2024, Vol. 45
2. 国检测试控股集团京诚检测有限公司, 广州 511400;
3. 南开大学环境科学与工程学院, 天津 300350
2. China Testing Holding Group Jingcheng Testing Co., Ltd., Guangzhou 511400, China;
3. College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300350, China
塑料作为一种高分子聚合物, 因其化学性稳定、加工成本低和多功能性被应用于多个领域[1 ~ 3]. 农业领域也不例外, 塑料制品被广泛应用于农业实践中, 其中覆盖膜的使用尤为突出[4]. 我国每年农业塑料膜的使用量超过200多万t, 约占全球总量的90%, 回收率却不到2/3[5]. 未被回收的塑料膜在气候变化、紫外辐射、耕作机械力和生物作用下, 分裂成微塑料（粒径小于5 mm的塑料颗粒或碎片, MPs）[6 ~ 8]. 低密度聚乙烯（low-density polyethylene, LDPE）是覆盖膜中最常用的材料[9, 10], 能在土壤环境中长期稳定存在[11]. Cai等[12]对我国农田土壤中微塑料丰度研究发现覆盖农田的微塑料丰度为非覆盖农田的3.3倍. Huang等[13]发现在新疆连续使用地膜5、15和24 a的农田土壤中分别检测出微塑料丰度为80.3、308.0和1 075.6个·kg-1. 在高度污染的工业区土壤中, 检出微塑料的面积比例可达6.7%[14].
环境中多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）的危害已受到广泛关注[15], 而由含氧多环芳烃（oxygen-containing PAHs, OPAHs）所带来环境效应和生态风险也不容忽视[16]. OPAHs是PAHs分子中氢原子被一个或多个羰基、羟基和羧基等官能团取代的化合物[17, 18]. 它一方面与PAHs同源产生, 来自化石燃料和生物质的不完全燃烧和热解, 另一方面由PAHs经化学氧化、光化学反应和微生物代谢等方式转化而成[19, 20]. OPAHs含有氧原子, 与仅含有碳原子和氢原子的PAHs相比更具极性、水溶性和迁移性, 部分还具备更大的毒性[21, 22]. 目前, OPAHs在大气、水体和土壤等环境介质均有检出. 土壤是OPAHs的主要汇. 不同地区及利用类型的土壤中ω（OPAHs）差异较大, 在0.001 ~ 243.71 mg·kg-1不等[17]. 秸秆就地焚烧和污水灌溉等人类活动可能会引发农业土壤PAHs污染, 同时导致土壤中OPAHs的积累. Chen等[23]检测了广州64个区农业土壤中OPAHs, 在汛期ω（OPAHs）平均值为26.8 ~ 214.6 μg·kg-1, 在旱季时为21.9 ~ 96.7 μg·kg-1, 且9-芴酮和9, 10-蒽醌是最主要的OPAHs.
自然衰减是利用环境中自然发生的物理、化学及生物过程, 使污染物的含量、毒性、移动性降低到风险可接受水平[24, 25]. 在各类自然衰减作用中, 单纯非生物自然衰减过程并不常见, 多伴有生物自然衰减过程. 因此, 微生物菌群分析可以明确污染场地中自然衰减的过程与微生物降解目标污染物的能力. OPAHs污染土壤中, OPAHs的自然衰减与土壤微生物群落密切相关. 有研究表明微塑料会直接或者间接地改变土壤微生物生物量、群落结构与多样性[26 ~ 28]. 微塑料进入OPAHs污染土壤中是否会影响土壤微生物群落, 进而干预OPAHs自然衰减, 尚未可知. 本课题组前期研究了微塑料对土壤中PAHs自然衰减及细菌群落的影响, 发现LDPE可通过增加PAHs降解基因及提高PAHs生物可利用性促进土壤中PAHs的自然衰减[29]. PAHs污染土壤中一般同时存在OPAHs. 微塑料对PAHs自然衰减的影响规律是否适用于OPAHs, 有待明确. 鉴于此, 本文研究了微塑料对OPAHs自然衰减的影响以及该过程中土壤微生物的响应. 本研究有助于揭示农业土壤中微塑料和OPAHs污染的潜在微生物生态效应, 旨在为农业土壤微塑料-OPAHs复合污染的生态风险评估和治理修复提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 实验材料土壤采自山东省济南市（北纬36°42′29″, 东经117°04′40″）, 土地利用现状为耕地, 土壤质地为壤土. 其理化性质为：pH 8.25, ω（有机质）52.1 g·kg-1, 阳离子交换量0.226 mol·kg-1, ω（总氮）、ω（总磷）和ω（总钾）分别为2.28、0.96和13 g·kg-1[30, 31]. 土壤在实验室自然阴干, 去除粗大的颗粒、残根和凋落物等, 过2 mm筛, 混匀, 备用.
OPAHs为9, 10-蒽醌（anthraquinone, 9, 10-ANQ）和9-芴酮（9-fluorenone, 9-FLO）, 均购自中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 纯度分别为98%和99%.
微塑料材质为低密度聚乙烯（low-density polyethylene, LDPE, 美国陶氏化学, 132I）. 根据Zhang等[32]对农田、果园、草地和林地中微塑料调查结果, 75.7%的微塑料粒径小于1 mm. 本研究取粒径范围为0.3 ~ 0.8 mm的微塑料用于实验.
1.2 实验设计将适量的OPAHs-丙酮储备液（9, 10-ANQ和9-FLO的质量比为1∶1）加入土壤中, 使土壤中ω（OPAHs）达到40 mg·kg-1, 该含量参考了实际污染土壤及相关研究中的OPAHs水平[17, 30]. 然后将土壤置于通风橱中2 d, 每隔4 h搅拌1次, 挥去丙酮. 最后, 向土壤中添加无菌水搅拌均匀使土壤绝对含水率达到20%. 具体分组处理如下：①CK：OPAHs污染土壤, 不添加LDPE；②LDPE1：向OPAHs污染土壤中添加质量分数1%的LDPE微塑料；③LDPE0.01：向OPAHs污染土壤中添加质量分数0.01%的LDPE微塑料. 1%和0.01%的LDPE添加量分别代表了农田土壤中高水平和低水平的微塑料污染[33, 34]. 共3个处理组, 各处理组均设置9个平行样, 共计27个样品. 将所有样品放入恒温（25℃）培养箱中培养, 每隔5 d称重补水保持土壤含水率稳定. 分别在0、14和28 d取各处理组的3个平行样检测OPAHs含量, 并测定第28 d时的微生物指标.
1.3 土壤中OPAHs的提取、测定和数据分析土壤中OPAHs的提取和测定参考本课题组前期构建的方法[30]. 具体为：将土样置于冷冻干燥机中冻干, 称取2 g土样装入22 mL棕色螺纹口玻璃瓶中, 向瓶中移入10 mL二氯甲烷和甲醇（1∶1, 体积比）的混合萃取剂, 盖盖涡旋混匀. 采用超声萃取法萃取10 min（功率500 W, 频率40 kHz, 25℃）, 3 000 r·min-1下离心5 min, 将上清液转移至50 mL鸡心瓶中. 重复上述步骤3次, 合并萃取液, 在旋转蒸发仪蒸发至近干, 然后加4 mL甲醇定容, 超声促溶, 过0.45 μm有机滤膜至自动进样瓶中, 通过高效液相色谱仪（安捷伦1260）测定. 检测条件：色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）, 柱温25℃, 流动相为甲醇和水（9∶1, 体积比）, 流速1 mL·min-1, 进样量2 μL, 采用二极管阵列检测器（diode array detector, DAD）, 9, 10-ANQ和9-FLO的检测波长分别为252 nm和258 nm, 采集时长7 min.
以OPAHs含量（2种OPAHs含量加和）作为OPAHs在土壤中自然衰减过程的评价指标, 各处理组中OPAHs含量以3个平行的平均值来表示. 用SPSS Statistics 25软件进行单因素方差分析, 比较微塑料处理组与CK组之间的差异.
1.4 土壤DNA提取、16S rDNA扩增子高通量测序及数据处理分析取2 g土样装入离心管中送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行土壤16S rDNA扩增子高通量测序. 采用十六烷基三甲基溴化铵法从土壤样本提取基因组DNA, 利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度. 取适量样本DNA于离心管中, 使用无菌水稀释样本至1 ng·μL-1, 以稀释后的基因组DNA为模板, 对16S rDNA的V3-V4区进行PCR扩增, 引物为341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）. PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测, 对检测合格的PCR产物进行纯化, 再对目的条带进行回收和文库构建. 文库合格后, 使用NovaSeq 6000进行上机测序. 对测序获得的原始数据进行拼接和过滤, 最终得到有效数据, 随后进行进一步分析.
基于有效数据通过DADA2算法（divisive amplicon denoising algorithm 2, DADA2）降噪获得去重序列（amplicon sequence variants, ASVs）[35]. 对ASVs进行丰度分析和物种注释, 得到样本的物种组成信息；基于ASVs进行α多样性计算, 得到样本的物种丰富度和均匀度信息. 基于加权UniFrac距离进行无度量多维标定法（non-metric multi-dimensional scaling, NMDS）降维分析及相似性分析（analysis of similarities, ANOSIM）, 探究不同组别间群落结构的差异[36]. 为进一步挖掘组间群落结构差异, 使用相似性百分比（similarity percentage, SIMPER）分析法, 对组间Bray-Curtis差异指数进行分解, 量化共有物种对组间差异的贡献率[37]；使用线性判别分析法（linear discriminant analysis effect size, LEfSe）寻找组间丰度具有显著差异的物种[38]. 将扩增子的注释结果与相应的功能数据库相关联, 用PICRUSt2软件（PICRUSt2 2.3.0）对样本中的微生物群落进行功能预测分析[39]. PICRUSt2是基于标记基因测序谱预测细菌群落功能潜力的工具, 与PICRUSt1相比, PICRUSt2包含了一个更新、更大的基因家族和参考基因组数据库, 功能预测的信息更加全面[40]. 基于京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）数据库进行细菌功能注释, 得到KEGG直系同源基因（KEGG orthologs, KOs）和酶的绝对丰度信息. 采用基于Bray-Curtis距离的主成分分析（principal component analysis, PCA）探究各组间功能基因组成的差异.
2 结果与分析 2.1 土壤中OPAHs的自然衰减比较了不同时间点上各处理组土壤中OPAHs含量, 结果如图 1所示. 0 ~ 14 d, CK组中ω（OPAHs）由34.6 mg·kg-1降至10.5 mg·kg-1, 到28 d时, CK组中ω（OPAHs）降至5.37 mg·kg-1. ω（OPAHs）在0 ~ 14 d自然衰减了24.1 mg·kg-1, 14 ~ 28 d自然衰减了5.13 mg·kg-1. 土壤中OPAHs污染初期自然衰减较快, 随时间推移速率减慢. 第14 d时, 两种LDPE处理组土壤中ω（OPAHs）分别为12.1 mg·kg-1（LDPE1）和11.4 mg·kg-1（LDPE0.01）, 分别高出CK组1.6 mg·kg-1和0.9 mg·kg-1, 表现出对OPAHs自然衰减的抑制效应, 且LDPE添加剂量越高, 抑制作用越显著. 第28 d时, CK组、LDPE1组和LDPE0.01组中ω（OPAHs）分别为5.37、5.40和5.22 mg·kg-1, 3组间OPAHs含量无显著差异, 表明两种添加剂量的LDPE对OPAHs自然衰减均无显著影响. 这说明土壤中OPAHs自然衰减初期LDPE表现出抑制效应, 且抑制程度因LDPE添加量而异；随着自然衰减的持续进行, LDPE抑制效应减弱, 直至消失.
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0 d时土壤中ω（OPAHs）为34.6 mg·kg-1；不同小写字母表示同一时间点处理组间差异显著（P < 0.05） 图 1 各处理组土壤中OPAHs含量 Fig. 1 Content of OPAHs in soil in all treatments |
对3组土壤样本的ASV进行比较, 结果如图 2所示. CK组、LDPE1组和LDPE0.01组中ASV数量分别为：4 213、3 580和3 730, 添加LDPE使得土壤中的细菌种类数目减少, 且LDPE添加量越大, 细菌种类减少越多. 3组共有ASV数为1 272, 占各组总ASV的30.2%（CK）、35.5%（LDPE1）和34.1%（LDPE0.01）. 各组独有ASV数分别为2 195（CK）、1 633（LDPE1）和1 783（LDPE0.01）, 占各组总ASV的52.1%（CK）、45.6%（LDPE1）和50.2%（LDPE0.01）. 说明各处理组独有ASV较共有ASV的数量更多, CK组较两个LDPE处理组有更多的独有细菌种类.
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图 2 各处理组中细菌群落ASV数量韦恩图 Fig. 2 Venn diagram of ASVs of bacterial community in all treatments |
对每个ASV进行物种注释, 基于注释结果得到各分类水平上的物种丰度. 各处理组门水平上相对丰度前10的物种组成如图 3（a）所示. 各组共同优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、蓝菌门（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌门（Nitrospirota）和粘球菌门（Myxococcota）, 以上菌门合计相对丰度分别占各组总体的94.3%（CK）、95.3%（LDPE1）和94.5%（LDPE0.01）. 其中, 变形菌门在各组中的相对丰度最高, 为35.9%（CK）、39.2%（LDPE1）和40.2%（LDPE0.01）；放线菌门次之, CK组中的相对丰度为17.1%, LDPE处理使其增加了0% ~ 2.4%. 与CK组相比, LDPE1组中变形菌门、放线菌门和硝化螺旋菌门相对丰度增加, 厚壁菌门、拟杆菌门、绿弯菌门和蓝菌门相对丰度减少；LDPE0.01组中变形菌门和蓝菌门相对丰度增加, 厚壁菌门、绿弯菌门和粘球菌门相对丰度均减少. 其中变形菌门、厚壁菌门和绿弯菌门经LDPE1和LDPE0.01处理后丰度变化趋势相同, 变形菌门相对丰度均增加, 厚壁菌门和绿弯菌门相对丰度均减少；其余优势菌门在不同剂量LDPE处理后变化趋势不同. 三元相图[图 3（b）]可直观反映各处理组中丰度占优的物种. 如图 3（b）所示, 厚壁菌门距离CK顶点较LDPE1和LDPE0.01更近, 表明厚壁菌门在CK组中的相对丰度较另外两组更大. 硝化螺旋菌门和蓝菌门分别距离LDPE1和LDPE0.01顶点更近, 说明在这两个菌门分别在LDPE1组和LDPE0.01组中相对丰度更大.
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（a）门水平相对丰度前10物种, （b）门水平三元相图, （c）属水平相对丰度前10物种, （d）属水平三元相图；（c）和（d）中不同颜色表示不同物种, 圆点大小和相对丰度成正比, 圆点离某个顶点越接近, 表示此物种在这个组中丰度越高；各处理组中丰度占优的物种均在三角区域中用红色圆圈标出并标注名称 图 3 各处理组门水平相对丰度前10物种和三元相图及属水平相对丰度前10物种和三元相图 Fig. 3 Relative abundances of top ten taxa and ternary plot at the phylum level and relative abundances of top ten taxa and ternary plot at the genus level in all treatments |
各处理组属水平上相对丰度前10的物种组成如图 3（c）所示. 各组共同优势物种有鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、小单孢菌属（Micromonospora）、Cyanobium_PCC-6307、硝化螺旋菌属（Nitrospira）、MND1、链霉菌属（Streptomyces）、溶杆菌属（Lysobacter）、沙壤土杆菌属（Ramlibacter）、微枝形杆菌属（Microvirga）. 与CK组相比, LDPE1组中小单孢菌属、硝化螺旋菌属、鞘氨醇单胞菌属和MND1相对丰度增加, 芽孢杆菌属相对丰度减少；LDPE0.01组中鞘氨醇单胞菌属、小单孢菌属和蓝细菌属的相对丰度有所增加, 芽孢杆菌属减少. 其中小单孢菌属和芽孢杆菌属在LDPE1组和LDPE0.01组中具有相同变化趋势, 两种不同剂量LDPE处理后小单孢菌属相对丰度均增加, 芽孢杆菌属相对丰度均减少. 各处理组属水平优势物种三元相图如图 3（d）所示. 芽孢杆菌属距离CK顶点较LDPE1和LDPE0.01更近, 表明芽孢杆菌属在CK组中的相对丰度较另外两组更大. 硝化螺旋菌属和小单孢菌属距离LDPE1顶点更近, 说明这两个菌属在LDPE1组中相对丰度更大. Cyanobium_PCC-6307和鞘氨醇单胞菌属距离LDPE0.01顶点更近, 说明这两个菌属在LDPE0.01组中相对丰度更大.
2.2.2 细菌群落α多样性比较了各处理组细菌群落α多样性指数, 结果见表 1. 3组样本中Goods coverage指数均在99%以上, 说明样本测序深度足够, 能准确反映细菌群落的真实信息. 与CK组相比, LDPE1组和LDPE0.01组中观测到的物种数目Observed features指数均有所下降, 分别降低了236和173, 表明LDPE处理使OPAHs土壤中物种数量减少, 且高剂量的LDPE1组中物种数量减少得更多. Chao1指数也可估计群落样本中包含的物种总数, 经LDPE处理后LDPE1组和LDPE0.01组中Chao1指数分别下降了270和189, 说明添加LDPE使OPAHs土壤中物种数量减少. 3组的Pielou_e指数均在0.85以上, 说明各处理组中物种分布均匀度较高；但LDPE1组和LDPE0.01组间均匀度依然存在显著差异, 说明添加低剂量的LDPE显著影响了部分物种的丰度. Shannon和Simpson指数在CK组、LDPE1组和LDPE0.01组这3组间差异较小, 表明LDPE对群落内物种多样性影响较小.
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表 1 各处理组中细菌群落的α多样性指数1） Table 1 The α diversity metrics of the bacterial community in all treatments |
2.2.3 细菌群落β多样性
比较了各处理组细菌群落β多样性, 基于加权UniFrac距离的NMDS结果见图 4. Stress = 0.1 < 0.2, 说明NMDS结果可以准确反映样本间的差异程度. CK组样本点与两个LDPE组样本点均成簇分开, 表明LDPE影响了OPAHs污染土壤中的细菌群落结构. 使用ANOSIM法进行NMDS结果的组间差异性检验, CK组与LDPE1组及LDPE0.01组的R值分别为0.185和0.222, 均大于0, 说明组间差异大于组内差异；P值分别为：0.318和0.129, 均大于0.05, 说明LDPE虽然影响了细菌群落结构, 但影响程度未达统计学意义上的显著水平. LDPE1组和LDPE0.01组样本点区域有重叠, 说明这两组之间的细菌群落结果存在一定程度的相似性.
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图 4 基于加权UniFrac距离的NMDS分析 Fig. 4 NMDS analysis based on weighted UniFrac distance |
3个处理组细菌群落结构存在差异, 探究其差异的原因, 首先关注共有物种对群落结构差异的贡献. Bray-Curtis差异指数常用于比较两个群落微生物的组成差异, 利用SIMPER分析, 对不同群落之间的Bray-Curtis差异指数进行分解, 量化共有物种对组间差异的贡献率. 对3个处理组分别进行属水平上的两两比较, 得到了对两组间差异贡献率排名前10的物种及丰度, 如图 5所示. CK组和LDPE1组之间差异贡献率最大的是芽孢杆菌属（Bacillus）[图 5（a）], CK组和LDPE0.01组之间差异贡献率最大是鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）[图 5（b）], LDPE1组和LDPE0.01组之间亦为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）[图 5（c）]. 以上菌属对群落间差异影响最大, 但其相对丰度并不是最大, 相对丰度大的物种对组间差异贡献率不一定大.
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（a）CK与LDPE1（A1.Bacillus, A2.Micromonospora, A3.others, A4.Nitrospira, A5.Sphingomonas, A6.Pedosphaeraceae, A7.Flavisolibacter, A8.MND1, A9.Streptomyces, A10.Pontibacter；a1.CK1, a2.CK2, a3.CK3, a4.LDPE1.1, a5.LDPE1.2, a6.LDPE1.3）, （b）CK与LDPE0.01（B1.Sphingomonas, B2.Bacillus, B3.Cyanobium_PCC-6307, B4.Micromonospora, B5.others, B6.Butyricicoccus, B7.Skermanella, B8.Pedosphaeraceae, B9.Nitrospira, B10.MND1；b1.CK1, b2.CK2, b3.CK3, b4.LDPE0.01.1, b5.LDPE0.01.2, b6.LDPE0.01.3）, （c）LDPE0.01与LDPE1（C1.Sphingomonas, C2.Nitrospira, C3.Cyanobium_PCC-6307, C4.others, C5.Micromonospora, C6.Bacillus, C7.Streptomyces, C8.Butyricicoccus, C9.MND1, C10.Lysobacter；c1.LDPE0.01.1, c2.LDPE0.01.2, c3.LDPE0.01.3, c4.LDPE1.1, c5.LDPE1.2, c6.LDPE1.3）；圆点大小对应该物种相对丰度大小；柱状图为物种在组间差异中的贡献率 图 5 组间差异贡献率排名前10的菌属 Fig. 5 Top ten genera with the highest contribution to the differences |
除关注共有物种对组间差异贡献率以外, 还关注了各处理组间丰度差异显著的物种. 采用LEfSe分析分别对3个处理组同时比较[图 6（a）, LDA阈值= 2]和3个处理组进行两两比较[图6（b） ~ 6（d）, LDA阈值= 3]. 3个处理组同时比较, 结果如图 6（a）所示. 微消化菌目（Micropepsales）、微消化菌科（Micropepsaceae）、薄层杆菌科（Hymenobacteraceae）、细枝菌科（Ktedonobacteraceae）、念珠藻科（Nostocaceae）和亨氏梭菌科（Hungateiclostridiaceae）在CK组中显著富集. 莱朗杆菌目（Reyranellales）、o_Ga0077536、莱朗杆菌科（Reyranellaceae）、Leeiaceae和f_Ga0077536在LDPE1组中具有丰度优势. 气单胞菌科（Aeromonadaceae）为LDPE0.01组中富集的菌科.
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（a）CK-LDPE1-LDPE0.01, （b）CK-LDPE1, （c）CK-LDPE0.01, （d）LDPE1-LDPE0.01；（a）, LDA阈值= 2；（b）~（d）, LDA阈值= 3 图 6 组间线性判别的效应量分析（LEfSe） Fig. 6 Linear discriminant analysis coupled with effect size (LEfSe) analysis |
两个LDPE组分别与CK组比较, 产生了1个（LDPE1）和15（LDPE0.01）个丰度显著增加的物种, 结果如图6（b）和6（c）所示. LDPE1处理使得小单孢菌属（Micromonospora）显著富集. LDPE0.01处理使变形菌门（Proteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、鞘氨醇单胞菌目（Sphingomonadales）、小单孢菌目（Micromonosporales）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae）、气单胞菌科（Aeromonadaceae）、鞘氨醇单胞菌科（Sphingomonadaceae）、小单孢菌科（Micromonosporaceae）、丁酸球菌科（Butyricicoccaceae）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、小单孢菌属（Micromonospora）、丁酸球菌属（Butyricicoccus）、气单胞菌属（Aeromonas）、交替红色杆菌属（Altererythrobacter）和荷兰硝酸盐矛状菌（Nitrolancea_hollandica）产生了丰度优势. 小单孢菌属是LDPE1组和LDPE0.01组中的共同差异物种.
2个LDPE处理组之间进行比较, 如图 6（d）所示. LDPE1组中差异物种为硝化螺旋菌门（Nitrospirota）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、硝化螺旋菌纲（Nitrospiria）、伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）、硝化螺旋菌目（Nitrospirales）、醋酸杆菌目（Acetobacterales）、硝化螺旋菌科（Nitrospiraceae）、醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）、f_A0839、硝化螺旋菌属（Nitrospira）、泥单胞菌属（Pelomonas）、沉积物杆状菌属（Asinibacterium）、g_A0839和Nitrospira_defluvii. LDPE0.01组中差异物种有气单胞菌目（Aeromonadales）、鞘氨醇单胞菌目（Sphingomonadales）、气单胞菌科（Aeromonadaceae）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）、鞘氨醇单胞菌科（Sphingomonadaceae）、气单胞菌属（Aeromonas）、黄色土壤杆菌属（Flavisolibacter）、溶杆菌属（Lysobacter）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和独岛溶杆菌（Lysobacter dokdonensis）.
2.2.5 细菌群落功能比较了组间细菌群落KOs数目和功能结构. 3组的KOs数目分布情况见图 7（a）. 所有样本共有KOs数为3 980, 占所有KOs数（4 230）的94.09%. 说明3组样本的共有KOs占绝大多数. CK组和LDPE1组相比较, 各自特有KOs数分别为99和73, CK组和LDPE0.01组相比较, 各自特有KOs数分别为111和43, 说明LDPE处理使得土壤中KOs种类减少, 其中LDPE0.01处理KOs种类减少得更多. 使用PCA分析微塑料对OPAHs污染土壤细菌群落功能组成的影响, 结果见图 7（b）. PC1轴和PC2轴的贡献率分别为30.20%和21.41%. CK组与LDPE1组、LDPE0.01组分布区域存在小部分重叠, 大部分区域独立分布, 说明CK组与LDPE处理组间细菌群落功能组成存在差异.
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（a）功能基因数量韦恩图；（b）功能PCA分析 图 7 各处理组中细菌群落功能基因数量韦恩图及功能PCA分析 Fig. 7 Functions of bacterial communities in all treatments Venn diagram of the number of KEGG orthologs (KOs) and PCA analysis |
相对丰度前35的KOs组间丰度比较结果如图 8所示. 与CK组相比, LDPE1组中K00382、K00626和K03406基因相对丰度增加, K03088、K00384、K02004、K03704、K01990、K02529、K01992和K06147基因相对丰度减少；LDPE0.01组中K00799、K03496、K07090、K01952、K02014、K07107和K01754基因相对丰度增加, K01652、K01999、K01995、K01998、K01996、K01997、K02035、K08884、K02003、K02032、K01784、K02016、K02015、K00059、K02033、K02034、K01990、K02529、K01992和K06147基因相对丰度减少. 其中大部分相对丰度变化的KOs, 例如K06147、K02003、K02035、K02034、K02033、K01990、K01992、K02014、K01999、K01995、K01998、K01996、K01997、K02032、K02016、K02015和K02004, 主导着转运蛋白的合成.
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图 8 各处理组前35个同源基因相对丰度聚类热图 Fig. 8 Heat map of relative abundances of top 35 KEGG orthologs (KOs) in all treatments |
OPAHs是PAHs分子中氢原子被1个或多个羰基、羟基和羧基等官能团取代形成的羰基化、羟基化及羧基化衍生物. 这些OPAHs与PAHs既有芳香结构的相似性, 又有含氧官能团的差异性. KEGG数据库暂未涉及OPAHs的降解通路, 但包含PAHs降解通路及相应降解KOs和降解产物OPAHs信息, 因此重点关注了样本中涉及PAHs降解（通路ID：ko00624）的功能, 即第4层级功能. 所有样本中共检出21个PAHs降解KOs, 各处理组中降解KOs的组成及绝对丰度如图 9（a）所示. 各处理组中PAHs降解KOs的绝对丰度之和分别为47 340.78（CK）、43 133.79（LDPE1）和39 005.20（LDPE0.01）, 由高到低的排序为：CK > LDPE1 > LDPE0.01. 由此可见, LDPE处理降低了PAHs降解路径中KOs的丰度.
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（a）PAHs降解同源基因绝对丰度组成, （b）绝对丰度前5的PAHs降解酶；不同小写字母表示处理组间差异显著（P < 0.05）1.CK, 2.LDPE1, 3.LDPE0.01 图 9 各处理组PAHs降解同源基因绝对丰度组成及绝对丰度前5的PAHs降解酶 Fig. 9 Absolute abundance composition of PAHs degrading KEGG orthologs (KOs) and absolute abundance of top five PAHs degrading enzymes in all treatments |
21个PAHs降解KOs共对应19种降解酶, 其中绝对丰度前5位的酶分别为原儿茶酸酯3, 4-双加氧酶（EC：1.13.11.3）、水杨酸1-单加氧酶（EC：1.14.13.1）、铁氧还蛋白-NAD+还原酶（EC：1.18.1.3）、原儿茶酸4, 5-双加氧酶（EC：1.13.11.8）和4, 5-二羟基邻苯二甲酸脱羧酶（EC：4.1.1.55）, 具体如图 9（b）所示. 其中原儿茶酸酯3, 4-双加氧酶可催化分子氧中两个氧原子的内二醇加成, 导致芳环的邻位切割, 其绝对丰度最大；该酶与铁氧还蛋白-NAD+还原酶和原儿茶酸4, 5-双加氧酶这3种酶在各组间的绝对丰度均无显著差异, 说明LDPE处理未对其产生显著影响. 水杨酸1-单加氧酶和4, 5-二羟基邻苯二甲酸脱羧酶受LDPE影响较大, 经LDPE处理后两者绝对丰度均有所下降, 水杨酸1-单加氧酶数量从14 260（CK）降至12 163（LDPE1）和10 769（LDPE0.01）；4, 5-二羟基邻苯二甲酸脱羧酶从4 578降至2 846（LDPE1）和2 490（LDPE0.01）. 说明LDPE对水杨酸1-单加氧酶和4, 5-二羟基邻苯二甲酸脱羧酶均有抑制效应.
3 讨论 3.1 LDPE对土壤中OPAHs自然衰减的影响LDPE对OPAHs在14 d内的自然衰减产生了抑制效应, 且随LDPE剂量增加, 抑制效应增强, 1%较0.01%剂量的LDPE对OPAHs自然衰减抑制效应更显著. Shang等[41]研究28 d内2%和0.2%剂量的聚乙烯微塑料对土壤中菲的降解影响也有类似结论, 其认为导致这一现象的原因有两个, 一是聚乙烯微塑料对菲具有较高的吸附亲和力, 降低了菲的生物可利用性；二是聚乙烯微塑料增加了土壤中有机碳的含量, 较高水平的不稳定有机碳抑制PAHs降解菌的生长. Zhao等[42]研究发现微塑料对土壤微生物能量产生、转化以及蛋白质合成、利用都有一定的抑制作用, 且随着微塑料比例的增加, 抑制作用越发明显. 推测本研究中LDPE对OPAHs 14 d时自然衰减所展现的抑制效应可能源于其对OPAHs吸附导致其生物可利用性下降和对OPAHs降解菌生命活动的干扰. 随着自然衰减的进行, 土壤中OPAHs含量逐渐减少, 第28 d时的OPAHs含量降至第14 d的1/2, 此时LDPE无明显抑制效应. 说明LDPE对土壤中OPAHs自然衰减的影响因衰减时间而异, 随时间增长抑制效应减弱.
3.2 LDPE对OPAHs污染土壤中细菌群落组成和多样性的影响土壤培养28 d后, OPAHs含量在3个处理组间无显著差异, 但土壤细菌群落的组成和结构经LDPE处理后产生部分变化. OPAHs污染土壤细菌群落门水平组成中, 变形菌门和放线菌门相对丰度最大, 添加LDPE不同程度地提高了其相对丰度. Zhang等[43]在薄膜覆盖（主要为聚乙烯）的农田土壤中发现微塑料、大塑料、植物凋落物和土壤颗粒中最占优势的细菌门均是变形菌门和放线菌门, 这与本研究的结果一致. 属水平上, 芽孢杆菌属、小单孢菌属、鞘氨醇单胞菌属和硝化螺旋菌属为3个处理组中的优势菌属, 也是组间两两比较得到的差异贡献率排名前2的物种. 芽孢杆菌属是CK组和LDPE1组间差异贡献率最大的菌属, 也是CK组和LDPE0.01组间差异贡献率第2的菌属, LDPE处理使OPAHs污染土壤中芽孢杆菌属相对丰度下降. Ya等[44]研究也发现类似结果, 1%和5%剂量的LDPE微塑料均降低了土壤中芽孢杆菌属的相对丰度, 其中5%剂量的LDPE影响效果显著. 小单孢菌属是主导CK与LDPE1组组间群落差异的主要物种之一, 其在LDPE1和LDPE0.01组中相对丰度均较CK组有所增加. 根据Oliveira等[45]的研究结果, 小单孢菌属为降解塑料（LDPE、聚苯乙烯和聚乳酸）的新型菌株, 因此本研究添加LDPE可能使土壤中小单孢菌属可利用的碳源增加, 进而使其相对丰度增加. 鞘氨醇单胞菌属是CK组和LDPE0.01组及LDPE1组和LDPE0.01组组间差异贡献率最大的菌属, 也是两个LDPE处理组间的差异物种. 该菌属在LDPE1组和LDPE0.01组中的相对丰度均高于CK组, 且在LDPE0.01组中最高. 有研究表明鞘氨醇单胞菌属能够降解各种复杂的有机化合物, 包括PAHs、二噁英、增塑剂双酚A和对苯二甲酸二甲酯[46, 47], 该菌属可能会以LDPE内源物为碳源, 使其在LDPE处理组中的相对丰度增加. 硝化螺旋菌属是主导LDPE1组和LDPE0.01组组间差异的菌属之一, 也是这两组之间的差异物种, 其在LDPE1组中相对丰度高于CK组, 在LPDE0.01组中与CK组持平. Wu等[48]研究了塑料覆盖膜残留物对土壤微生物的影响, 发现LDPE处理促使硝化螺旋菌门、硝化螺旋菌科和硝化螺旋菌属相对丰度增加, 其认为硝化螺旋菌属是潜在的LDPE降解菌, 因此在微塑料污染土壤中相对丰度增加. 组间差异贡献率排名前两位的菌属中, 除芽孢杆菌属外, 小单孢菌属、鞘氨醇单胞菌属和硝化螺旋菌属均是LDPE或其内源物的潜在降解菌.
LDPE对OPAHs污染土壤中细菌群落的α和β多样性产生了一定影响, 但影响程度均未达到统计学意义上的显著水平. 差异物种分析结果显示, CK组与LDPE1组共存在19个丰度差异显著的物种, 与LDPE0.01组共存在26个, 这些差异物种是导致细菌群落多样性发生变化的原因之一.
3.3 LDPE对OPAHs污染土壤中细菌群落功能的影响LDPE影响了OPAHs污染土壤中细菌群落的功能, 主要体现在KOs数目、功能结构、优势功能基因丰度、PAHs降解基因及降解酶丰度等功能信息的变化上. 为明确土著细菌群落在土壤中OPAHs自然衰减所起的作用, 重点关注了PAHs降解基因及降解酶丰度信息. 3个处理组中PAHs降解基因绝对丰度存在差异, 在两个LDPE处理组中绝对丰度均低于CK组, 说明LDPE处理降低了PAHs降解基因的总丰度, 抑制了PAHs降解菌的生长. 21个PAHs降解KOs共对应19种降解酶, 绝对丰度前5位的酶中有3种绝对丰度在各处理组间无显著差异, 水杨酸1-单加氧酶和4, 5-二羟基邻苯二甲酸脱羧酶经LDPE处理后绝对丰度均降低. LDPE对PAHs降解基因丰度的影响与14 d时其对OPAHs自然衰减的抑制效应相对应, 但与第28 d时无显著影响的表现不符合. 推测土壤中OPAHs在自然衰减过程中, 其含量不断变化, 刺激土壤细菌群落不断演变, 但土壤细菌群落的响应和更替是个稍滞后的过程. LDPE对PAHs降解菌生长的抑制总体上干预了OPAHs的自然衰减行为.
4 结论土壤中OPAHs自然衰减初期LDPE表现出抑制效应, 且抑制程度因LDPE添加量增大而增大；随着自然衰减的进行, LDPE抑制效应消失, 两种添加剂量的LDPE均无显著影响. OPAHs污染土壤培养28 d后, 3个处理组主要共同优势菌门为变形菌门、放线菌门等, 添加LDPE不同程度地提高了这2门的相对丰度. 主要共同优势菌属为芽孢杆菌属、小单孢菌属、鞘氨醇单胞菌属和硝化螺旋菌属等, 这4个菌属是主导组间群落差异的主要物种；LDPE处理使芽孢杆菌属相对丰度下降, 使另外3个菌属相对丰度上升, 芽孢杆菌属为LDPE或其内源物的潜在降解菌. LDPE使细菌群落的α和β多样性发生了一些变化, 但程度不显著. LDPE影响了细菌群落的功能, 降低了PAHs降解基因的总丰度及部分降解酶（水杨酸1-单加氧酶和4, 5-二羟基邻苯二甲酸脱羧酶）丰度, 抑制了PAHs降解菌的生长, 进而干预了OPAHs的自然衰减. 本实验研究了LDPE对含羰基官能团的OPAHs自然衰减及细菌群落的影响. 今后应关注更多类型的农业常用塑料对更多种类OPAHs自然衰减及细菌群落的影响, 以期为农田土壤中微塑料及OPAHs污染风险评估及管控提供理论依据.
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