2024, Vol. 45
2. 湖南浩美安全环保科技有限公司, 长沙 410100;
3. 昆明理工大学环境科学与工程学院, 昆明 650504;
4. 中南大学资源加工与生物工程学院, 长沙 410083
2. Hunan Hermes Safe Environmental Protection Science Co., Ltd., Changsha 410100, China;
3. Faculty of Environmental Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650504, China;
4. School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, China
2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》[1]显示, 耕地土壤污染点位超标率为19.4%, 主要污染物镉（Cd）和砷（As）点位超标率分别达到7.0%和2.7%, 且《2021中国生态环境状况公报》[2]报道影响农用地土壤环境质量的主要污染物是重金属, 其中Cd为首要污染物.重金属Cd和类金属As具有迁移能力强、降解性差、生物毒性大等特点[3], 进入土壤后造成土壤污染和降低土壤质量, 进而增大稻米等农作物重金属污染风险[4].因此, 能否降低土壤Cd和As的迁移性和生物毒性, 提升土壤质量, 降低稻米等农作物中Cd和As含量, 以符合《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 2762-2022）[5]要求, 是亟需解决的环境问题.
硅（Si）是土壤介质中丰度最高的元素, 能缓解不利环境给水稻带来的迫害.例如, 施用硅肥（主要成分SiO2）能够增强水稻的抗倒伏性[6]、抗热和抗旱能力[7], 以及对稻瘟病、褐斑病、叶鞘腐败病和螟虫等病虫害的抵抗力[8].在缓解Cd和As毒害方面, 已有研究发现硅肥对植株Cd的累积抑制效果优于硒肥[9]；硅肥能有效降低糙米中Cd的含量, 降幅可达到39.82%[10]；富Si的土壤调理剂（稻壳灰, 1%）能将糙米中无机As含量降低31.0%~54.0%[11].同时, 将谷壳灰硅肥和矿物硅肥施用到单一As污染土壤, 谷壳灰硅肥降低水稻植株无机As累积的效果较矿物硅肥更显著, 对水稻的产量也有明显促进作用[12].水稻喜Si且植株累积大量的Si, 有研究表明, 水稻谷壳中约含有10.0%以上的Si[13], 将谷壳有氧燃烧得到的谷壳灰中Si含量远高于常规硅肥, 相比由矿物制备的硅肥, 谷壳灰制备的硅肥更适合长期使用, 它减少了其他离子的加入, 对土壤无二次伤害[14].
土壤酶系统主要控制土壤中碳（C）、氮（N）和（P）等营养元素的转化, 土壤酶活性反映了各营养元素代谢活动的强弱[15].植物根际微生物数量庞大, 参与土壤中各种物质转化过程, 根际微生物是土壤生态系统动态平衡的重要调节者.因此, 土壤酶活性和微生物多样性是评价土壤肥力和土壤健康的重要指标.有研究表明, 土壤中施加硅肥后（矿物硅肥）, 不仅能显著改变土壤的理化性质, 也能改变植物根际分泌物, 影响根际酶和微生物的群落结构, 进而对植物生理性状产生影响[16].
针对Cd和As复合污染稻田土壤, 谷壳灰硅肥的施用研究尚在不断深入阶段, 本课题组在文献[17]中围绕谷壳灰硅肥制备和降低不同水稻品种Cd和As累积开展了研究.本研究施用由谷壳灰制备的硅肥, 开展水稻盆栽试验, 分析谷壳灰硅肥不同施用量下水稻根际土壤基本理化性质、Cd和As的生物有效性、土壤酶活性以及微生物群落结构的变化, 探究谷壳灰硅肥影响水稻根际微环境、改善土壤质量的效应, 以期为Cd和As复合污染稻田土壤的治理提供理论基础和技术参考.
1 材料与方法 1.1 供试土壤与材料按文献[17]有氧燃烧和稀硝酸浸洗制备谷壳灰硅肥.供试土壤经由添加分析纯Cd（NO3）2·4H2O、Na2HAsO4·7H2O（国药集团化学试剂有限公司）熟化后制备.供试水稻品种为黄华占（常规稻）, 由湖南农丰种业有限公司生产.土壤和谷壳灰硅肥基本理化性质及重金属含量见表 1.
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表 1 供试材料基本理化性质1） Table 1 Basic physical and chemical properties of the test materials |
1.2 试验设计
本研究采用水稻盆栽试验, 该试验地点在中南林业科技大学校内水稻种植基地, 自然条件符合水稻生长.取无污染土壤（湖南宁乡, 东经111°53′, 北纬27°55′）自然风干去杂物后, 装入圆柱形塑料桶（内径200 mm, 高240 mm）, 每桶装土3.5 kg, 然后外源添加分析纯Cd（NO3）2·4H2O和Na2HAsO4·7H2O至土壤重金属污染中重度水平（含量见表 1）, 淹水熟化培养2个月.谷壳灰硅肥按质量比0、0.1%、0.2%、0.5%和1.0%分别加入, 依次标记为CK、T1、T2、T3和T4, 每个处理重复3次, 搅拌均匀后, 继续淹水培育15 d, 水层深度为2 cm.2020年7月14日水稻秧苗移栽前3 d, 向盆栽土壤中加入基肥尿素（按N计算）0.28 g·kg-1、（NH4）3PO4（按P2O5计算）0.21 g·kg-1和K2CO3（按K2O计算）0.22 g·kg-1.水稻秧苗提前在无重金属污染稻田育苗, 移栽时选取长势一致的五叶一心禾苗, 一盆一穴2株.水稻种植过程中自来水灌溉, 淹水培育, 水层2 cm, 并根据水稻长势进行农药喷施和基肥补施.
分别在水稻分蘖期（8月23日）、孕穗期（9月26日）、灌浆期（10月13日）和成熟期（11月11日）, 采集水稻植株和根际土壤.水稻植株用超纯水洗净, 105℃杀青后70℃烘干至恒重并粉碎待测.根际土壤, 部分自然风干, 去杂质、碾磨过10目和100目筛, 用于土壤基本理化性质和土壤酶的测定；部分新鲜土壤（成熟期）, 无菌采集、干冰保存和转运, 用于土壤微生物多样性的分析.
1.3 样品分析和测试土壤pH值用酸度计（PHS-3C, 雷磁）测定, 固液比为1∶2.5、有机质含量用水合热重铬酸钾氧化-比色法测定、土壤Cd总量采用王水-高氯酸消煮[18], 生物有效态Cd采用美国EPA毒性浸提方法（toxicity characteristic leaching procedure, TCLP）[19]冰醋酸浸提, 浸提液中Cd含量采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP 6300, Thermo Fisher, 美国）测定.土壤As总量采用（1+1）王水水浴法消解[20], 生物有效态As同样采用TCLP法冰醋酸浸提, 浸提液中As浓度稀释后使用原子荧光分光光度计（AFS-8220, 北京吉天仪器有限公司, 中国）测定.土壤有效态Si含量采用柠檬酸浸提-硅钼蓝比色法（0.025 mol·L-1 C6H8O7 柠檬酸）[18], 在650 nm波长下用紫外分光光度计（UV-1700, 岛津, 日本）测定.水稻糙米中Cd含量采用干灰法消解, 0.5 mol·L-1 HNO3浸提[21], 石墨炉原子吸收分光光度计（iCE-3500, Thermo Fisher, 美国）测定.糙米总As含量采用干灰化法消解6 mol·L-1 HCl浸提、无机As含量使用0.15 mol·L-1 HNO3溶液90℃热浸提[22], 液相色谱-原子荧光光谱联用仪测定（LC-AFS 6500, 北京海光仪器有限公司, 中国）.所有样品分析过程中以国家标准物质土壤[GBW（E）-070009]和大米标准物质[GBW（E）-100354]进行质量控制, 同时做空白试验.土壤Cd和As回收率分别为98.6%~100.1%和98.7%~104.0%, 糙米Cd和总As的回收率分别为99.3%~100.6%和98.4%~101.2%.
土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和土壤脱氢酶, 使用风干土壤、市售试剂盒（南京建成生物工程研究所, 南京, 中国）分析, 在紫外分光光度计对应578、540、450和485 nm波长处测量.试剂盒分析准确率为96.0%~105.0%.
土壤微生物多样性, 采用NucleoSpin®96 Soil提取土壤DNA, -20℃保存.采用正向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）进行细菌V3~V4可变区的PCR扩增（9902, 96 well PCR仪, 上海吉泰依科赛生物科技有限公司）.PCR扩增反应条件为：95℃预变性5 min；25个循环（95℃, 30 s；50℃, 30 s；72℃, 40 s；72℃, 7 min）.PCR扩增产物经过纯化、定量和均一化形成测序文库, 质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500（美国Illumina公司）进行测序.
1.4 数据处理采用Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0进行数据统计分析, 文中数据表示为平均值±标准偏差（n=3）.各处理间差异使用one-way ANOVA with Duncan's multiple range检验（P < 0.05）.土壤微生物群落结构分析、主成分分析（PCA）和热图等在美吉生物云平台完成, Mantel测试分析在厦门大学合作的云平台上完成.Origin 2018软件进行数据绘图.
2 结果与分析 2.1 谷壳灰硅肥对土壤基本理化性质及镉砷生物有效性的影响由图 1（a）可知, 与分蘖期水稻根际土壤pH相比, 随生育期延长, 土壤pH呈增大趋势, 增大了0.15~0.24个单位, 各处理的灌浆期和成熟期土壤pH达到显著差异（P < 0.05）；随谷壳灰硅肥施用量增大（0.1%~1.0%）, 各处理土壤pH呈增大趋势, 与对照CK处理相比, 增大了0.04~0.24个单位, 且在T4处理的孕穗期和T2、T4处理的灌浆期差异显著（P < 0.05）.由图 1（b）可知, 随生育期延长, 水稻根际土壤有机质含量无显著变化；与对照CK处理相比, T1~T4处理（0.1%~1.0%）土壤有机质含量在孕穗期时显著降低了8.3%~17.7%（P < 0.05）, 其他时期差异不显著.分析土壤有效Si含量[图 1（c）]发现, 随生育期延长, 各处理整体呈现降低趋势, 与分蘖期相比, T4处理的水稻孕穗期、灌浆期和成熟期显著降低（P < 0.05）；而与对照CK处理相比, T2、T3和T4处理水稻根际土壤有效Si含量显著增大了44.2%~97.5%（P < 0.05）.
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不同小写字母表示各处理生育期间的差异显著（P < 0.05）, *表示T1~T4处理与CK差异显著（*表示P < 0.05, **表示P < 0.01） 图 1 施用谷壳灰硅肥对水稻4个生育期土壤理化性质的影响 Fig. 1 Effect of application silica fertilizer-husk ash on soil physical and chemical properties at four growth stage of rice |
由图 2（a）可知, 土壤Cd和As的生物有效性随水稻生长和谷壳灰硅肥的施用发生改变.随生育期延长, 水稻根际土壤TCLP-Cd含量整体呈现降低趋势, 与分蘖期相比, 降低了0.8%~7.7%；与对照CK处理相比, T1~T4处理（0.1%~1.0%）土壤TCLP-Cd含量显著降低了16.2%~21.4%（P < 0.05）.分析元素As, 图 2（b）显示水稻根际土壤TCLP-As含量, 随水稻生育期延长呈现孕穗期增大而灌浆期和成熟期小幅回落的趋势, 与分蘖期相比, T4处理显著降低了12.4%（P < 0.05）；与CK处理相比, T1~T4处理（0.1%~1.0%）水稻根际土壤TCLP-As含量降低, 且T2~T4处理土壤TCLP-As含量显著降低了16.0%~24.9%（P < 0.05）.由此可知, 随着水稻生长, 土壤Cd和As的生物有效性逐渐降低, 且谷壳灰硅肥施用量的增大能更好地降低土壤Cd和As的生物有效性, 尤其是T4处理.
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不同小写字母表示各处理生育期间的差异显著（P < 0.05）, *表示T1~T4处理与CK差异显著（*表示P < 0.05） 图 2 施用谷壳灰硅肥对水稻4个生育期土壤TCLP提取态Cd和As的影响 Fig. 2 Effects of application of silica fertilizer-husk ash on soil TCLP-Cd and TCLP-As at four growth stages of rice |
由图 3（a）可知, 随生育期延长, 水稻根际土壤脲酶活性呈降低趋势, 成熟期脲酶活性相比于分蘖期降低了5.0%~19.3%, 其中T1, T3和T4处理差异显著（P < 0.05）；随谷壳灰硅肥施用量增大（0.1%~1.0%）, 各处理土壤脲酶活性增大, 与CK处理相比增大了0.1%~9.4%, 但仅在T3处理的分蘖期与对照差异显著.由图 3（b）可知, 随生育期延长, 土壤蔗糖酶活性呈先增加后小幅降低趋势, 但并不显著；随谷壳灰硅肥施用量增大（0.1%~1.0%）, 各处理土壤蔗糖酶活性增大, 与CK处理相比, 增大了1.5%~22.6%, 其中T3和T4处理在孕穗期和成熟期差异显著（P < 0.05）.分析土壤酸性磷酸酶活性[图 3（c）], 与分蘖期相比, 随生育期延长显著降低了22.6%~47.3%（P < 0.05）；谷壳灰硅肥施用（0.1%~1.0%）则增大了孕穗期和成熟期土壤酸性磷酸酶活性, 分别增大了4.8%~63.4%和0.2%~24.5%（P < 0.05）.由图 3（d）可知, 随生育期延长, 水稻根际土壤脱氢酶活性呈先降低后增大趋势, 且在T1、T2和T3处理中表现出显著差异（P < 0.05）；同时, 谷壳灰硅肥的施用能显著增大各处理各生育期土壤脱氢酶活性（P < 0.05）, 与CK处理相比, 谷壳灰硅肥各处理（0.1%~1.0%）可增大6.7%~224.1%（P < 0.05）.综上分析, 水稻持续生长, 其根际土壤酶活性呈现降低趋势, 谷壳灰硅肥的施用能够提高水稻根际酶活性, 尤其是在孕穗期和成熟期.
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不同小写字母表示各处理生育期间的差异显著（P < 0.05）, *表示T1~T4处理与CK差异显著（*表示P < 0.05；**表示P < 0.01） 图 3 施用谷壳灰硅肥对水稻4个生育期土壤酶活性的影响 Fig. 3 Effect of application of silica fertilizer-husk ash on soil enzyme activity at four growth stages of rice |
由表 2可知, 与CK处理相比, 水稻成熟期谷壳灰硅肥各处理的土壤微生物OTUs数量和Shannon多样性指数无显著差异, ACE和Chao指数无显著差异, 表明谷壳灰硅肥对土壤中微生物群落的丰富度和多样性无明显影响.
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表 2 施用谷壳灰硅肥对土壤微生物α-多样性的影响1） Table 2 Effect of application of silica fertilizer-husk ash on soil microbial α-diversity |
基于门分类水平, 采用主成分分析（PCA）研究施用不同量谷壳灰硅肥对土壤微生物β-多样性的影响（图 4）.PC轴1和2的贡献率分别为60.65%和19.02%, 累积贡献率为79.67%, 大于50%, 表明PCA可有效解释不同施加量下土壤微生物群落结构的相似性.同时, 与CK处理相比, T1、T3和T4处理下土壤微生物群落结构具有显著差异, 且T2、T3和T4处理之间也具有显著差异.
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图 4 施用谷壳灰硅肥对土壤微生物β-多样性的影响 Fig. 4 Effect of application of silica fertilizer-husk ash on soil microbial β-diversity |
由图 5（a）可知, 成熟期时土壤中的微生物主要隶属于变形菌门（Proteobacteria, 18.66%~20.11%, 相对丰度, 下同）、放线菌门（Actinobacteriota, 14.93%~16.21%）、酸杆菌门（Acidobacteriota, 12.72%~16.74%）、绿弯菌门（Chloroflexi, 12.53%~16.24%）、厚壁菌门（Firmicutes, 6.02%~8.86%）、拟杆菌门（Bacteroidota, 4.25%~5.97%）、粘液菌门（Myxococcota, 4.53%~5.00%）、浮游菌门（Planctomycetota, 2.26%~3.65%）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota, 2.90%~3.47%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota, 2.73%~3.48%）和帕氏菌门（Patescibacteria, 2.00%~2.95%）等, 表明上述微生物是土壤中主要优势物种.与CK处理相比, T1~T4处理中土壤厚壁菌门、拟杆菌门和粘液菌门等门水平物种的相对丰度增加, 其中T3处理丰度增幅最大；而绿弯菌门和芽单胞菌门等门水平物种的相对丰度降低.
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（a）门水平相对丰度, （b）属水平相对丰度 图 5 谷壳灰硅肥处理下土壤主要门和属水平物种分布 Fig. 5 Distribution of main microorganisms at phylum and genus levels under silica fertilizer-husk ash treatment |
从属水平可进一步看出[图 5（b）], 谷壳灰硅肥施用可影响成熟期时土壤中微生物群落的组成.T1~T4处理中属水平微生物相对丰度变化不一, 其中在T4处理下, 厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）、科里杆菌（Koribacter）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、铁氧化属细菌（Sideroxydans）、厌氧绳菌属（Anaerolinea）、链霉菌属（Streptomyces）、类诺卡氏属（Nocardioides）和氢化菌属（Hydrogenispora）等微生物的相对丰度较对照CK处理升高；而紫杉霉菌（Vicinamibacterales）、独生杆菌（Solibacter）、黄杆菌（Xanthobacteraceae）、酸杆菌（Acidobacteriales）和甲基孢囊菌属（Methylocystis）等微生物的相对丰度降低.施加谷壳灰硅肥后各处理水稻根际土壤厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、氢化菌属（Hydrogenispora）和类诺卡氏属（Nocardioides）等相对丰度均高于CK处理, 这表明施加谷壳灰硅肥可促进以上微生物的繁殖.
2.4 谷壳灰硅肥对水稻糙米镉和无机砷含量的影响由图 6可知, 与对照CK处理相比, 随谷壳灰硅肥施用量（0.1%~1.0%）增大, 水稻糙米Cd含量显著降低, 降幅为29.3%~89.7%（P < 0.05）, 糙米总As含量降低了7.77%~42.31%, 无机As含量也降低了17.23%~44.49%（P < 0.05）.T3和T4处理的糙米ω（Cd）降低到0.18 mg·kg-1和0.07 mg·kg-1, 糙米ω（无机As）降低到0.34 mg·kg-1和0.31 mg·kg-1, 符合《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 2762-2022）对糙米Cd和无机As限量的要求.
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不同小写字母表示各处理生育期间的差异显著（P < 0.05）, （a）中0.2 mg·kg-1表示糙米Cd的食品安全限量值, （b）中0.35 mg·kg-1表示糙米无机As的食品安全限量值 图 6 施加谷壳灰硅肥对水稻糙米中Cd、As和无机As的影响 Fig. 6 Effect of application silica fertilizer-husk ash on Cd, As, and inorganic As in brown rice |
利用偏Mantel检验, 对糙米中Cd和无机As含量与土壤理化性质和酶活性进行相关性分析（图 7）.由图可知, 糙米Cd含量与土壤pH呈显著负相关关系（P < 0.05）, 糙米无机As含量与土壤TCLP-As含量呈极显著正相关关系, 与脱氢酶活性呈极显著负相关关系（P < 0.01）, 表明土壤pH和脱氢酶活性越高, 糙米Cd和无机As含量越低, 土壤TCLP-As含量越小, 糙米无机As含量越低；土壤有效Si含量与土壤TCLP-Cd及TCLP-As呈显著负相关关系（P < 0.05）, 表明土壤有效Si含量越大, 土壤TCLP-Cd和TCLP-As含量越小；土壤TCLP-Cd和TCLP-As含量与土壤酸性磷酸酶、蔗糖酶和脱氢酶活性均呈显著负相关关系（P < 0.05）, 表明土壤TCLP-Cd和TCLP-As含量越小, 土壤酸性磷酸酶、蔗糖酶和脱氢酶活性越大.上述相关性显示, 谷壳灰硅肥可能是通过提高土壤pH和有效Si含量, 降低土壤有效态Cd和As的含量, 进而促进土壤酶活性的增大和降低水稻对Cd和As的积累.
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1.酸性磷酸酶, 2.蔗糖酶, 3.脱氢酶, 4.脲酶, 5.有机质, 6.土壤有效硅, 7. pH, 8. TCLP-Cd, 9. TCLP-As 图 7 糙米中Cd和无机As与土壤指标的相关性 Fig. 7 Correlations between Cd and inorganic As in brown rice and soil indexes |
随水稻生育期的延长, 水稻根际土壤pH有所升高, 这可能是因为酸性土壤淹水后由于铵盐的形成, 或是在淹水厌气条件下形成的还原性碳酸铁、锰水解而产生了氢氧化亚铁和氢氧化亚锰, 降低了土壤溶液中H+的浓度[23].施用谷壳灰硅肥后, 土壤pH值进一步增大, 尤其是T2和T4处理差异显著[图 1（a）], 这是因为谷壳灰硅肥pH值为7.39（表 1）, 施入土壤后可中和土壤酸度.随着水稻生育期的延长, 根际土壤有效Si的含量呈下降趋势, 这是因为水稻是一种喜Si作物, 生长过程中需要吸收大量的Si来维持正常的生长发育[24], 同时, 土壤所含Si尽管不断被淋溶渗漏、硅酸盐被不断地置换出来, 但土壤中所含Si在水稻生长过程中不能及时补偿[25].随着谷壳灰硅肥施用量的增大, 土壤有效Si含量上升[图 1（c）], 这是因为外源施用的谷壳灰硅肥是富Si物质（表 1）, 增大了土壤有效Si含量.
施用谷壳灰硅肥改变了土壤中有效态Cd、As的变化趋势, 随着施用量的增大, 有效态Cd、As含量在逐渐降低（图 2）.对于根际土壤有效态Cd含量的降低, 一方面是因为谷壳灰硅肥材料疏松多孔、比表面积大[17], 有利于吸附土壤Cd；且随着施用量的增大, 土壤pH升高, 使土壤颗粒表面对Cd2+的吸附力由静电吸附变为结合力更强的专性吸附, 从而使土壤溶液中有效态Cd的含量下降[26]；另外土壤pH的升高会导致土壤溶液中铁、铝、镁等金属离子的浓度减小, 使土壤有利于吸附Cd2+, 致使有效态Cd含量降低[27]；另一方面是因为谷壳灰硅肥不断向土壤中释放Si和增大了土壤有效Si含量, 土壤中可溶性Cd与Si发生化学反应生成难溶的硅酸盐沉淀, 从而改变土壤中Cd的赋存形态, 使得Cd的酸提取态含量降低, 难溶的有机态和残渣态含量增大[17], 进而降低了Cd的生物有效性.此外, 土壤有效Si含量的增加可显著降低有效态Cd的含量, 限制Cd在土壤中的迁移扩散, 且在酸性土壤中, 硅酸通过聚合形成硅酸凝胶, 硅凝胶在酸性环境内产生负电荷, 进而增加了土壤的负电荷表面, 促进对Cd的吸附[28].而对于As, 有研究发现pH的升高会对土壤中As的活性产生促进作用[29], 而本研究中施加谷壳灰硅肥后土壤pH的增大并未增大As生物有效性, 原因可能是：首先, 谷壳灰硅肥结构上的特性, 对As也具有物理吸附效应；其次, 土壤有效Si含量增大, 会增加特异性吸附态和无定型铁铝氧化物结合态As含量, 减少了结晶型铁铝氧化物结合态和残留态As含量[30], 因此土壤中有效态As含量降低；此外, 本研究中水稻灌浆期和成熟期土壤有效态As含量低于孕穗期原因可能还在于, 相比于水稻营养生长阶段, 水稻生殖生长阶段根系生物量大, 根表铁膜已经形成且逐渐老化变厚, 吸收和附着As的位置充足, 对As具有较强的富集能力, 谷壳灰硅肥的施用, 促进了水稻根系的生长以及根表铁膜的形成[31], 因此, 生长后期As进一步被根表铁膜富集, 土壤中有效态As的含量降幅更大.
3.2 谷壳灰硅肥改善土壤质量且降低糙米镉砷含量土壤酶来源于根系分泌物、凋落物和微生物活动, 是各种生化过程和养分循环的活性成分, 是连接土壤微生物和土壤化学过程的重要媒介[32], 提高土壤酶活性可以改善土壤结构, 促进养分的积累、转化和保持.在本研究中4种土壤酶活性整体有所增大（图 3）, 可能是因为较高含量的重金属积累会导致水稻土中土壤酶活性下降[33], 例如, 土壤中Cd2+可以与脱氢酶分子中的活性部位——巯基和含咪唑的配位体等结合, 形成比较稳定的络合物, 从而与底物发生竞争作用, 抑制酶活性[34], 而谷壳灰硅肥的施用降低了土壤中有效态Cd、As含量（图 2）, 缓解了重金属的毒害效应, 土壤酶活性就得到提升.另外, 谷壳灰具有一定的孔隙度和较大表面积, 能为土壤微生物提供充足的氧气、水分以及栖息地, 有利于微生物的生长和繁殖, 促进酶的活性提升[17, 35].
微生物群落结构是土壤物理和化学变化过程的重要表现, 也是评估土壤生态功能和肥力的重要指标.本研究结果表明施加谷壳灰硅肥对土壤中微生物群落的α-多样性的影响较小, 这与Ma等[35]研究发现在土壤中施加不同剂量硅肥对微生物多样性影响不大的结论一致.基于PCA分析表明谷壳灰硅肥可影响土壤微生物群落的β-多样性, 且不同添加量的影响差异显著（图 4）, 土壤中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度有所增加（图 5）, 且在T3处理时丰度增幅最大.
土壤蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶参与土壤中C、N、P的养分循环[35], 生物体中绝大多数氧化还原反应都是在脱氢酶的催化下进行[36], 同时土壤酶活性受到多种环境因子的制约.施加谷壳灰硅肥后降低了土壤重金属生物有效态含量, 促进了土壤酶和微生物的生长及代谢活动, 本研究发现施Si可促进厚壁菌门的相对丰度增加（图 5）, 且Zhang等[37]发现水稻土中As含量与厚壁菌门的相对丰度呈显著负相关关系, 此类门水平微生物携带As解毒基因, 能尽量减少毒害或受毒后迅速恢复生长, 对重金属有一定的耐受性, 这表明施加谷壳灰硅肥能促进特定门水平微生物的生长, 并有利于降低土壤中As毒害从而促进水稻健康生长.土壤酶活性与微生物群落结构的变化均可显示谷壳灰硅肥对土壤环境健康具有促进作用.
谷壳灰硅肥的施用均不同程度地降低水稻糙米中Cd和无机As的含量（图 6）, 这可能是因为谷壳灰硅肥的施用提供了大量活性Si[图 1（c）], 降低了土壤生物有效态Cd和As的含量（图 2和图 7）.此外, 施Si除提高水稻抵抗各种环境胁迫的能力[38]外, 还可在根系细胞壁中与Cd形成Si-Cd复合物, 有效降低Cd向地上部的转运, 降低糙米中Cd含量[32]；Si与As（Ⅲ）共用水通道蛋白, 施Si后, Si与As的竞争作用降低了水稻对As（Ⅲ）的转运, 且施Si增大了水稻根系量、增大了根表铁膜对As的富集, 最终减少水稻地上部As的积累[31].本研究中T3和T4处理能使糙米Cd和无机As同时达到低于《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 2762-2022）中的限定值[ω（Cd） < 0.2 mg·kg-1, ω（无机As） < 0.35 mg·kg-1）]的要求, 从而实现安全种植.
4 结论（1）施用谷壳灰硅肥增大了水稻根际土壤pH值0.04~0.24个单位和有效Si含量44.2%~97.5%, 土壤有效态Cd和有效态As含量则分别降低了16.2%~21.4%和16.0%~24.9%.
（2）随谷壳灰硅肥施用量的增大各生育期土壤酶活性增大, 其中土壤脲酶、蔗糖酶和脱氢酶活性分别增大0.1%~9.4%、6.3%~145.7%和6.7%~224.1%, 土壤酸性磷酸酶活性则在孕穗期和成熟期分别增大4.8%~63.4%和0.2%~24.5%.
（3）施用谷壳灰硅肥不影响土壤微生物群落的α-多样性, 对微生物群落的β-多样性产生显著影响, 可促进微生物的生长.
（4）当谷壳灰硅肥施加量为0.5%（T3处理）和1%（T4处理）时水稻糙米ω（Cd） < 0.2 mg·kg-1, 糙米ω（无机As） < 0.35 mg·kg-1.
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