微生物在土壤有机碳(soil organic carbon, SOC)的形成和累积过程中起重要作用[1]. 基于最新提出的微生物“碳泵”理论, 植物凋落物和根系分泌物向土壤输入的过程中, 不易被微生物直接利用的植物源大分子化合物主要经“体外修饰”途径进入土壤有机碳库;而结构简单的化合物被微生物同化, 主要通过“体内周转”途径在土壤中累积[2~4]. 据此, 可以将SOC划分为颗粒有机碳(particulate oganic carbon POC)和矿物结合态有机碳(mineral associated organic carbon, MAOC)[5~7]. POC主要来源于相对未分解或部分分解的植物碎片, 化学成分以酚类、纤维素、半纤维素、几丁质等为主, 粒径>53 μm, 周转速度快, 可以无限累积, 但易受外界环境的干扰;MAOC主要来源于微生物代谢产物及其死亡残体, 以氨基糖、胞壁酸等为主要的化学组成, 粒径<53 μm, 通过物理化学机制吸附到矿物表面, 是稳定有机碳形态[5~9]. 在植物生长过程中, POC和MAOC含量均会发生变化, Hu等[10]研究发现喀斯特地区钙质土壤人工林恢复过程中POC显著增加, 而MAOC无明显变化. 在东北地区人工落叶松林生长过程中, MAOC含量从21~46 a显著增加, 后期有所下降, 但由于落叶松凋落物质量低, MAOC含量低于在自然植被恢复和耕地中的含量[11]. 在黄土高原160 a的自然植被演替过程中, POC的含量增加, MAOC的含量降低, 在顶极群落表层土壤中POC的分布比例最高, MAOC的分布比例最低[12]. 然而, 黄土高原地区人工林生长过程中POC和MAOC含量的变化规律还有待深入研究.
微生物作为SOC形成的纽带, 其对不同养分状况的响应会调控有机碳的形成途径, 进而影响对POC和MAOC的分配[2, 6, 13]. 受植物凋落物和根系分泌物等的数量和成分的差异以及植物和微生物的养分竞争等因素的影响, 微生物的生命活动会受到不同程度的养分限制[14~17]. 土壤胞外酶是土壤微生物为满足自身营养与能量需求而分泌的酶[18~20], 其化学计量比可以预测环境中的养分可用性和限制微生物生长代谢的活性元素[21, 22]. 在秦岭地区撂荒地的30 a自然恢复过程中, 微生物P限制逐渐缓解[23]. Cui等[24]研究发现在黄土高原自然植被演替过程中, 微生物受P限制的程度先增加后降低. Bi等[25]研究发现在沙地人工樟子松林59 a的恢复过程中, 微生物C限制增强, 限制性养分始终为N. 然而, 不同的微生物养分限制状况如何影响有机碳组分的分配尚不清楚.
防护林建设可以显著增加植被覆盖率, 调节陆地生态系统“碳汇”潜力[26~28]. 在防护林发展过程中, 植物输入会改变土壤有效养分含量, 进而影响土壤微生物对底物的利用, 导致不同程度的微生物养分限制, 最终影响有机碳的形成途径及各组分有机碳含量[12, 29, 30]. 然而, 尚不明确人工林建设过程中微生物养分限制与不同组分有机碳含量之间的关系及其内在机制. 因此, 本文选择陕北三北防护林不同建设年限的土壤, 通过测定POC和MAOC的含量与用于计算养分限制的土壤胞外酶活性, 确定防护林建设过程中POC和MAOC的变化特征及其与微生物养分限制动态的关系, 揭示防护林建设过程中土壤有机碳组分累积的微生物养分限制机制, 以期为明确植被恢复过程中有机碳积累的主要途径和防护林的建设和管理提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况研究区位于陕西省米脂县北部的三北防护林建设区的水蚀治理区. 该地区地势东北部高, 南部低, 地形起伏较大. 一年中5~8月日照充足, 12月至翌年2月日照较少, 四季分明, 全年平均温度为7.5~8.6℃, 年平均降水量大约为405 mm. 研究区域土壤主要为黄绵土, 土壤结构较为致密, 林下植被主要有铁杆蒿(Artemisia gmelinii Weber ex Stechm.)、胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)、阿尔泰狗娃花(Aster altaicus Willd.)、长芒草(Stipa bungeana Trin.)、中华隐子草[Cleistogenes chinensis(Maxim.)Keng.]和茵陈蒿(Artemisia capillaris Thunb.)等.
1.2 样品采集与试验设计采集研究区内建设年限为3、13、20和37 a的防护林区的土壤样品, 以未治理区(撂荒地)土壤为对照(CK). 具体的采样点信息及样点分布如表 1和图 1所示. 在每个年限的防护林区选择3个相隔100 m以上的样地作为野外重复, 在各样地内设置3个10 m×10 m的样方, 在各样方中以“S”形布点法采集5~6个样点内0~5、5~10和10~20 cm土层的土壤样品, 并把相同土层的样品混合均匀作为一个样品. 采集的土壤样品过2 mm筛以去除枯枝落叶和石砾. 将过筛后的样品分为两部分, 一部分风干后用于基本理化指标的测定和碳组分分离, 另一部分于-20℃保存, 用于测定胞外酶活性、铵态氮等指标.
土壤含水率(SWC)用铝盒采样, 在105℃下烘干后称重计算测得. 土壤pH用pH计测定, 水土比为2.5∶1(质量浓度). 电导率(EC)用电导率仪测定, 水土比为2.5∶1(质量浓度). 土壤有机碳(SOC)含量用重铬酸钾外加热法测定. 土壤全氮(TN)用凯氏定氮仪测定. 土壤铵态氮(NH4+-N)含量用KCl浸提, 流动分析仪测定(Auto Analyzer 3, German). 土壤全磷(TP)和有效磷(Olsen-P)经NaHCO3浸提, 钼锑抗比色法测定. 具体测定方法参考《土壤农化分析》[31].
1.3.2 POC和MAOC含量测定POC和MAOC的含量通过密度-重力法分离. 称取过2 mm筛的风干土20.00 g到锥形瓶中, 加60 mL六偏磷酸钠溶液(5%, 质量分数), 在摇床上振荡18 h(25℃, 180 r·min-1)后将混浊液过53 μm尼龙网筛, 并用蒸馏水冲洗至水流清澈. 分离后的样品在60℃下烘干并研磨, 其中粗质部分(粒径>53 μm)为POC, 细质部分(粒径<53 μm)为MAOC, 用重铬酸钾-外加热法测定各组分中有机碳含量[32].
1.3.3 土壤胞外酶活性土壤胞外酶活性用荧光分光光度法测定, 分别测定β-葡萄糖苷酶(BG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶(NAG)和碱性磷酸酶(AP)的活性. 其中, BG、NAG和AP的标准荧光物质为4-甲基伞形酮;LAP的标准荧光物质为7-氨基-4-甲基香豆素. 具体操作为:向1.000 0 g新鲜土壤样品中加入125 mL缓冲液, 振荡2 h(25℃, 180 r·min-1)以制备土壤悬浮液, 将悬浮液分别加入到样品孔(底物)、空白孔(缓冲液)和淬火标准孔(标准物质)中, 在(25±1)℃恒温培养箱中避光培养4 h. 培养结束后分别加入50 μL 0.5 mol·L-1 NaOH终止反应, 将所有样品混匀后吸取250 μL至96孔酶标板上, 用多功能酶标仪(Victor Nivo, 瑞士Tecan Infinite M200 PRO型)进行荧光检测. 激发波长365 nm, 吸收波长450 nm[33~35]. 土壤胞外酶活性单位为nmol·(h·g)-1.
1.4 数据处理及统计分析 1.4.1 土壤颗粒态有机碳和矿物结合态有机碳的计算(1) |
(2) |
式中, ΔM1为分离后上层土样的烘干重, g;ΔM2为分离后下层土样的烘干重, g;M为分离前土样的总质量, g;POC测为上层土样用重铬酸钾-外加热法测定的有机碳含量, g·kg-1;MAOC测为下层土样用重铬酸钾-外加热法测定的有机碳含量, g·kg-1.
1.4.2 土壤胞外酶活性的计算(3) |
式中, EEA为土壤样品的酶活性;F为校正后的样品荧光值;V为土壤悬浊液体积;V1为微孔板每孔中加入的样品悬浊液的体积;t为培养时间;m为干土样的质量;f为酶标仪读取样品微孔的荧光值;fb为空白微孔的荧光值;q为淬火系数;fs为阴性对照微孔的荧光值;e为荧光释放系数;fr为参考标准微孔的荧光值;cs为参考标准微孔的浓度;V2为参考标准物的体积;fq为淬火标准微孔的荧光值.
1.4.3 酶计量比的向量长度和向量角度通过计算土壤胞外酶化学计量比的向量长度和角度来评估土壤微生物生长代谢过程中的养分限制. 向量长度(vector length, VL)和向量角度(vector angle, VA)的计算方法如下:
(4) |
(5) |
当向量角度大于45°时, 微生物生长受P限制;小于45°时, 受N限制. 向量长度越长, 相对C限制越大[36, 37].
1.4.4 统计分析采样点分布图使用ArcGIS 10.5绘制. 试验数据在Excel 2019中整理汇总, 使用Origin 2023作图. 图表中数据均用平均值±标准差表示. 用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析和Tukey HSD事后检验, 使用Pearson相关分析法对土壤理化性质、碳组分和养分限制之间的关系进行分析比较, 用IBM Amos 28构建结构方程模型.
2 结果与分析 2.1 防护林建设过程中土壤有机碳组分的变化特征在防护林建设过程中, ω(SOC)在0~5、5~10和10~20 cm这3个土层中分别在4.38~8.35、3.95~4.81和3.14~4.49 g·kg-1之间, 呈先增加后降低的变化趋势. 防护林建设第3 a时, 0~5 cm和5~10 cm土层中SOC含量较CK显著降低了47.10%和17.88%[P<0.05, 图 2(a)]. 随着防护林建设年限的增加, 0~5 cm和5~10 cm土层中ω(POC)增加, 在第37 a达到最大值, 分别为1.53 g·kg-1和1.21 g·kg-1, 而在10~20 cm土层中最大值在林地建设的第13 a, 为0.83 g·kg-1. 与CK相比, 各土层中POC含量在防护林建设第3 a时均降低, 其中, 0~5 cm和10~20 cm土层中分别显著降低了54.55%和23.46%[P<0.05, 图 2(b)]. 而0~5 cm和5~10 cm土层中ω(MAOC)在第20 a时达到最大值, 分别为5.88 g·kg-1和3.59 g·kg-1, 但仍低于CK中MAOC的含量. 防护林建设至第37 a时, 0~5 cm土层中MAOC含量较第3 a时显著增加了31.64%, 而其余土层分别显著降低6.30%和31.14%[P<0.05, 图 2(c)].
防护林建设的前20 a, BG活性总体上呈增加的趋势, 但在第37 a时各土层中BG活性较前期分别显著降低了70%、56%和45%[P<0.05, 图 3(a)]. 各土层中LAP活性分别在51.58~115.14、63.39~87.17和40.78~105.64 nmol·(g·h)-1之间. NAG和AP活性在防护林建设的第3 a较CK显著降低[P<0.05, 图 3(c)和3(d)]. 而在防护林生长过程中, NAG活性显著增加, 0~5 cm和5~10 cm土层中其活性在第37 a达到最大值, 但在10~20 cm土层中较第20 a显著降低了64.50%[P<0.05, 图 3(c)]. 0~5 cm和5~10 cm土层中AP活性在第20 a时达到最大值, 分别为100.22 nmol·(g·h)-1和74.87 nmol·(g·h)-1, 而该时期10~20 cm土层中其活性降至最小值3.23 nmol·(g·h)-1, 到第37 a时显著增加了44.27%[P<0.05, 图 3(d)].
一般认为, 酶计量比的向量角度偏离45°越大, 微生物受养分(N、P)限制越严重;向量长度越长, 微生物受C限制越强烈[36]. 总体上, 酶活性向量角小于45°[图 4(a)], 且(NAG+LAP)/AP>1, BG/(NAG+LAP)<1[图 4(b)], 表明在防护林建设过程中微生物生长代谢主要受N限制. 在防护林建设的第3 a, 向量角度较CK显著降低了7.08%(P<0.05), 向量长度显著增加13.28%(P<0.05), 因此微生物C、N限制程度显著增加[图 4(c)和4(d)]. 随着植被生长, VA显著增加, 微生物N限制得到缓解[P<0.05, 图 4(c)]. VL从植被建设的第13 a开始降低, 在第37 a时较前一时期显著降低了22.63%[P<0.05, 图 4(d)], 表明长期的植被生长过程会缓解微生物C限制.
防护林建设过程中土壤理化性质如表 2所示. 研究区土壤pH值在8.05~8.56之间, 呈弱碱性, 植被生长3 a后各土层pH值分别显著增加5.71%、4.80%和4.28%(P<0.05). 防护林建设的前20 a, 0~5 cm和5~10 cm土层中TN含量整体下降, 而10~20 cm土层中TN含量始终显著降低(P<0.05). 0~5 cm土层中NH4+-N含量在第37 a时达到最大值, 且高于撂荒地, 但在其余土层中其含量较第20 a时分别显著降低了12.76%和31.38%(P<0.05). 在植被生长过程中, TP含量显著增加(P<0.05), 然而到第37 a时, 其含量在各土层中较第20 a分别显著降低了9.26%、11.11%和15.09%(P<0.05), 而在20~37 a, Olsen-P无显著变化(表 2).
在防护林建设过程中, SWC、EC、TN、NH4+-N、Olsen-P、NAG、LAP和AP与SOC、POC和MAOC的含量呈极显著的正相关关系(P<0.01), 与pH显著负相关(P<0.01). 此外, SOC含量还与TP呈极显著的正相关关系(P<0.01);BG活性与SOC和MAOC的含量显著正相关(P<0.01). MAOC含量与VL和VA显著正相关(P<0.05), SOC含量仅与VA显著正相关(P<0.05). 而POC的含量与VL呈负相关关系(图 5).
基于土壤理化性质、向量长度和角度及不同碳组分构建的结构方程模型(SEM), 如图 6所示. SWC和NH4+-N可以直接调节POC和MAOC的含量. 此外, SWC可以通过影响VL, 进而调节POC和MAOC的含量. NH4+-N可以通过调控VA, 最终影响MAOC的含量(图 6).
植被恢复会引起土壤有机碳及其组分含量的变化[38, 39]. 与Paul等[40]和Zhao等[41]的研究结果相似, 本研究中表层土壤POC、MAOC含量在人工林的恢复的第3 a显著低于CK(P<0.05, 图 2), 这可能是因为:①造林引起的扰动和土地利用类型的变化使各组分有机碳含量降低[40];②撂荒地中的植被主要为草本植物, 细根生物量较高, 利于土壤中各组分有机碳累积[42];③有机碳和土壤水分存在耦合关系[43, 44], 水分增加会促进有机碳的积累[45], 因此, SWC在第3 a时的显著降低也是导致有机碳组分含量降低的重要因素(P<0.05, 表 2);④防护林建设初期, 植物生长过程需要从土壤中大量吸收养分, 而土壤C和养分需要维持一定的计量比[46], 因此, 随着N、P养分含量的降低, 土壤POC和MAOC含量也相应降低(表 1和图 5).
此外, 本研究防护林建设过程中土壤SOC和MAOC含量的最高值出现在第20 a(图 2), 可能是因为该时期植被以刺槐和油松的混交林为主, 物种多样性增加[47], 促进了植物光合效率, 进而增加了光合碳的输入, 为微生物活动提供了更多的“热区”, 利于MAOC的累积[48]. 此外, 刺槐为固氮植物, 其在吸收N素时也会促进SOC含量的增加[49]. 但是, 该时期POC含量较第13 a时降低, 可能与混交林生长过程中木质素、缩合单宁等结构性化合物的输入量减少有关[50, 51].
POC含量总体上在第37 a达到最大, 而该时期MAOC含量较第20 a显著降低(P<0.05, 图 2). 因为随着植被生长, 木本植物凋落物不断累积, 木质素含量增加, 有机物主要通过物理转移的方式进入土壤, 形成碎片化的颗粒有机碳[1, 10, 52], 这也说明了在森林生态系统中植物源的组分对有机碳的贡献更大[53]. 然而森林发育过程对养分的强烈需求使根系与微生物竞争土壤中的养分, 限制微生物生长代谢, 使MAOC含量降低[29]. 这也表明了MAOC累积速率较慢, 需要通过长期的植被生长过程才能显著增加[13].
3.2 防护林建设过程对土壤微生物养分限制的影响当土壤中的养分不能满足微生物生长发育, 生态系统中能量流动和养分循环过程会受到影响, 最终可能导致植被退化[4, 54, 55]. 总体来看, 本研究区域内有效磷含量相对充足, 微生物生长代谢活动主要受C、N限制, 但不同防护林建设年限间土壤微生物生长代谢活动受C、N限制程度存在差异. 在林地建设的第3 a, 微生物C、N限制程度显著高于CK(P<0.05, 图 4), 这可能是因为:①造林初期树木的抗风蚀能力较低, 土壤中的细颗粒易在风力作用下迁移, C、N养分流失相对较快[56, 57], 不利于微生物的养分获取. ②该时期林地郁闭度、冠幅等低于其他时期[47], 植物凋落物累积量较低, 同时较低的土壤含水率使凋落物分解产生的溶解性物质较少[58, 59], 导致微生物可获取的能源及营养物质减少. ③防护林建设初期植物养分需求量较高[60], 植物会与微生物竞争土壤养分资源, 导致微生物可利用养分减少, 且微生物生长代谢是一个耗能的过程[61], 因此微生物C、N限制程度更高.
在防护林建设的3~20 a间, N限制缓解. 这可能是因为随着植被生长, 根系生物量增加, 提高了蛋白质、几丁质降解酶的活性, 增加土壤N, 应对N限制[37]. 而凋落物和根系分泌物向微生物提供的碳源仅能维持其生命活动, 因此C限制在防护林生长的前20 a间相对稳定. 到第37 a时, C限制缓解, N限制无明显变化. 然而Bi等[25]研究发现在沙地人工林生长的30~41 a, C、N限制程度均增加. 因为养分限制的动态变化是植物-土壤-微生物三者长期相互作用的结果, 本研究区地处黄土区, 土壤养分高于沙土[62], 植物物种多样性较高, 可以为微生物提供C源和养分, 因此微生物不需要大量消耗自身能量以分泌胞外酶的形式从基质中获取碳源, 而养分的吸收和利用处于相对平衡的状态, 即微生物C限制缓解, N限制无明显变化(图 4).
3.3 影响土壤有机碳累积的微生物养分限制机制土壤中维持微生物生长代谢的能量和养分发生变化时, 微生物将会以分泌胞外酶的形式应对环境变化, 进而导致以植物源和以微生物源为主的有机碳组分的含量发生相应的变化[13, 53, 63]. 本研究防护林建设的第20 a, NH4+-N显著影响VA, 相对较高的土壤有效氮含量缓解了微生物N限制, 利于微生物吸收利用小分子底物形成代谢产物, 完成死亡残体的累积与周转[64];活跃的微生物活动加速了残体的形成与周转, 促进了该时期MAOC含量的累积(图 2和表 2), 说明铵态氮可以通过缓解微生物的氮限制状况以调控MAOC的形成和累积(图 5和图 6). 在防护林建设的第37 a, C限制程度显著缓解, 即VL减小, 微生物分泌的BG活性降低, 减少了对纤维素、半纤维素等物质的分解[18], 从而促进了通过“体外修饰”途径形成的POC累积, 而对通过“体内周转”途径形成的MAOC的分配减少(图 4和图 6). 此外, Yang等[37]研究表明土壤含水率会导致微生物生物量及酶计量比的变化, 本研究结果也表明微生物C限制程度的强弱受土壤含水率的极显著调节(P<0.001, 图 6). 在防护林建设的20~37 a间, 土壤含水率降低(表 2), 导致微生物对底物的获取能力及底物有效性减弱[65], 从而使VL降低, 即C限制程度缓解, BG活性显著降低(P<0.05, 图 3和图 4), 进而调节了POC和MAOC含量, 使二者分别增加和降低(图 6). 此外, 值得注意的是, MAOC与VA的正相关关系(图 5)可能也与本研究的研究区VA均小于45°有关, 因为当VA大于45°且偏离程度增大时, 微生物P限制增强, 微生物的代谢活性仍会减弱[36, 66], VA和MAOC可能会表现为负相关的关系, 所以, 在分析养分限制和MAOC(或POC)的关系时需要注意VA的范围. 综上, 在防护林种植过程中适当地进行人为管理, 通过调节土壤N、P含量, 缓解微生物养分限制, 达到促进土壤有机碳累积的目的.
4 结论(1)总体而言, 防护林水蚀治理区的防护林建设过程中, 土壤有机碳及其组分含量随土层加深而降低, 且各组分有机碳含量低于撂荒地. 随着防护林的建设, POC含量在第37 a时达到最大值, MAOC的含量逐渐增加, 在第20 a达到最大值, 而到第37 a时显著降低(P<0.05).
(2)在防护林建设过程中, 0~5 cm土层中BG活性在20 a时达到最大值, 其余土层在第13 a时达到最大值, 而到第37 a时其活性降至最低. NAG和LAP整体上呈增加的趋势, 到第37 a时二者的活性显著高于撂荒地(P<0.05). 0~5 cm和5~10 cm土层中AP活性在第20 a时达到最大值, 而该时期10~20 cm土层中其活性最低. 且VA小于45°, 表明土壤微生物始终受N限制. 在第3 a时, VL相较于撂荒地均显著增加, VA显著减小(P<0.05), 表明C、N限制增强;第37 a时, VL显著降低, C限制缓解(P<0.05).
(3)微生物受C限制越强, POC含量越低, 而MAOC含量增加, 即微生物“体外修饰”途径受到限制, 将主要通过“体内周转”促进有机碳积累;微生物受N限制程度减弱时, 通过“体内周转”形成的MAOC含量将会显著增加(P<0.05).
致谢: 感谢西北农林科技大学资环学院环境科学与工程实验室的马爱生、于英翠、左亚杰和王卓这4位老师在研究中提供实验室和仪器设备的支持.
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