27.95%, 残渣态（F5）占比为19.05%. Wenzel法连续提取得到的非专性吸附态（F1）是有效态, 专性吸附态（F2）迁移能力与活性小于非特异性吸附态, 但在适宜的外界条件下, 专性吸附态（F2）的活性会发生显著地提高. 因此, 本文根据化学形态的定义及性质将非专性吸附态（F1）与专性吸附态（F2）定义为有效态[有效态锑：Sb（Bio）, 有效态砷As（Bio）]. 如图 3所示, ω[Sb（Bio）]大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区（P < 0.01）, ω[As（Bio）]大小为：采矿区 > 冶炼区 > 对照区（P < 0.05）.

图 2

Fig. 2

图 2 不同功能分区中Sb和As的化学形态分布占比 Fig. 2 Chemical speciation characteristics of Sb and As in different functional areas

图 3

Fig. 3

*表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ns表示无显著差异 图 3 不同功能分区中Sb和As的有效态含量 Fig. 3 Bioavailable concentrations of Sb and As in different functional areas

如图 4（a）所示, 潜在生态风险指数法结果表明, Sb的E_r值在0.51~1 684.40之间, As的E_r值在1.09~118.68之间, RI值在1.09~1 803.08之间. Sb的E_r值大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区（P < 0.05）, As的E_r值大小为：采矿区 > 冶炼区 > 对照区（P < 0.05）, 潜在生态风险指数（RI）大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区（P < 0.05）. 如图 4（b）所示, Sb的I_geo值在0.48~3.39之间, As的I_geo值在1.81~3.39之间. 如表 5所示, Sb污染程度的大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区（P < 0.05）, 采矿区为中度至重度, 冶炼区为严重污染；As污染程度的大小为：采矿区 > 冶炼区 > 对照区（P < 0.05）, 采矿区与冶炼区均为中度至重度污染.

图 4

Fig. 4

图 4 不同功能分区中Sb和As的污染特征 Fig. 4 Contamination characteristics of Sb and As in different functional areas

表 5 (Table 5)

表 5 不同功能分区中Sb和As污染程度1） Table 5 Levels of Sb and As contamination in different functional areas 污染程度 对照区 采矿区 冶炼区 Er（As） 1.13 ± 0.07 16.39 ± 13.50 15.36 ± 31.27 Er（Sb） 0.81 ± 0.40 247.78 ± 316.39 889.66 ± 485.01 RI 1.94 ± 0.47 264.17 ± 310.57 905.02 ± 502.86 风险等级 低 中等 极高 Igeo（As） 1.87 ± 0.02 2.98 ± 0.66 2.46 ± 0.56 污染程度 中度污染 中度至重度污染 中度至重度污染 Igeo（Sb） 0.78 ± 0.33 2.43 ± 0.23 3.01 ± 0.33 污染程度 无污染 中度至重度污染 严重污染 1）数据以“平均值±标准差”表示

表 5 不同功能分区中Sb和As污染程度1） Table 5 Levels of Sb and As contamination in different functional areas

通过高通量测序与质量控制共计得到1 329 964条高质量的16S rDNA序列. 如图 5（a）所示, 随着随机抽样的测序深度增大, 各样品的稀释曲线趋向平缓, 表明本次试验测序量充足, 基本覆盖到各分析样本中的绝大部分物种. 从稀释曲线可以初步看出, 物种丰富度大小为：对照区 > 冶炼区 > 采矿区. 为了探索对照区、采矿区和冶炼区之间微生物群落的异同, 分析了所有样品中的特有和共有OTUs, 如图 5（b）所示. 样品中存在1 574个共有OTUs, 对照区和采矿区中共检测到11 316个共有OTUs, 对照区和冶炼区有17 947个共有OTUs, 采矿区和冶炼区共有26 426个共有OTUs. 与对照区（3 455个OTUs）相比, 采矿区（9 525个OTUs）和冶炼区（13 738个OTUs）可能存在更多的特有细菌.

图 5

Fig. 5

（a）97%条件下各样本的稀释曲线, （b）共有或特有物种韦恩图 图 5 相似度为97%条件下各样本的稀释曲线与韦恩图 Fig. 5 Rarefaction curves for the number of OTUs with more than 97% similarity threshold and Venn diagram of the number of OTUs in each group

在门和属水平上研究了不同功能分区中微生物的组成差异, 如图 6所示. 在对照区中, Proteobacteria（35.54%）是相对丰度最高的门, 其次是Acidobacteria（24.70%）、Actinobacteria（9.33%）、Bacteroidetes（8.88%）、Gemmatimonadetes（4.93%）、Chloroflexi（3.78%）、Verrucomicrobia（4.76%）和Firmicutes（2.38%）. 对照区中的优势微生物属包括Kaistobacter、Rhodoplanes、Nitrospira、Sphingomonas、Arthrobacter、Lysobacter、Steroidobacter、Thermomonas、Pseudomonas和Methylibium, 占整个群落的40.22%. Proteobacteria是采矿区和冶炼区中相对丰度最高的门, 采矿区中的相对丰度为54.52%, 冶炼区中的相对丰度为51.86%. Kaistobacter（17.88%）、Pseudomonas（7.19%）、Sphingomonas（5.41%）、Lysobacter（3.19%）和Rhodoplanes（2.54%）在采矿区中占主导地位, 冶炼区中相对丰度最高的属分别为Kaistobacter（19.52%）、Sphingomonas（6.94%）、Rhodoplanes（3.28%）、Lysobacter（2.60%）和Arthrobacter（1.46%）. 其中Kaistobacter提供了土壤中大部分的Proteobacteria. 尽管所有功能分区中的最主要门是一致的, 但代表性门的相对丰度发生了变化. 如图 7（a）所示, 对照区中Acidobacteria和Verrucomicrobia的相对丰度显著高于采矿区和冶炼区, Proteobacteria在采矿区和冶炼区显著富集（P < 0.05）. 如图 7（b）所示, Kaistobacter的相对丰度大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区, Nitrospira和Thermomonas的相对丰度大小为：对照区 > 采矿区 > 冶炼区, Rhodoplanes的相对丰度大小为：对照区 > 冶炼区 > 采矿区（P < 0.05）. 利用LEfSe分析进一步识别不同功能分区中的特征微生物, 如图 8所示. 在门水平, 对照区中的特征微生物为Acidobacteria、Verrucomicrobia、WS3和Nitrospirae, 采矿区中的特征微生物为Proteobacteria, 冶炼区中的特征微生物为TM7. 在属水平, 对照区中的特征微生物为Rhodoplanes、Nitrospira、Agromyces、OR_59、Candidatus_Xiphinematobacter、Crenarchaeota、Roseburia、Gemmatimonas和Clostridium, 采矿区中的特征微生物为Luteolibacter、Geobacter和Azoarcus, 冶炼区中的特征微生物为Thiobacillus、Perlucidibaca、Massilia和Burkholderia（P < 0.05）.

图 6

Fig. 6

（a）门水平微生物群落组成, （b）属水平微生物群落组成；a1.Proteobacteria, a2.Acidobacteria, a3.Actinobacteria, a4.Bacteroidetes, a5.Gemmatimonadetes, a6.Chloroflexi, a7.Verrucomicrobia, a8.Firmicutes, a9.Nitrospirae, a10.TM7；b1.Kaistobacter, b2.Sphingomonas, b3.Pseudomonas, b4.Lysobacter, b5.Rhodoplanes, b6.Dyella, b7.Ramlibacter, b8.Thiobacillus, b9.Methylibium, b10.Arthrobacter, b11.Steroidobacter, b12.Novosphingobium, b13.Flavobacterium, b14. Rubrivivax, b15.Perlucidibaca 图 6 不同功能分区微生物群落组成 Fig. 6 Microbial community composition in different functional areas

图 7

Fig. 7

a1.Acidobacteria, a2.Proteobacteria, a3.Verrucomicrobia, b1.Kaistobacter, b2.Nitrospira, b3.Rhodoplanes, b4.Thermomonas；不同小写字母表示物种在不同功能分区中存在显著差异（P < 0.05） 图 7 不同功能分区中的微生物群落组成差异 Fig. 7 Differences in microbial community composition in different functional areas

图 8

Fig. 8

a1.Nitrospirae, a2.BHI80_139, a3.WS3, a4.Verrucomicrobia, a5.Acidobacteria, a6.Proteobacteria, a7.TM7；b1.Clostridium, b2.Catellatospora, b3.Gemmatimonas, b4.Rahnella, b5.Candidatus_Xiphinematobacter, b6.Parachlamydia, b7.Psychrobacter, b8.Roseburia, b9.Candidatus_Solibacter, b10.Adhaeribacter, b11.OR_59, b12.Agromyces, b13.Nitrospira, b14.Rhodoplanes, b15.Azoarcus, b16.Geobacter, b17.Luteolibacter, b18.Burkholderia, b19.Massilia, b20.Perlucidibaca, b21.Thiobacillus；LDA得分表明了特征微生物的效应大小 图 8 LEfSe分析鉴定不同功能分区中的特征微生物 Fig. 8 Biomarkers identified by LEfSe analysis

不同功能分区中微生物群落的α多样性指数, 如图 9所示. 对照区Chao1指数（2 735.64 ± 223.36）高于采矿区（2 461.49 ± 378.42）和冶炼区（2 499.79 ± 389.84）. 对照区Observed指数（2 701.33 ± 210.52）高于采矿区（2 430.78 ± 371.96）和冶炼区（2 466.75 ± 379.90）. 进化多样性由PD指数表示, 对照区PD指数为161.88 ± 8.82, 采矿区PD指数为162.66 ± 19.22. 对照区Shannon指数（10.48 ± 0.31）普遍高于采矿区（10.11 ± 0.81）和冶炼区（10.16 ± 0.53）. 采用PLS-DA分析比较不同功能分区间微生物群落结构的β多样性, 结果如图 10所示. 对照区、采矿区和冶炼区的微生物群落相互分开, 功能分区之间的微生物群落结构具有差异. 用PERMANOVA法对不同功能分区间群落差异进行显著性检验, 结果如表 6所示. 对照区和采矿区、对照区和冶炼区的微生物群落差异均达到显著水平（P < 0.05）. 以上结果表明, Sb和As污染可能对微生物群落结构产生了影响.

图 9

Fig. 9

*表示P < 0.05, ns表示无显著差异 图 9 不同功能分区中微生物群落的丰富度和多样性 Fig. 9 Richness and diversity of the bacterial community in different functional areas

图 10

Fig. 10

每个点表示一个点位, 同种颜色表示点位分组相同；椭圆表示95%的置信区间；横坐标方向表示不同功能分区间微生物群落结构差异, 不同功能分区间微生物群落分开明显, 表明差异较大, 解释率为7%；纵坐标方向表示功能分区内各点位间微生物群落结构差异, 微生物群落分布在95%的置信区间内, 差异较小, 解释率为6% 图 10 不同功能分区微生物群落结构的差异性 Fig. 10 Difference of microbial community structure in different functional areas

表 6 (Table 6)

表 6 基于Bray Curtis距离进行的PERMANOVA分析 Table 6 PERMANOVA analysis based on Bray Curtis distance 功能分区 置换检验次数 P值 对照区vs.采矿区 999 0.013 对照区vs.冶炼区 999 0.003 采矿区vs.冶炼区 999 0.119

表 6 基于Bray Curtis距离进行的PERMANOVA分析 Table 6 PERMANOVA analysis based on Bray Curtis distance

如图 11所示, Spearman相关性热图显示了13个环境因子对微生物群落结构的影响. 在属水平上, pH、TK、EC、Eh、TP、SOM、TN、Sb、As、Sb（Bio）和As（Bio）与微生物群落的相关性最强. Methylibium、Rubrivivax、Luteolibacter、Leptothrix和Rhodoferax与pH呈显著正相关关系, Methylibium、Rubrivivax、Nitrospira和Flavisolibacter与TK呈显著正相关关系, Phenylobacterium、Dyella和TP呈显著正相关关系, Steroidobacter、Rhodoplanes、Devosia和Reyranella与SOM和TN呈正相关关系, Janthinobacterium、Perlucidibaca、Thiobacillus、Rhodoferax、Bacillus、Pedomicrobium和Novosphingobium受As以及As（Bio）的正面调控, Thiobacillus、Sphingomonas、Kaistobacter、Massilia、Phenylobacterium和Dyella受Sb以及Sb（Bio）的正面调控. Nitrospira、Rubrivivax、Methylibium和Luteolibacter受Sb以及Sb（Bio）的负面调控. 采用VPA分析解释各环境因子与微生物群落结构之间的关系. 根据各环境因子的属性, 将其划分为3组：一组为土壤理化性质X1, 一组为营养元素X2, 另一组为重金属X3. 如图 12显示, 土壤理化性质解释变差约12.15%, 营养元素解释变差约2.86%, 重金属解释变差约10.54%, 土壤理化性质和重金属在微生物群落结构变化中起重要作用. 用RF分析进一步预测各环境因子在不同功能分区中对微生物群落结构变化的贡献率. 如图 13所示, 在对照区中pH等土壤理化性质对微生物群落结构变化的贡献率最高, 采矿区中As和As（Bio）贡献率最高, 冶炼区中Sb和Sb（Bio）贡献率最高. VPA和RF分析结果基本一致, Sb、As、Sb（Bio）和As（Bio）是影响锑矿不同功能分区中微生物群落结构的主要因子. 用RDA进一步探究了Sb、As、Sb（Bio）和As（Bio）对微生物群落结构变化的贡献率. 如图 14所示, RDA1和RDA2轴分别解释了属水平微生物群落总变异的52.83%和28.19%, 对属水平微生物群落结构的影响大小为：As（Bio） > Sb（Bio） > Sb > As. Thiobacillus、Phenylobacterium、Kaistobacter、Sphingomonas、Steroidobacter、Dyella和Flavobacterium与Sb及Sb（Bio）呈正相关关系, Flavobacterium、Dyella和Thiobacillus与As（Bio）呈正相关关系. Nitrospira、Rubrivivax、Methylibium和Leptothrix与Sb（Bio）、As（Bio）、Sb及As呈负相关关系.

图 11

Fig. 11

1.WAF, 2. pH, 3.TK, 4.EC, 5.Eh, 6.TP, 7.SOM, 8.CEC, 9.TN, 10.As, 11. As（Bio）, 12.Sb, 13. Sb（Bio）；b1. Steroidobacter, b2. Rhodoplanes, b3. Thermomonas, b4. Devosia, b5. Variovorax, b6. Reyranella, b7. Lysobacter, b8. Afifella, b9. Opitutus, b10. Flavobacterium, b11. Flavisolibacter, b12. Ramlibacter, b13. Janthinobacterium, b14. Perlucidibaca, b15. Thiobacillus, b16. Sphingomonas, b17. Sphingobium, b18. Kaistobacter, b19. Massilia, b20. Phenylobacterium, b21. Dyella, b22. Leptothrix, b23. Luteolibacter, b24. Rubrivivax, b25. Methylibium, b26. Nitrospira, b27. Bacillus, b28. Pedomicrobium, b29. Novosphingobium, b30. Rhodoferax；*表示相关性强（P < 0.05）, **表示相关性很强（P < 0.01）, ***表示相关性极强（P < 0.001）；红色表示正相关, 蓝色表示负相关, 颜色越深表示相关性越强 图 11 环境因子对微生物群落影响的Spearman相关性分析 Fig. 11 Spearman correlation analysis of environmental factor effects on microbial communities

图 12

Fig. 12

X1：土壤理化性质（pH、WAF、Eh、EC、CEC和SOM）, X2：营养元素（TN、TP和TK）, X3：重金属[Sb、As、Sb（Bio）和As（Bio）] 图 12 土壤理化性质、营养元素和重金属对微生物群落影响的方差分解分析 Fig. 12 Variance partitioning analysis of effects of soil physicochemical properties, nutrient elements, and heavy metals on microbial communities

图 13

Fig. 13

右侧不同色块为各环境因子在不同功能分区中的贡献率热图 图 13 环境因子对微生物群落结构变化的贡献率 Fig. 13 Contribution rates of environmental factors to microbial community variation

图 14

Fig. 14

红色与黑色圆点的大小表示微生物相对丰度的高低；黑色圆点表示相对丰度较低的微生物（不显示属名） 图 14 Sb和As及其有效态对微生物群落影响的RDA分析 Fig. 14 RDA analysis of the effects of Sb and As and their bioavailable concentrations on microbial communities

Sb污染程度的大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区, 冶炼区中为严重污染, 采矿区中为中度至重度污染；As污染程度的大小为：采矿区 > 冶炼区 > 对照区, 在采矿区和冶炼区中均为中度至重度污染. 这与矿物成分、矿物提取、加工和堆存方式密切相关. 矿山开采过程中, Sb和As会随着井下凿岩和爆破所产生的污风经通风系统由大气扩散沉降至土壤中, 或通过坑道废水进入地下水或地表水环境. 选矿时加入大量的捕收剂、抑制剂和萃取剂来提高矿石回收率, 以上药剂可与Sb、As、Cu、Zn、Hg、Pb、Mn和Cd等有害重金属络合形成复合污染^{[26, 27]}. 历史遗留锑矿废石主要分布在山谷和竹子沟附近, 与周边土壤无隔离措施, 河水搬运等自然因素也可能是造成采矿区土壤污染的重要来源. 该冶炼厂将硫化锑矿石或锑精矿经挥发焙烧或挥发熔炼产出Sb₂O₃, 再进入反射炉进行还原熔炼和精炼, 最终产出精锑. 冶炼废气中通常含有Sb、Zn、Cu、Pb、Hg和As等多种重金属及其氧化物的烟粉尘, 废水主要包括锑锭冷却水、冲洗废水、初期雨水等酸性废水和重金属废水, 固废主要包括炉渣、还原泡渣、烟气脱硫石膏渣、砷碱渣和污水处理渣等. 冶炼废气、废水和固废堆存可能是造成冶炼区Sb污染的主要成因.

Sb和As的化学形态分布占比大小为：F3 > F4 > F5 > F2 > F1, 主要以无定型铁铝氧化物结合态（F3）赋存, 这与Javed等^[28]的研究结果一致. ω[Sb（Bio）]大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区, ω[As（Bio）]大小为：采矿区 > 冶炼区 > 对照区, 采矿和冶炼等矿业活动改变了Sb和As在环境介质赋存的化学形态. Sb主要以无定型铁铝氧化物结合态（F3）赋存, 含量为48.37%；As主要以无定型铁铝氧化物结合态（F3）赋存, 含量为39.77%, 这可能与铁铝氧化物能够强烈吸附重金属有关. 无定型铁铝氧化物结合态迁移能力以及生物有效性较低, 但当土壤的氧化还原条件改变时, 土壤中的Fe（Ⅲ）可被还原为Fe（Ⅱ）, 与之结合的重金属也会随之进入土壤溶液, 因此该组分Sb和As可能也具有一定的生物有效性和迁移能力^{[29, 30]}. 潜在生态风险指数法中没有考察铁铝结合态, 因此Sb和As的潜在生态风险可能比目前评估的更高. 与有机物、硅酸盐或其他矿物（如硫化物）结合的残渣态通常只能由风化作用迁移, 生物有效性及迁移能力弱, 但残渣态Sb和As含量较低, 为17.88%和19.05%.

从微生物群落结构来看, 优势菌门通常包括Acidobacteria、Actinobacteria、Gemmatimonadetes、Bacteroidetes、Chloroflexi、Verrucomicrobia、Firmicutes和Proteobacteria. 这与其他矿区重金属污染土壤调查中的优势菌门的组成高度相似, 这些物种可以通过各种特殊机制减轻重金属的毒性作用^[31]. 门水平线性判别分析效应分析（LEfSe）表明：Proteobacteria和TM7在采矿区和冶炼区显著富集（P < 0.05）. 现有研究表明, Proteobacteria菌的金属耐受性是通过相应的转运载体、泵和离子通道输出, 或通过氧化还原反应还原重金属来实现的. 此外, Proteobacteria菌还能通过DNA重组修复DNA损伤^[7]. Sheik等^[32]研究发现在该门下有大量的耐As细菌. 在长期的选择压力下, Cyanobacteria、TM7和NC10等土壤细菌进化出了对重金属的耐受性, 并对Sb表现出积极的响应^[33]. Kaistobacter、Pseudomonas、Sphingomonas、Lysobacter和Rhodoplanes是采矿区和冶炼区中相对丰度最高的属. Pseudomonas还可以通过生物积累来抵抗重金属. Pseudomonas产生的生物表面活性剂被称为鼠李糖脂, 可以与As、Zn、Pb和Cd形成络合物. Pseudomonas的成员通过生产生物膜EPS吸附重金属, 经历一个能量独立和非代谢的过程, 多糖、蛋白质和核酸可以作为保护层限制重金属扩散进入生物膜. 同时, 金属硫蛋白通过保护细菌代谢过程, 也固定了有毒重金属^[34]. Sphingomonas以其还原As（Ⅴ）和氧化As（Ⅲ）的能力而闻名. Shi等^[35]从不同的采矿土壤中分离出能够氧化Sb（Ⅲ）的Sphingomonas和Sphingopyxis都属于Sphingomonadaceae. 在斯洛伐克一处富含Sb和As的矿山排水尾矿中检测到与Sphingomonas密切相关的16S rRNA基因的相对丰度较高^[36]. Lysobacter属于Proteobacteria门, Lysobacter中含有一种耐As溶菌（Lysobacter arseniciresistens）, 具有亚砷酸盐[As（Ⅲ）]抗性^[37]. Kaistobacter、Rhodoplanes和Sb的化学形态具有相关性, 尤其是Kaistobacter与有效态锑形成呈正相关, 揭示了在Sb循环中的潜在作用^[33]. 采矿区中的特征微生物Luteolibacter、Geobacter和Azoarcus, 冶炼区中的特征微生物为Thiobacillus、Perlucidibaca、Massilia和Burkholderia. Thiobacillus属于Proteobacteria, 是一种嗜酸性自养生物, 以CO₂为碳源, 参与重金属S化物的氧化, 可以从Fe（Ⅱ）和S化合物的氧化中获得生长所需的能量^[38]. Thiobacillus在采矿区和冶炼区中的相对丰度较高, 并且与大多数污染物组分具有显著的正相关性, 这表明Thiobacillus可能介导Sb和As的氧化还原反应^[39], 且S区可能有较高的硫酸盐和硫化物为Thiobacillus提供了电子供体或受体^[33]. 其他相关研究表明, Thiobacillus通过氧化FeSC550表面的Fe1-xS, 以及黑麦草根系分泌的小分子有机酸, 提高了其对土壤中Pb的吸收^[40]. 综合考虑自养、硫铁氧化、抗Pb等重金属的特性, Thiobacillus相关细菌可以在高Sb环境下生存. Azoarcus对Sb和As非常敏感, 固氮菌固氮潜能随Sb和As含量升高而降低, Sb（Ⅲ）对Azoarcus的固氮潜能具有的抑制效果更为显著^[41]. Burkholderia菌属微生物属于伯克霍尔德菌科（Burkholderiaceae）, Li等^[42]在该菌科中发现了aioA、arrA、arsC、arsM等As转化功能基因. 对照区微生物群落α多样性指数高于采矿区和冶炼区, 这可能是由于过量Sb和As会对微生物降解和细胞代谢等功能产生严重影响, 从而迫使微生物多样性下降. 以上发现揭示了Sb和As对微生物多样性和相对丰度的毒性压力, 但同时微生物在不利环境中形成了多种抗性生存策略, 使其能够快速适应并在Sb和As污染环境中存活.

土壤环境因子对不同功能分区中的微生物群落结构有重要影响^{[43, 44]}. VPA与RF结果基本一致, 土壤理化性质与重金属可能共同驱动微生物群落结构的变化, 且Sb、As、Sb（Bio）和As（Bio）可能是影响锑矿区土壤微生物群落的主要因子. 进一步的RDA分析表明, 对属水平微生物群落结构的影响大小为：As（Bio） > Sb（Bio） > Sb > As. Sb（Bio）和As（Bio）主要吸附在土壤颗粒表面, 可通过离子交换进入土壤溶液中, 生物有效性和迁移能力较强. 微生物与重金属存在着协同或拮抗效应, 不同物种对重金属胁迫的响应可能存在多样化响应策略^{[45, 46]}. Spearman相关性与RDA分析表明, Nitrospirae与Sb和Sb（Bio）呈现出显著的负相关关系, Thiobacillus与Sb和Sb（Bio）呈正相关关系. 属水平LEfSe分析结果表明, Thiobacillus能够在高Sb环境下生存. 以上结果显示Nitrospirae和Thiobacillus可能适合作为生物指标诊断锑矿区中Sb的污染程度. 因此, 筛选出对Sb敏感的微生物类群Nitrospira和Thiobacillus, 建立了反映Sb污染状况与生物指标模型. 如图 15所示, Nitrospira的相对丰度和Sb污染状况I_geo（Sb）指标之间良好的拟合关系证明了该指标的适用性（R²=0.521 4, P < 0.05）. Thiobacillus的相对丰度和Sb污染状况I_geo（Sb）之间具有较好的拟合关系（R²= 0.15, P > 0.05）. 以上诊断Sb污染的生物指标, 将为锑矿区生态修复和生态环境管理提供重要参考.

图 15

Fig. 15

（a）Nitrospira的相对丰度与Igeo（Sb）的线性回归模型, （b）Thiobacillus的相对丰度与Igeo（Sb）的线性回归模型；阴影区域表示95%的置信区间 图 15 基于微生物类群的指标与地累积指数（Igeo）的线性回归模型 Fig. 15 Linear regression models between each bioindicator and geo-accumulation indexes(Igeo)

（1）ω（Sb）大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区, ω（As）大小为：采矿区 > 冶炼区 > 对照区；Sb和As的化学形态占比大小为：F3 > F4 > F5 > F2 > F1；ω[Sb（Bio）]大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区；ω[As（Bio）]大小为：采矿区 > 冶炼区 > 对照区, 采矿和冶炼等矿业活动改变了Sb和As赋存的化学形态. Sb污染程度大小为：冶炼区 > 采矿区 > 对照区, 采矿区为中度至重度, 冶炼区为严重污染；As污染程度大小为：采矿区 > 冶炼区 > 对照区, 采矿区与冶炼区均为中度至重度污染.

（2）Proteobacteria在采矿区和冶炼区显著富集. Kaistobacter、Pseudomonas和Sphingomonas是采矿区和冶炼区中相对丰度最高的属. 采矿区中的特征微生物为Luteolibacter、Geobacter和Azoarcus, 冶炼区中的特征微生物为Thiobacillus、Perlucidibaca、Massilia和Burkholderia. Thiobacillus在Sb污染地区具有较高的LDA得分, 可能对Sb含量的升高具有耐受性.

（3）Sb、As、Sb（Bio）和As（Bio）是影响锑矿不同功能分区中微生物群落结构的主要因子, 对属水平微生物群落结构的影响大小为：As（Bio） > Sb（Bio） > Sb > As. Nitrospira与Sb及Sb（Bio）呈现显著负相关关系, Thiobacillus与Sb及Sb（Bio）呈现显著正相关关系；Nitrospira的相对丰度与I_geo（Sb）指标之间具有良好的拟合关系.