2024, Vol. 45
, PEI Huan-huan
, ZHANG Ya-shan
, LI Jia-xin
, LIU Fen-wu
, QIAO Xing-xing
, QIN Jun-mei
随着科技的发展, 抗生素日渐被广泛应用, 其中, 四环素（TC）作为一种广谱性抗生素, 在家禽养殖、水产养殖行业和农林业生产中被广泛应用. 我国畜禽养殖业得到了快速发展, 生产方式也逐步从散养发展为规模化. 随着集约化猪、鸡养殖的推广与普及, 包括抗生素在内的兽药被大量使用. 抗生素可以预防和治疗畜禽的传染性疾病, 并在低剂量时促进动物生长, 在保护动物健康和降低养殖成本方面发挥了积极作用[1 ~ 3]. 有研究表明, 猪粪中抗生素残留量最高, 其中四环素类残留量高达1 390 ~ 354 000 µg·kg-1[4]. 然而抗生素在动物体内极难被吸收, 大部分抗生素都会以母体化合物形式排出动物体外, 其作为有机肥进入土壤和水体环境中, 从而对植物产生危害. 林琳等[5]研究发现土壤TC污染对小白菜幼苗的生长发育产生抑制作用；迟荪琳等[6]研究也表明TC抑制了生菜的生长. 因此, 环境中残留的抗生素已经引起了高度关注[7, 8].
长期以来, 为了提高养殖业生产效率, 部分重金属如铜（Cu）和锌（Zn）等常被作为饲料添加剂使用, 可见, 在抗生素污染的同时往往伴有严重的重金属污染. 而Cu作为一种抗菌剂和骨骼强壮剂, 导致猪饲料中普遍添加CuSO4[9], 而大多数情况下铜的添加量往往高于动物的需求量, 导致大量的铜不能被吸收利用, 随动物的排泄物进入土壤环境中, 形成一定程度的污染, 猪粪中ω（Cu）和ω（Zn）最高, 中位值分别为406.9 mg·kg-1和671.3 mg·kg-1[10]. 而铜进入土壤中会造成大面积的植物毒害, 不但会严重影响植物产量和质量, 而且还会通过食物链影响人体健康. 且有研究表明, 土壤重金属与抗生素的复合污染, 其作用机制比单一污染更为复杂[11]. 这种复合污染不仅对植物生长发育产生抑制作用, 而且会造成农产品质量下降. 因此, 土壤重金属与抗生素复合污染的修复逐渐被广泛关注.
而生物炭作为一种新兴的土壤钝化材料, 是生物质通过厌氧条件在高温裂解下形成的炭质材料, 比表面积大、孔隙发达且含有大量较稳定的官能团[12, 13], 可吸附土壤中的各种污染物, 影响其在土壤中的迁移性和生物有效性. 目前, 生物炭在固碳、改良土壤、提高土壤生产力和吸附废水及土壤中的重金属等方面研究比较多, 而对于有机污染物的研究较少[14]. 现已有研究发现通过向土壤中添加生物炭, 可以加速土壤中土霉素的耗散速率, 减缓土霉素向农作物根系的迁移, 从而降低植物根系中抗生素抗性基因的丰度值[15]. 也有研究发现生物炭使得土壤中四环素的去除率提高了10.86%[16]. 这说明生物炭对土壤中抗生素的污染物具有很强的固定吸附能力, 并且能够显著降低抗生素在土壤中的迁移和潜在危害性[17]. 生物炭一般呈碱性, 重金属离子在碱性条件下容易发生沉淀, 沉淀形式包括生物炭与金属离子形成氢氧化物、氧化物、碳酸盐和磷酸盐等[18]. 生物炭吸附重金属的离子交换机制主要是指重金属与生物炭表面碱土金属（如Ca2+、K+、Mg2+和Na+等）发生离子交换[19]. Yan等[20]研究表明, 富磷生物炭可有效吸附水中Pb2+. 刘桃妹等[21]研究发现在水稻土中施用椰壳生物炭能有效缓解土壤中的重金属污染. 张英等[22]研究结果表明生物炭能够有效吸附农田土壤内的重金属离子, 且随着时间的推移吸附效果会逐渐增强, 从而降低土壤重金属污染. 由此可见, 生物炭已经成为减轻土壤抗生素和重金属污染的有效手段之一.
在之前的研究中, 生物炭施加可以通过提高土壤的保水能力、改变土壤营养有效性和影响土壤微生物结构等途径对植物根系的生长发育产生影响[23]. 而不同生物炭的修复效果也有所差异, 因此, 本研究为实现秸秆资源化利用, 采用北方较常见且易获取的3种材料制备生物炭, 分别为玉米秸秆生物炭、谷子秸秆生物炭和苹果枝条生物炭. 本文拟通过土培试验, 以全国广泛种植的生菜为试验对象, 讨论不同生物炭对四环素（TC）和铜（Cu）复合污染土壤中生菜生长及其污染物累积的影响, 以期为生物炭修复污染土壤、保护植物生长及人体健康提供现实基础及理论依据.
1 材料与方法 1.1 试验材料供试土壤：采自山西省晋中市太谷区石象村农田耕层土壤（0 ~ 20 cm）, 土壤为石灰性褐土, 土样风干后过1 mm筛网. 土壤基本理化性质见表 1.
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表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Basic physical and chemical properties of the tested soil |
供试生物炭材料：采用限氧热解法制备生物炭, 将苹果树枝条、玉米秸秆和谷子秸秆粉碎后过0.9 mm筛备用. 称取一定质量原材料, 放入加盖坩埚内, 置于马弗炉中, 将3种材料分别在600℃下恒温热解炭化3 h, 制得3种生物炭, 分别记为A、C和M. 3种生物炭基本理化性质见表 2. 最后将生物炭研磨后过0.25 mm筛备用. 在25℃下, 将生物炭和14%的H3PO4溶液以1∶2的比例浸泡24 h后, 使用蒸馏水洗涤, 直到上清液的pH接近中性. 然后, 将上清液弃去, 并将生物炭放入105℃的烘箱中进行干燥, 从而制得其改性生物炭, 分别记为PA、PC和PM.
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表 2 3种生物炭基本理化性质1） Table 2 Basic physicochemical properties of three types of biochar |
供试生菜：供试生菜种子购自河北省沧州市青县良达盛农技术推广中心, 品种名称为“全年耐抽苔生菜”.
1.2 试验设计盆栽试验于2021年在山西农业大学资源环境学院试验基地进行, 每盆土壤用量为3 kg. 以生菜为供试作物, 将污染物[Cu（NO3）2·3H2O和盐酸四环素]均匀喷洒于供试土壤, 将其混匀后老化30 d, 其中TC添加量为50 mg·kg-1, Cu添加量为400 mg∙kg-1. 生物炭用量为15 g·kg-1, 本试验设置7个处理, 每个处理重复3次, 分别为：不添加生物炭（CK）、添加苹果枝条生物炭（A）、添加玉米秸秆生物炭（C）、添加谷子秸秆生物炭（M）、添加改性苹果枝条生物炭（PA）、添加改性玉米秸秆生物炭（PC）和添加改性谷子秸秆生物炭（PM）. 生长期间按土壤质量的百分比定量浇水, 分别在15 d和45 d取生菜幼苗期和成熟期植株样品.
1.3 测试指标与方法 1.3.1 生菜生理指标测定通过碘量滴定法测定过氧化氢酶含量；通过硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量；用酸性茚三酮法测定脯氨酸含量；用80%丙酮研磨法测定叶绿素含量；通过考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量；用水杨酸-硫酸比色法测定硝态氮含量.
1.3.2 四环素和铜含量及抗性基因的提取与测定四环素含量提取与测定：将土壤和植物样品分别置于50 mL离心管中, 加入10 mL提取液（Na2EDTA-Mllvaine∶甲醇=1∶1）. 通过涡旋混匀1 min, 并进行20 min超声处理. 然后以3 500 r∙min-1离心10 min, 并重复此步骤3次, 将上清液合并. 将合并的上清液进行两次正乙烷洗涤, 每次使用10 mL正乙烷, 洗涤后进行离心, 去除正乙烷. 然后将洗涤后的上清液在40℃下旋转蒸发至体积约为12 mL. 然后, 进行固相萃取. 首先, 使用6 mL甲醇和6 mL超纯水依次活化固相萃取小柱. 活化后, 以1 mL∙min-1的流速通过小柱进行提取液的处理. 使用5 mL 5%甲醇淋洗小柱, 再用5 mL超纯水冲洗小柱. 随后, 用真空抽干法将小柱中的溶液抽滤10 min. 最后, 使用5 mL甲醇溶液对小柱进行洗脱, 收集洗脱液. 将固相萃取得到的洗脱液使用氮吹仪浓缩至1 mL左右, 然后使用甲醇定容至1 mL. 将溶液通过0.22 µm有机滤头过滤后, 使用高效液相色谱法（HPLC）进行测定. 以原始土壤生长的生菜进行质量控制, 其回收率为97.6% ~ 99.2%.
四环素类抗生素抗性基因测定：采用StepOnePlus实时荧光定量PCR进行Q-PCR检测.
Cu含量提取与测定：植物和土壤样品用硝酸、盐酸和氢氟酸消煮结束后用原子吸收分光光度法测定, 原始土壤生长的生菜进行质量控制, 回收率为96.4% ~ 100.6%.
1.4 数据处理运用Excel 2016计算各处理组的平均值和标准偏差；通过Origin 2022制作数据图；运用DPS软件进行单因素方差分析, 并利用LSD多重比较进行差异性显著分析（P < 0.05）.
2 结果与分析 2.1 不同生物炭对生菜生理特性的影响 2.1.1 不同生物炭对生菜生长及品质的影响表 3可知, 与CK相比, 添加生物炭显著影响了生菜的生长, 生菜株高、根长、株鲜重和根鲜重均显著增加（P < 0.05）. 可以看出, PA处理的生菜株高最大, 增幅为24.38%, 但PM处理的生菜根长、株鲜重和根鲜重均最大, 增幅分别为80.71%、236.13%和338.17%. 总体趋势, 改性生物炭对提高生菜株高、根长、株鲜重和根鲜重的效果优于原生物炭, 其中PM处理对提高生菜生长的效果最佳.
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表 3 不同处理对生菜生长的影响1） Table 3 Effects of different treatments on lettuce growth |
图 1（a）表明, 与CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, 在幼苗期, 生菜硝态氮含量都有不同程度地增加, 其中C处理硝态氮含量最大, 增幅为91.49%；而在成熟期, 生菜硝态氮含量均显著增加, 其中M处理含量最大, 增幅为82.34%. 同CK相比, 添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, 在幼苗期和成熟期, 生菜硝态氮含量均显著增加, 其中PM处理硝态氮含量最大, 增幅分别为123.05%和102.43%. 图 1（b）表明, 同CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, 在幼苗期和成熟期叶绿素含量均显著增加, 幼苗期C处理的叶绿素含量最大, 增幅为170.59%；成熟期M处理的叶绿素含量最大, 增幅为46.67%. 同CK相比, 添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, 在幼苗期和成熟期, 生菜叶绿素含量均显著增加, 其中PA处理的叶绿素含量均最大, 增幅分别为197.06%和66.67%. 可以看出, 无论是在幼苗期还是成熟期, 叶绿素含量增加最为显著的均为PA处理. 图 1（c）表明, 同CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, 在幼苗期和成熟期可溶性蛋白含量均显著增加, 在幼苗期C处理的可溶性蛋白含量最大, 增幅为97.58%, 而在成熟期A处理的含量最大, 增幅为220.00%. 同CK相比, 添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, 在幼苗期和成熟期, 生菜可溶性蛋白含量均显著增加, 其中PA处理在两个时期的可溶性蛋白含量均最大, 增幅分别为183.06%和513.33%. 可以看出, 改性后的生物炭整体效果较好；无论是在幼苗期还是成熟期, 可溶性蛋白质含量增加最为显著的均为PA处理. 由此可见, 生物炭添加能够减少TC和Cu复合污染物从土壤向植物迁移, 减少污染物对生菜蛋白质合成的抑制及破坏, 从而使生菜中硝态氮、叶绿素和可溶性蛋白质含量增加.
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不同的小写字母表示不同处理间在5%水平差异显著 图 1 不同处理生菜硝态氮、叶绿素和可溶性蛋白含量 Fig. 1 Nitro nitrogen, chlorophyll, and soluble protein content of lettuce under different treatments |
图 2（a）表明, 同CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, 在幼苗期和成熟期生菜MDA含量均显著降低, 在幼苗期, A处理的MDA降幅最大, 为12.50%；而在成熟期, M处理降幅最大, 为25.16%. 同CK相比, 添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, 在幼苗期和成熟期, 生菜MDA含量均显著降低, 在两个时期均为PA处理降幅最大, 降幅分别为23.61%和40.88%. 图 2（b）表明, 同CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, 在幼苗期和成熟期生菜过氧化氢酶（CAT）活性均显著降低, 均为M处理降幅最大, 降幅分别为66.18%和80.15%. 同CK相比, 添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, 在幼苗期和成熟期, 生菜CAT活性均显著降低, 在两个时期均为PA处理降幅最大, 降幅分别为72.79%和92.24%. 图 2（c）表明, 同CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, 在幼苗期和成熟期生菜脯氨酸含量均显著降低, 均为M处理降幅最大, 降幅分别为49.15%和58.41%. 同CK相比, 添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, 在幼苗期和成熟期, 生菜脯氨酸含量均显著降低, 在两个时期均为PA处理降幅最大, 降幅分别为83.47%和69.13%. 说明生物炭添加能够降低生菜中TC和Cu复合污染物含量, 进而降低生菜受逆境胁迫, 其中PA处理效果最明显.
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不同的小写字母表示不同处理间在5%水平差异显著 图 2 不同处理生菜丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）和脯氨酸含量 Fig. 2 Promaldialdehyde (MDA), catalase(CAT), and proline content in lettuce under different treatments |
生菜地上部和地下部TC含量的测定结果如图 3所示, 总体来说, 生物炭加入后, 生菜中的TC含量均有不同程度地降低. 生菜地下部作为与土壤直接接触的植物, 其TC含量高低能够较为有效地反映生物炭在土壤中的作用效果. 并且生菜地下部的TC富集量比地上部高. 与CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, TC含量明显降低, 添加M处理的TC含量降低最为显著, 降幅为37.13%；添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, TC含量比添加原生物炭的TC含量更低, 这说明改性后的生物炭效果更好, 其中添加PM处理的TC含量降低最为显著, 降幅为55.64%. 此结果表明, 生物炭的添加可以有效地钝化TC在土壤中的生物有效性, 能够显著减少生菜地下部对于土壤中TC的吸收效率, 对TC在生菜体内的转移和富集起到积极的截流作用.
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不同的小写字母表示不同处理间在5%水平差异显著 图 3 不同处理的生菜TC含量 Fig. 3 Tetracycline content of lettuce under different treatments |
对于生菜地上部而言, 不与土壤中的TC直接接触, 但值得注意的是, 地上部TC含量的变化趋势能够较好地反映生菜对TC的吸收转运差异, 添加不同生物炭后, 对生菜TC含量转运系数影响并不大, 其中添加PM处理的TC转运系数最低, 这说明生物炭添加可以有效地阻止TC向地上部转移. 生菜地上部测定结果显示：与CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, 整体变化趋势差异较小, 添加M处理的TC含量降低最为显著, 降幅为54.84%；添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, TC含量均显著降低, 其中添加PM处理的TC含量降低最为显著, 降幅为92.32%.
2.2.2 生菜中Cu含量生菜地上部和地下部Cu含量的测定结果如图 4所示, 生物炭加入后, 生菜中的Cu含量均显著降低. 并且生菜地下部的Cu富集量比地上部高, 与CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, Cu含量均显著降低, 但各处理间的差异并不显著, 分别降低26.03%、31.89%和22.41%；添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, 生菜地下部Cu含量分别降低了34.04%、42.29%和35.35%, 可以看出Cu含量比添加原生物炭的Cu含量更低. 此结果表明, 生物炭的添加可以有效地钝化Cu在土壤中的生物有效性, 并且改性后的生物炭效果要好.
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不同的小写字母表示不同处理间在5%水平差异显著 图 4 不同处理的生菜Cu含量 Fig. 4 Cu content of lettuce under different treatments |
生菜地上部的测定结果显示, 添加不同生物炭后, 对生菜Cu含量转运系数影响并不大, 其中添加A、PA和PM处理可提高生菜Cu的转运系数. 与CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, 生菜地上部Cu含量均显著降低, 分别降低了12.79%、31.18%和18.71%；添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, 生菜地上部Cu含量分别降低了20.93%、36.47%和20.51%, 可以看出Cu含量比添加原生物炭的Cu含量更低.
2.2.3 生菜中抗性基因丰度图 5是6种ARGs和intI1基因在生菜地上部和地下部的丰度. 从中可以看出, ARGs和intI1基因均被检测出来, 而生物炭的添加可有效减少生菜ARGs和intI1基因的丰度. 通过PCA分析（图 6）可以很明显看出CK处理生菜ARGs和intI1基因相关性最强, 其次为C > A > M > PC > PA ≥ PM, 这说明PA和PM处理可有效降低生菜体内抗性基因丰度. 添加不同生物炭, 生菜地下部tetX、tetW、tetO、tetM、tetG、tetB、intI1的丰度均降低. 与CK相比, 添加3种原生物炭（A、C和M）后, M中的抗性基因丰度降幅最大, 降低了80.91%；添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, PA中的抗性基因丰度降幅最大, 降低了84.28%. 生菜地上部除tetG没检测出来, 其余ARGs和intI1的丰度均降低. 添加3种原生物炭（A、C和M）后, M中的抗性基因丰度降幅最大, 降低了40.62%；添加3种改性生物炭（PA、PC和PM）后, PM中的抗性基因丰度降幅最大, 降低了72.86%. 在添加原生物炭和改性生物炭中, 生菜体内ARGs和intI1基因丰度表现为：改性生物炭处理明显低于原生物炭处理, 并且生菜地上部的ARGs和intI1基因丰度明显降低.
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（a）地下部, （b）地上部不同的小写字母表示不同处理间在5%水平差异显著 图 5 不同处理的生菜地下部和地上部抗性基因丰度 Fig. 5 ARGs content of lettuce under different treatments |
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1~14分别为抗性基因：intI1（地下部）、tetB（地下部）、tetG（地下部）、tetM（地下部）、tetO（地下部）、tetW（地下部）、tetX（地下部）、intI1（地上部）、tetB（地上部）、tetG（地上部）、tetM（地上部）、tetO（地上部）、tetW（地上部）和tetX（地上部） 图 6 不同处理的抗性基因主成分分析 Fig. 6 PCA of resistance genes under different treatments |
从表 4看出生菜TC和Cu含量与生菜品质存在负相关关系, 与生菜抗逆指标存在正相关关系, 说明生菜硝态氮、叶绿素和可溶性蛋白含量随着生菜体内TC和Cu含量的降低而升高, 生菜丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）和脯氨酸含量随着生菜TC和Cu含量的降低而降低. 生菜的叶绿素、丙二醛含量与生菜地上部TC含量相关性显著；生菜的叶绿素、丙二醛、可溶性蛋白和脯氨酸含量与生菜地下部TC含量相关性显著；生菜的脯氨酸含量与生菜地下部Cu含量相关性显著（P < 0.05）. 总的来说, 生菜品质与生菜地下部TC和Cu含量相关性强, 并且与生菜TC含量相关性显著. 从图 7可以明显看到生菜抗性基因与生菜TC含量呈正相关关系, 其中tetX、tetW、tetM、tetB和intI1与生菜TC含量呈极显著正相关关系, tetO和tetG与生菜Cu含量相关性显著（P < 0.05）.
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表 4 生菜生理指标与TC和Cu含量的相关性1） Table 4 Correlation between physiological indicators and TC and Cu contents in lettuce |
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1~14分别为抗性基因：intI1（地下部）、tetB（地下部）、tetG（地下部）、tetM（地下部）、tetO（地下部）、tetW（地下部）、tetX（地下部）、intI1（地上部）、tetB（地上部）、tetG（地上部）、tetM（地上部）、tetO（地上部）、tetW（地上部）和tetX（地上部）；*为P < 0.05, **为P < 0.01；色柱表示相关性的数值大小 图 7 生菜抗性基因与TC和Cu含量的相关性 Fig. 7 Correlation between resistance genes in lettuce and TC and Cu content |
植物对抗生素和重金属吸收的影响因素众多, 添加生物炭等钝化剂可以改变这些因素, 从而影响植物对污染物的吸收, 降低其生物有效性, 从而利于植物的生长发育[24, 25]. 本研究结果表明, 在四环素和铜复合污染土壤中添加生物炭, 提高了生菜株高、根长、株鲜重和根鲜重, 并且改善了生菜硝态氮、叶绿素和可溶性蛋白含量, 这可能是由于生物炭改善了土壤的物理、化学和生物性质, 从而缓解了四环素和铜复合污染对生菜品质的负面影响. 与CK相比, 加入不同生物炭后, 硝态氮含量明显提升[图 1（a）], 这可能是由于生物炭加入土壤, 降低生菜对污染物的吸收, 从而促进植物从土壤中吸收氮素营养. 叶绿素是一类与光合作用有关的色素, 其含量高低决定光合作用的强弱[26]. 光合作用强, 植物的生长代谢旺盛, 可溶性蛋白质含量增加, 维持植物的正常代谢[27]. 本试验研究结果表明, 在四环素和铜复合污染土壤中施用不同生物炭可不同程度地提高生菜叶绿素和可溶性蛋白质含量[图1（b）和1（c）]. 这与蒋欣梅等[28]和金睿等[29]的研究结果一致, 王晓维等[30]也发现施加生物炭后油菜叶片中的叶绿素含量呈上升趋势, 说明生物炭的施用可有效缓解四环素和铜复合污染对生菜的毒害. 当四环素和重金属铜进入生菜后, 产生大量的活性氧, 引发氧化胁迫和膜损伤, 并且四环素中的官能团和铜离子与其他物质结合形成络合物, 能抑制可溶性蛋白质的合成；而生物炭的施用, 激活了生菜对四环素和铜复合污染的应对机制, 减轻了生菜的脂质过氧化程度. 当生菜所受胁迫降低时, 生菜叶片中叶绿素含量和可溶性蛋白质含量增加[31]. 当植物面临压力时, 许多活性氧自由基会在体内产生. 如果不能及时清除反应性氧自由基, 将会抑制植物的生长和发育[32]. 因此, 为保持正常的生长, 植物将通过抗氧化酶系统来抵御外部压力. 丙二醛（MDA）是衡量氧化胁迫程度的常用指标之一, 能反映植物膜脂过氧化的程度. 过氧化氢酶（CAT）是催化过氧化氢分解成氧和水的酶, 功能是使得氢氧化物不致于与氧在螯合物作用下反应生成非常有害的羟基自由基（·OH）, 存在于细胞的过氧化物体内. 脯氨酸作为植物细胞质内渗透调节物质, 在逆境条件胁迫下, 植物体内脯氨酸大量积累. 当四环素和铜进入生菜体内后, 导致植物受损, MDA和脯氨酸大量累积、CAT活性升高, 而添加生物炭后, 降低了土壤中四环素和铜复合污染物含量, 也使植物体内污染物含量下降, 植物所受胁迫降低, 因此MDA和脯氨酸含量以及CAT活性有所下降（图 2）. 王晓维等[30]研究发现施加生物炭使铜胁迫下油菜叶片中的CAT活性呈一定的下降趋势. 李继伟等[33]研究结果表明, 单施生物炭可以显著提高玉米叶片中CAT活性. 刘领等[34]也有类似研究结果. 说明施加生物炭可降低植物对污染物的吸收, 并增强植物对四环素和铜复合污染胁迫的抵抗能力.
3.2 不同生物炭对生菜TC和Cu含量及抗性基因丰度的影响TC和Cu被植物吸收后可以通过食物链进入人体, 从而对人体健康产生威胁. 本研究显示, TC和Cu复合污染土壤中生菜TC和Cu含量提升, 在添加生物炭后, 生菜TC和Cu含量有所降低（图 3和图 4）. 总体来说, 生菜地上部TC和Cu含量低于与土壤直接接触的地下部, 这可能是因为生物炭直接将TC和Cu复合污染物固定在土壤中, 有效地阻止TC和Cu复合污染物向植物地上部迁移. 也有相关研究表明土壤中添加生物炭阻止了污染物向植物体内的迁移[35]. 以上研究都说明生物炭丰富的多孔隙结构给抗生素提供了大量吸附位点, 也说明生物炭表面存在大量负电荷, 为阳离子提供了大量吸附位点, 一部分抗生素和重金属被生物炭吸附所以使得生菜中的TC和Cu含量下降. 抗性基因通过植物组织中的气孔迁移, 存在于植物地下部, 并在植物生长过程中到达地上部. 此外, 抗生素在土壤-植物系统中的诱导和突变也促进了ARGs的传播. 本研究结果发现生菜抗性基因与生菜TC含量主要呈正相关关系（图 7）, 这与以前的研究结果一致[36, 37]. 添加生物炭能够减少土壤中抗生素的含量, 有效降低蔬菜类食物中ARGs, 这也与已有研究结果一致[38 ~ 40]. intI1通常被认为是移动基因组件的指标[41], 它在土壤-植物系统中非常丰富, 可以通过水平基因转移促进ARGs的积累和传播. An等[42]研究发现生物炭的施用显著降低了叶际intI1基因的丰度, 表明生物炭可有效阻控intI1基因在叶际中的传播行为, 本研究也存在相同结果. 本研究中, ARGs和intI1基因可通过生菜地下部迁移至可食用的地上部, 而生物炭的施加能够显著减少植物ARGs和intI1基因的累积（图 5）, 且改性生物炭比原生物炭具有更强的对植物抗性基因的消减能力, 这是因为生物炭经磷酸改性后, 其比表面积提高、表面官能团增加, 对TC和Cu的吸附与还原能力明显提升[43], 改性生物炭比原生物炭更有效地限制TC和Cu向生菜地上部分转运, 降低生菜ARGs的丰度[44].
3.3 生菜生理特性与TC和Cu含量的相关性相关性表明（表 4）, 生菜TC和Cu含量影响着生菜生理特性. 整体来看, 与不添加生物炭相比, 加入不同生物炭后, 添加PM处理下生菜品质最好, 并且添加PM处理的生菜TC含量也最低, 这都说明TC含量与生菜品质相关性更强, 这可能是因为TC和Cu复合污染中, 生菜TC的含量主要影响生菜的品质. 李萌等[45]研究发现, 低浓度的氯霉素、金霉素和土霉素能抑制抗氧化酶活性. Riaz等[46]的试验结果表明, 抗生素浓度较高时, 能引起氧化胁迫, 损害小麦生理结构, 影响小麦早期生长, 从而降低产量. 黄佳等[47]研究表明, 抗生素对生菜生长产生抑制作用, 脯氨酸和CAT活性能快速响应抗生素胁迫, 这些研究都与本研究结果一致. 抗生素和重金属的使用会导致细菌发生基因突变, 从而产生抗性基因, 使得细菌对抗生素和重金属的抵抗力增强. 当抗生素和重金属抗性增加时, 可通过交叉抗性或共抗性的方式间接性地诱导并促进环境中ARGs的产生和传播[48]. 有研究发现Cu与tetW和sul2基因为弱负相关性[49], 本研究也发现Cu与tetW为弱负相关关系（图 7）. 本研究还发现生菜抗性基因与TC含量呈正相关关系（图 7）, 这说明添加生物炭可以显著降低生菜抗生素的含量, 进而控制ARGs在生菜可食用部分的含量.
4 结论（1）施用生物炭可以提高TC和Cu复合污染胁迫下生菜生理指标中硝态氮、叶绿素和可溶性蛋白含量, 降低丙二醛、脯氨酸含量以及过氧化氢酶活性, 在幼苗期和成熟期生物炭对生菜生理指标的影响趋势一致.
（2）添加生物炭可降低生菜TC和Cu的累积, 并且降低TC和Cu从生菜地下部向地上部的转移.
（3）生菜品质与生菜地下部TC和Cu含量均呈显著相关性, 与地上部TC含量呈显著相关性, 生菜抗性基因丰度顺序为：tetM > intI1 > tetB > tetX > tetW > tetG > tetO. tetX、tetW、tetM、tetB和intI1与生菜TC含量呈显著正相关, tetO和tetG与Cu含量呈显著正相关.
（4）综上所述, 不同生物炭对TC和Cu复合污染土壤生菜生长的影响效果有所差异, 改性生物炭对提高生菜生长及降低污染物累积的效果优于原生物炭, 改性谷子秸秆生物炭的修复效果最佳.
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