随着中国经济的飞速发展和人口的不断增长, 生产和生活用水需求量在不断增加, 每天产生大量的污水. 这些污水经排污管道收集后进入污水处理厂, 达到处理标准后排放, 污水处理厂出水的集中排放可能对受纳水体产生影响, 大部分研究将其认为是一个重要的污染源^{[1, 2]}, 如出水中的氮、磷加剧了水体中的富营养化现象^[3]. 然而, 有研究者则认为其可以增加受纳水体中功能菌的丰度, 提高水体的自净能力^{[4, 5]}.

目前, 我国大部分城镇污水处理厂执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918-2002）中的一级A标准^[6]. 太湖流域作为水敏感区域, 为控制氮磷排放总量, 整个流域内的新建城镇污水处理厂已经执行《太湖地区城镇污水处理厂污染物排放标准》（DB 32-1072-2018）^[7], 该标准（括号内的数值为水温 < 12 ℃时的控制指标）规定：ρ（TP） < 0.3 mg·L^-1、ρ（NH₄⁺-N） < 3（5）mg·L^-1和ρ（TN） < 10（12）mg·L^-1. 针对此标准, 本区域内大多数城镇污水处理厂进行了升级改造, 主要通过对生物池改造和新增深度处理设施实现达标排放, 如苏州某厂通过新增反硝化滤池等工艺将出水ρ（NH₄⁺-N）降低至（0.5±0.4）mg·L^-1, ρ（TN）降低至（8.0±1.2）mg·L^-1[8]；南方某厂采用曝气生物滤池强化脱氮效果, 使出水ρ（NH₄⁺-N） < 1.5 mg·L^-1, ρ（TN）维持在15 mg·L^-1以下^[9].

现有针对污水深度处理工艺的研究主要关注其对常规指标的去除效果^{[10, 11]}, 然而受纳水体不仅接纳了污水处理厂出水中的常规污染物, 还接纳了其中的微生物. 本研究借助第二代高通量测序技术^[12], 以环境敏感地区的某污水处理厂为研究对象, 通过宏基因组学解析深度处理阶段污水中细菌的赋存特征及其功能, 加深对污水深度处理工艺的认识, 以期为污水处理厂的优化运行提供理论支持.

污水处理厂位于太湖流域, 该地区经济发达, 人口稠密, 深度处理阶段工艺流程和取样点位如图 1所示, 分别在夏季（平均水温23.3℃）和冬季（平均水温10.2℃）采集了各工艺的进出水样品, 包括反硝化滤池进水样品（DeniIn）、反硝化滤池出水样品（DeniOt）、滤布滤池出水样品（ClothOt）、臭氧接触池出水样品（OzoneOt）和活性炭滤池出水样品（GACOt）（下文夏季和冬季样品分别以S_和W_为前缀加以区分）.

图 1

Fig. 1

图 1 污水深度处理工艺流程及采样点分布 Fig. 1 Schematic of the advanced wastewater treatment process and the distribution of sampling sites

该厂深度处理阶段设计进出水水质如表 1所示, 夏、冬两季的实际进出水水质如表 2所示, 实际出水的ρ（COD）平均值< 20 mg·L^-1, 出水的ρ（TP）平均值< 0.15 mg·L^-1, 出水的ρ（TN）平均值< 5 mg·L^-1, 出水水质可以稳定达到准Ⅲ类水排放标准.

表 1 (Table 1)

表 1 设计进出水水质/mg·L-1 Table 1 Designed influent and effluent water quality/mg·L-1 项目 COD BOD5 SS TN NH4+-N TP 设计进水水质 50 10 10 15 5 0.5 设计出水水质 20 4 5 5 1 0.15

表 1 设计进出水水质/mg·L-1 Table 1 Designed influent and effluent water quality/mg·L-1

表 2 (Table 2)

表 2 实际平均进出水水质/mg·L-1 Table 2 Actual influent and effluent water quality/mg·L-1 季节 项目 COD BOD5 SS TN NH4+-N TP 夏季 进水水质平均值 21.3 5.9 5.5 11.3 3.1 0.45 出水水质平均值 16.7 3.8 2.3 4.5 0.4 0.14 冬季 进水水质平均值 24.7 6.2 5.8 11.8 3.5 0.41 出水水质平均值 14.6 4.4 2.4 4.6 0.7 0.09

表 2 实际平均进出水水质/mg·L-1 Table 2 Actual influent and effluent water quality/mg·L-1

使用PurLVS^TM大体积样本病毒浓缩系统（卓诚惠生公司）将水中细菌富集到0.45 μm滤膜（SCI Materials Hub）, 然后采用NEXTFLEX^TM Rapid DNA-Seq试剂盒（PerkinElmer Inc.）提取富集样品中的DNA. 完成基因组DNA抽提后, 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA的质量与完整性. 采用Illumina HiSeq 4000（Illumina, USA）平台进行宏基因组测序. 使用fastp软件对原始测序数据进行质控, 以保证分析结果的准确性.

使用Mgehit（版本1.1.2）将测序获得的优化序列（clean reads）组装为重叠群（contigs）. 使用MetaGene对拼接结果中的重叠群进行开放阅读框（ORF）预测, 将其翻译为氨基酸序列. 使用CD-HIT（版本4.6.1）对所有样品预测出来的基因序列进行聚类（相似度≥ 90%和覆盖率≥ 90%）, 构建非冗余基因集. 使用DIAMOND软件（版本2.0.13）将非冗余基因集与NR数据库进行比对（E-value ≤ 10^-5）. 参考Fang等^[13]的微生物α多样性的算法计算门、属分类学水平的Sobs（丰富度）指数和Shannon（多样性）指数. β多样性分析基于R语言主要坐标分析（principal co-ordinates analysis, PCoA）进行统计分析和作图. 使用R的stats包, 基于Wilcoxon符号秩检验进行组间比较. 使用HMMER软件（版本3.1b2）将非冗余基因集与碳水化合物活性酶数据库（CAZy, 版本5.0）和KEGG基因数据库（版本94.2）进行比对, 比对参数设置E-value为10^-5. 使用Origin 2022及R语言进行绘图.

夏、冬两季时污水处理厂深度处理阶段污水样品中细菌的的α多样性见图 2, 所有样本的Coverage指数均为1, 表明测序获取了所有样本中全部的遗传信息, 结果可靠. Sobs指数和Shannon指数分别反映了细菌群落的丰富度和多样性. 图 2（a）显示, 夏季时深度处理阶段污水中门水平细菌的Sobs指数均为161, 表明不同处理单元出水中门水平细菌的丰富度相近；冬季时污水中门水平细菌的Sobs指数为75 ± 8, 反硝化滤池出水中门水平细菌的丰富度（Sobs指数为67）较反硝化池进水（Sobs指数为83）明显降低. 此外, 夏季深度处理阶段污水中门水平细菌的Sobs指数显著高于冬季（P < 0.05）, 表明随着温度降低, 深度处理阶段污水中门水平细菌的丰富度减少. 图 2（b）显示, 在深度处理阶段, 活性炭滤池出水中门水平细菌的多样性最高（Shannon指数, 夏季：2.62, 冬季：0.81）. 夏季反硝化滤池出水中门水平细菌的Shannon指数最小（1.66）, 多样性最低, 其次是臭氧接触池出水（Shannon指数为1.66）；冬季臭氧池出水中门水平细菌的Shannon指数最小（0.63）, 多样性最低. 此外, 夏季深度处理阶段污水中门水平细菌的Shannon指数（2.14 ± 0.48）显著（P < 0.05）高于冬季的（0.72 ± 0.09）, 表明随着温度降低, 污水中门水平上细菌的多样性也随之下降. 图 2（c）显示, 夏季深度处理阶段污水中属水平细菌的Sobs指数为4 200 ± 85, 不同深度处理工艺出水中属水平上细菌的种数接近；冬季深度处理阶段污水中属水平细菌的Sobs指数为1 008 ± 314, 各工艺出水中属水平细菌的Sobs指数变化较大, 反硝化滤池出水中属水平细菌的丰富度最高（Sobs指数为1 322）, 较反硝化池进水（Sobs指数为890）明显上升. 此外, 夏季深度处理阶段污水中属水平细菌的Sobs指数显著（P < 0.05）高于冬季, 表明随着温度降低, 细菌的丰富度也降低. 图 2（d）显示, 夏季反硝化滤池出水中属水平细菌的Shannon指数最小（5.01）, 多样性最低；在冬季, 除深度处理阶段进水外, 臭氧接触池出水中属水平上细菌的Shannon指数最小（3.18）, 多样性最低. 此外, 夏季时深度处理阶段污水中属水平细菌的Shannon指数（5.32 ± 0.31）显著（P < 0.05）高于冬季的（Shannon指数为3.24 ± 0.44）, 表明随着温度降低, 属水平细菌的多样性也随之下降.

图 2

Fig. 2

1. S_DeniIn, 2. S_DeniOt, 3. S_ClothOt, 4. S_OzoneOt, 5. S_GACOt, 6. W_DeniIn, 7. W_DeniOt, 8. W_ClothOt, 9. W_OzoneOt, 10. W_GACOt 图 2 夏、冬两季深度处理阶段污水样品中微生物的α多样性 Fig. 2 The α diversity of microbial community in the wastewater samples of the advanced treatment process in summer and winter

深度处理阶段污水中门水平细菌群落结构见图 3. 对于已知分类的细菌：在反硝化滤池出水中, 变形菌门（Proteobacteria, 64.7% ~ 77.0%）是主要的优势菌门（相对丰度 > 5%）, 其次是拟杆菌门（Bacteroidetes, 11.5% ~ 16.2%）, 两个菌门相对丰度之和 > 76%；在滤布滤池出水中, Proteobacteria（52.1% ~ 52.6%）是主要的优势菌门, 其次是放线菌门（Actinobacteria, 5.1% ~ 6.6%）, 夏季时Bacteroidetes的相对丰度为6.1%, 但冬季仅为3.5%；在臭氧接触池出水中, Proteobacteria（54.4% ~ 61.3%）是主要的优势菌门, 夏季时Bacteroidetes相对丰度为8%, 冬季时Bacteroidetes相对丰度为3.8%. 夏季时Actinobacteria的相对丰度为4.6%, 冬季时相对丰度为5.8%；在活性炭滤池出水中, Proteobacteria（41.5% ~ 58.3%）是主要的优势菌门, 其次是Actinobacteria（6% ~ 6.5%）, 夏季时Bacteroidetes相对丰度为6.5%, 但冬季Bacteroidetes相对丰度 < 5%. 总体而言, Proteobacteria是深度处理阶段污水中最优势菌门, Zhang等^[14]调查了14座污水处理厂, 发现在污水处理过程中Proteobacteria是最主要的细菌类群, 污水生物脱氮中常见反硝化功能菌大多数属于Proteobacteria^[15]. Bacteroidetes和Actinobacteria是继Proteobacteria之后的优势菌门, Bacteroidetes能够将复杂大分子有机物降解为简单小分子有机物^[16], 主要存在于低氧或缺氧环境中^[17]；大多数Actinobacteria属于异养好氧菌, 具有很强的分解有机物的能力. 其它优势菌门（相对丰度 > 1%）还有厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）.

图 3

Fig. 3

1. S_DeniIn, 2. W_DeniIn, 3. S_DeniOt, 4. W_DeniOt, 5. S_ClothOt, 6. W_ClothOt, 7. S_OzoneOt, 8. W_OzoneOt, 9. S_GACOt, 10. W_GACOt 图 3 夏、冬两季深度处理阶段污水样品在门水平上的群落结构 Fig. 3 Microbial community structure at the phylum level in the wastewater samples of the advanced treatment process in summer and winter

深度处理阶段污水中属水平细菌群落结构见图 4. 对于已知分类的细菌：在夏冬两季节反硝化滤池出水中均为优势菌属（相对丰度 > 2%）的有脱氯单胞菌属（Dechloromonas, 4.1%~7.4%）, Dechloromonas是污水处理过程中一种重要的功能菌属, 具有反硝化^[18]和除磷功能^[19]. 田夏迪等^[20]研究了反硝化滤池稳定阶段滤料表面的生物膜中微生物的群落结构, 发现Dechloromonas占比为6.4%, 与本研究反硝化出水中的Dechloromonas相似. 其次是弓形杆菌属（Arcobacter, 3.0% ~ 8.3%）, Kristensen等^[21]研究发现Arcobacter是污水中常见的细菌属, 包含大量病原体, 如A.cryaerophilus和A.butzleri. 继Dechloromonas和Arcobacter之后是不动杆菌属（Acinetobacter, 2.3% ~ 3.0%）, Acinetobacter属于γ-变形菌纲, 可以适应广泛的温度和pH^[22], 部分不动杆菌被确定为人类机会性致病菌, 如鲍曼不动杆菌（A. baumannii）. 与反硝化滤池出水不同, 在夏冬两季深度处理阶段其它工艺出水中, 并没有发现具有明显优势的菌属.

图 4

Fig. 4

1. S_DeniIn, 2. W_DeniIn, 3. S_DeniOt, 4. W_DeniOt, 5. S_ClothOt, 6. W_ClothOt, 7. S_OzoneOt, 8. W_OzoneOt, 9. S_GACOt, 10. W_GACOt 图 4 夏、冬两季深度处理阶段污水样品在属水平的群落结构 Fig. 4 Microbial community structure at the genus level in the wastewater samples of the advanced treatment process in summer and winter

为揭示深度处理阶段不同处理单元进出水中细菌群落结构的差异, 基于Bray-Curtis距离对各污水样品中门水平和属水平的细菌群落结构进行了主坐标分析（PCoA）, 见图 5. 结果表明, 同一季节的滤布滤池出水、臭氧接触池出水和活性炭滤池出水中细菌群落倾向于聚为一类, 意味着这3个深度处理单元出水中细菌群落结构具有很强的相似性；反硝化滤池出水中的细菌群落结构与其它工艺出水中细菌群落结构存在明显差异. 此外, 冬季和夏季深度处理阶段污水中细菌群落倾向于各自聚为一类, 表明深度处理阶段污水中微生物群落结构具有显著的季节性差异（P < 0.05）.

图 5

Fig. 5

图 5 基于Bray-Curtis距离的深度处理阶段污水中细菌群落差异的主坐标分析 Fig. 5 Principal co-ordinates analysis based on Bray-Curtis distances of the bacterial community in wastewater samples of the advanced treatment process

在深度处理阶段各工艺出水中发现大量氮代谢功能基因（见图 6）. 其中与反硝化作用有关的功能基因包括：norB、nosZ、napB、nirK、norC和nirS等, 其中norB和nosZ的相对丰度较高. norB编码一氧化氮（NO）还原酶, 将反硝化过程中产生的细胞毒素NO转化成无毒的氧化亚氮（N₂O）. nosZ基因编码N₂O还原酶, 将N₂O还原为N₂, 常被用作检测可进行完全反硝化作用微生物的分子标记. 与氮异化还原有关的功能基因包括nrfA、nrfH、nirB和nirD等, 其中nirB的相对丰度最高, 其编码亚硝酸盐还原酶可减少细胞中亚硝态氮的含量, 避免因亚硝酸盐积累对细菌产生危害^[23]. 与氮同化还原有关的功能基因包括nasA、nirA、NR、nasB和narB等, 其中nasA丰度最高, nasA可以编码硝酸盐还原酶. 与硝化作用有关的功能基因包括hao、pmoA-amoA和pmoA-amoC等, 但相对丰度都较低. 此外, 与冬季不同, 在夏季样品中发现了与固氮作用有关的功能基因, 包括anfG、nifD、nifH、nifK、vnfD、vnfK和vnfG等.

图 6

Fig. 6

a1. nirB, a2. nirD, a3. narG-narZ-nxrA, a4. narI-narV, a5. nrfA, a6. nrfH, a7. nasB, a8. nirA, a9. narB, a10. nasA, a11. napA, a12. napB, a13. nirK, a14. nosZ, a15. norC, a16. norB, a17. nirS, a18. anfG, a19. nifD, a20. nifH, a21. nifK, a22. vnfD, a23. vnfK, a24. vnfG, a25. pmoA-amoA, a26. pmoC-amoC, a27. hao, a28. pmoB-amoB, a29. narH-narY-nxrB；b1. nrfA, b2. nrfH, b3. nirB, b4. nirD, b5. nasA, b6. nirA, b7. NR, b8. nasB, b9. narB, b10. narH-narY-nxrB, b11. narG-narZ-nxrA, b12. narI-narV, b13. napB, b14. napA, b15. nosZ, b16. nirK, b17. nirS, b18. norB, b19. norC, b20. hao, b21. pmoA-amoA, b22. pmoB-amoB, b23. pmoC-amoC 图 6 夏季和冬季各工艺段出水中氮循环相关基因丰度 Fig. 6 Abundance of the genes related to nitrogen cycling in summer samples and winter samples

反硝化滤池出水中氮代谢功能基因的丰度显著高于其它工艺出水中氮代谢功能基因的丰度（P < 0.05）. 与其它工艺出水相比, 反硝化滤池出水中的细菌表现出更大的脱氮潜力, 推测与反硝化滤池是脱氮作用主要发生场所有关. 然而, 除反硝化滤池出水外, 其它深度处理工艺的出水中同样发现了与氮代谢功能基因有关的, 意味着深度处理阶段污水中的细菌具有持续脱氮的潜力. 当这些细菌随尾水进入受纳水体中, 对环境中氮循环过程也将产生影响, 污水处理厂可以被视为环境脱氮菌储存库之一.

此外, 与臭氧接触池进水相比, 夏冬两季臭氧接触池出水中与氮异化还原有关的narZ、narV和nirB以及与氮同化还原有关的nasA丰度上升, 另外与反硝化有关的nirK和nosZ等丰度也有一定程度上升. 这可能是由于臭氧对水中细菌也具备毒性, 含氮有机物可能在细菌细胞被臭氧破坏的过程中被释放到水中, 接着被氧化成硝态氮^[24]. 硝态氮的含量上升对细菌产生选择作用, 编码氮还原酶的基因丰度可能因此上升. 有研究发现经过臭氧氧化细胞中的有机物也被释放到水中, 可以为反硝化提供碳源, 因此反硝化能力得到提高^[25]. 在本研究中, 臭氧接触池出水中反硝化有关的基因丰度增加也表明了臭氧处理可能促进生物脱氮.

深度处理阶段的碳水化合物主要是难降解有机物和细菌细胞体中的有机质, 后者是细菌维持自身生命活动所需的重要底物. 如图 7所示, 深度处理阶段各工艺出水中的CAZymes主要为糖基转移酶类（glycosyl transferases, GTs）和糖苷水解酶类（glycoside hydrolases, GHs）, 而碳水化合物酯酶类（carbohydrate esterases, CEs）、碳水化合物辅助酶类（auxiliary activities, AAs）、碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding modules, CBMs）和多糖裂解酶（polysaccharide lyases, PLs）占比较少. GHs是细菌碳水化合物代谢过程中的关键酶, 作用于各种糖苷或寡糖使糖苷键水解^[26], 对细菌抗生素、肽和氨基酸等合成有重要作用. GTs通过糖苷键的形成催化受体分子加上糖基, 是糖基化的关键酶类, 而糖基化产物不仅是构建细胞壁的组分, 也可以与多种受体连接实现调节生物活性和分子识别等生物学功能^[27].

图 7

Fig. 7

红色表示相对丰度高, 蓝色表示相对丰度低 图 7 夏季和冬季样品中Class层级CAZymes的分布 Fig. 7 Class level of CAZymes in summer samples and winter samples

目前CAZy数据库中在家族（Family和SubFamily）层级水平分类中包含116种GTs、386种GHs、20种CEs、85种PLs、17种AAs和94种CBMs. 通过对CAZymes在Family层级上进行注释, 各样品中CAZymes种类数量见表 3. 在深度处理阶段发现多种CAZymes, 表明深度处理系统污水中细菌可能对多种碳水化合物具有较强的降解潜力, 这对细菌的增殖和净化功能具有重要意义.

表 3 (Table 3)

表 3 不同单元进出水中CAZymes在Family/SubFamily层级种类数量 Table 3 Number of CAZymes at Family/SubFamily level in the influent and effluent of different processes 项目 季节 GTs GHs CEs CBMs AAs PLs 总和 反硝化滤池进水 冬季 86 268 16 82 21 0 451 夏季 96 264 16 52 19 61 508 反硝化滤池出水 冬季 85 256 15 59 20 47 482 夏季 89 257 16 48 20 63 431 滤布滤池出水 冬季 78 236 15 55 20 13 406 夏季 88 251 16 48 19 59 423 臭氧接触池出水 冬季 80 270 16 56 19 21 427 夏季 90 256 16 46 19 69 494 活性炭滤池出水 冬季 85 257 14 57 18 30 434 夏季 92 262 16 48 20 72 439

表 3 不同单元进出水中CAZymes在Family/SubFamily层级种类数量 Table 3 Number of CAZymes at Family/SubFamily level in the influent and effluent of different processes

各样品中高丰度CAZymes家族（相对丰度 > 1%）的分布如图 8所示. 夏季样本共鉴定出17种高丰度CAZymes家族, 分别属于8个GTs、3个GHs、4个CEs和2个AAs. 冬季样本中共鉴定出18种高丰度CAZymes家族, 包括7个GTs、5个GHs、4个CEs、1个PLs和1个CBMs. 其中GT4是深度处理阶段污水中相对丰度最高的CAZymes家族. GT4家族中包含了多种糖苷转移酶, 如葡萄糖转移酶, 可以提高细菌对复杂碳水化合物的降解能力. GT4家族主要由变形菌分泌, 而变形菌门是各工艺出水中的优势菌门, 可能是GT4在深度处理阶段中相对丰度最高的原因.

图 8

Fig. 8

红色表示相对丰度高, 蓝色表示相对丰度低；最左侧色柱表示CAZymes的类型 图 8 夏季和冬季样品Family/SubFamily层级的CAZymes分布 Fig. 8 Family/SubFamily level of CAZymes in summer samples and winter samples

（1）细菌α多样性分析结果表明, 夏季时深度处理阶段不同工艺出水中细菌的丰富度变化较小, 冬季时变化较大；不同深度处理工艺出水中细菌的多样性存在差异, 臭氧接触池出水中细菌的多样性最低；温度影响了深度处理阶段污水中细菌的丰富度和多样性, 随着温度降低, 细菌的丰富度和多样性也随之下降.

（2）细菌群落结构分析表明, 不同季节深度处理阶段污水中的细菌群落结构变化较大, 反硝化滤池出水中细菌群落结构与其它样品存在较大差异. 门水平上, 变形菌门是深度处理阶段污水中的最优势菌门（相对丰度 > 5%）, 其次是拟杆菌门. 属水平上, 反硝化滤池出水中主要菌属是脱氯单胞菌、弓形杆菌和不动杆菌, 而在夏冬两季深度处理阶段其它工艺出水中, 并没有发现具有明显优势的菌属（相对丰度 > 2%）.

（3）在深度处理阶段各工艺出水中共发现了29种与氮代谢有关的功能基因, 同时在各工艺出水中均鉴定出反硝化功能基因, 其中反硝化滤池出水中氮代谢功能基因相对丰度最高, 表明深度处理阶段污水中的细菌具有持续脱氮的潜力.

（4）基于Class与Family/SubFamily层级的CAZy分析显示, 深度处理阶段出水中细菌可以分泌多种碳水化合物活性酶, 其中, GHs和GTs是主要的碳水化合物活性酶, 对碳水化合物具有较大的降解潜力.