2024, Vol. 45
2. 中国农业科学院农田灌溉研究所, 新乡 453002;
3. 中国农业科学院农业水资源高效安全利用重点开放实验室, 新乡 453002
, LIU Chun-cheng2,3 , HU Chao2,3 , CUI Er-ping2,3 , LI Zhong-yang2,3 , FAN Xiang-yang2,3 , CUI Bing-jian2,3
2. Institute of Farmland Irrigation, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xinxiang 453002, China;
3. Key Laboratory of High-efficient and Safe Utilization of Agriculture Water Resources, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xinxiang 453002, China
再生水作为替代水源用于农业灌溉, 不仅可以有效缓解水资源短缺压力和增加水资源供给, 还可节约水肥和减少水污染问题.由于常规水资源的短缺, 增加了人们对可替代水资源的寻求力度.中央农办与国家发改委等部门联合印发了多个指导意见, 明确要求促进生产生活用水循环利用, 实现节水开源减排, 全面系统推进污水资源化利用和再生水利用试点示范[1, 2].水稻是耗水量最大的农作物, 其灌溉用水量占农业总用水量的65%以上[3].水稻综合节水结合合理利用再生水灌溉, 为农业生产带来了一定的经济效益和环境效益.
众多学者针对再生水灌溉水稻产量和品质、养分特征及环境影响等方面开展了大量研究工作.李莹等[4]提出了适宜的水稻再生水灌溉制度及施肥制度.有研究发现再生水灌溉不仅能促进水稻生长和提高产量[3], 还显著增加了稻田CH4和N2O排放[5].有研究表明, 再生水灌溉不会对稻田环境产生负面影响, 并显著提高了水肥利用效率[6].韩焕豪等[7]通过研究再生水灌溉水稻需水规律及灌溉制度, 发现间歇灌溉模式是节水省肥的适宜灌溉制度, 但不会对水稻产量产生显著影响.陈苏春等[8]研究发现再生水淹水灌溉会增加稻田土有机质含量, 氮素随水分向下迁移和累积.有研究表明, 再生水灌溉对稻田土壤和水稻植株各器官中重金属含量无显著影响[9].
硅（Si）是地壳中第二丰富的元素, 其生物地球化学循环取决于土壤、植被和人类活动.尽管Si被认为是一种非必需元素, 但它在大多数陆生植物中都存在, 其含量变化很大[10].硅肥对土壤-植物系统的作用体现在两方面：一是增强了植物抵御疾病、昆虫和逆境胁迫的保护能力；二是具有生物地球化学活性的硅可改善土壤的水分、物化特性和维持植物有效态养分来优化土壤肥力[11, 12].有研究表明, 施用硅肥可有效提升水稻抗倒伏, 并提高水稻产量和改善品质[13].硅酸对诱导和增强水稻白叶枯病抗性方面具有积极的生理作用, 施用硅肥能够提高水培和土培水稻白叶枯病抗性[14].多项研究集中于基施硅肥对土壤和作物重金属生物有效性与累积效应的影响[15, 16].叶面喷施通常被认为是一种环境相对友好的施肥方式, 喷施硅叶面肥能够提高水稻、玉米和小麦应对生物和非生物胁迫能力[17].适宜的水分管理措施联合叶面喷施硅肥可显著降低水稻籽粒重金属的累积[18].叶面喷施硅酸盐能够降低多种病原菌侵袭率[19].Buck等[20]研究发现, 尽管未检测到硅在水稻植株中累积, 但叶面喷施硅肥降低了稻瘟病的发病率.作为植物的地上部分, 叶际生境是多种微生物的特殊栖息地, 拥有在植物生态和进化中发挥关键作用的多种微生物, 这些丰富多样的微生物影响宿主的生理和生态系统功能[21].栽培方式和施肥对叶际微生物群落结构和功能起着重要的调控作用, 蓝细菌门受栽培方式影响更大, 施肥主要调控叶际拟杆菌门、厚壁菌门和浮霉菌门种群变化[22].叶际细菌是作物生境的重要组成部分, 叶面喷施硅肥影响水稻叶际中碳氮循环过程, 研究其群落组成和功能对固氮有重要意义.
再生水灌溉条件下叶面喷施硅肥对水稻叶际细菌群落结构组成及多样性的影响研究较少, 明确叶际细菌群落结构特征及氮相关功能基因丰度, 可揭示叶际细菌群落多样性与功能基因丰度对不同种类硅肥叶面喷施的响应变化.因此, 本文基于16S rDNA扩增子测序技术, 比较分析了再生水灌溉水稻叶际细菌群落结构多样性对3种硅肥叶面喷施的响应差异, 并利用实时定量PCR方法检测氮相关功能基因（AOA、AOB、nifH和nirK）丰度.本研究有助于深入了解水稻叶际优势菌群表型和功能特征及有益菌群与宿主植物的相互作用, 旨在为再生水灌溉条件下叶面施肥的微生态调控提供参考依据.
1 材料与方法 1.1 试验材料供试肥料：五水偏硅酸钠（Na2O3Si·5H2O）购自国药集团化学试剂有限公司, ω（SiO2）≥20%；硅浪, 购自河南中浪农业科技有限公司, ω（水溶性Si）≥25%；那优硅购自宝来化肥（烟台）有限公司, ω（有效螯合Si）15%.供试水稻品种：获稻008, 购自新乡市华农种业有限公司, 由新乡市卫滨区科丰种植农民专业合作社选育而成.再生水取自新乡市骆驼湾污水处理厂, 水质指标符合《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918-2002）和《农田灌溉水质标准》（GB 5084-2021）.
1.2 试验设计本试验于2022年6月~ 9月在中国农业科学院新乡野外观测试验站阳光板温室（113°93′E, 35°27′N）进行.供试土壤取自市郊农田, 基本理化性质如下：pH为8.32, 电导率（EC）为457 μS·cm-1, ω[有机质（OM）]为1.73%, ω[总氮（TN）]为0.65 mg·g-1, ω[总磷（TP）]为0.72 mg·g-1, ω[铜（Cu）]、ω[锌（Zn）]、ω[铅（Pb）]和ω[镉（Cd）]分别为24.73、62.02、15.24和0.13 mg·kg-1.
将稻种置于塑料穴盘中育种至幼苗, 选取生长一致的幼苗移栽至盛土12 kg的栽培桶中.施肥比例均按氮（尿素）∶磷（过磷酸钙）∶钾（氯化钾）= 2∶1∶1, 其中50%的氮肥和全量的磷、钾肥以基肥形式在移栽前一次性施入, 于拔节期和抽穗期追施剩余50%的氮肥.本试验处理设置如下：清水灌溉+叶面喷施无菌水（PWI）、再生水灌溉+叶面喷施无菌水（RWI）、再生水灌溉+叶面喷施偏硅酸钠（RIS1）、再生水灌溉+叶面喷施硅浪（RIS2）和再生水灌溉+叶面喷施那优硅（RIS3）, 各处理3次重复.选用的3种叶面喷施硅肥按照说明书推荐喷施浓度分别用无菌蒸馏水稀释1 000倍, 各处理等体积喷施.利用喷壶对叶片正反面喷施至完全湿润, 喷施时用塑料膜遮挡以避免落入栽培桶中及影响其他处理.叶面喷施频率每周1次, 全生育期淹水管理.
1.3 样品采集与DNA提取本试验结束后, 每桶随机选择3株水稻用无菌剪刀剪取叶片.所有样品当天采集完成, 置于冰盒中送至实验室进行预处理.土壤样品自然风干, 研磨过筛后待测.各处理分别称取水稻叶片10 g, 利用无菌剪刀剪成小块置于含100 mL 0.01 mol·L-1无菌磷酸盐缓冲液的锥形瓶中.先经过恒温摇床振荡30 min, 40 kHz条件下超声10 min, 然后利用孔径为0.22 μm的微孔滤膜和真空抽滤装置收集叶际微生物颗粒物.将收集叶际微生物的滤膜剪碎, 利用FastDNA® Spin Kit for Soil（MP Biomedical公司, 美国）试剂盒按照说明书提取叶际DNA, 并使用SpectraMax® QuickDropTM超微量分光光度计（Molecular Devices公司, 美国）检测DNA浓度及纯度, 保存于-80℃待用.
1.4 高通量测序为了避免叶绿体DNA扩增, 选用细菌16S rDNA的V5-V7区引物799F和1392R进行第一轮扩增[23, 24], 再使用799F和1193R进行第二轮扩增[25].利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences, 美国）对PCR产物进行回收与纯化, 回收产物经过QuantusTM Flurometer（Promega, 美国）检测和定量后, 使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库.构建的PE文库通过Illumina MiSeq 300平台（美吉生物医药科技有限公司, 上海）进行测序分析.
1.5 定量PCR利用TB GreenTM Premix Ex TaqTM（Takara公司, 大连）染料法对所选功能基因丰度进行定量检测, 本研究所用引物信息见文献[26 ~ 31].标准质粒制备过程如下：PCR扩增、PCR产物纯化与质检、pMDTM 19-T（Takara公司, 大连）克隆载体连接、蓝白斑筛选、质粒提取和测序鉴定.10倍梯度稀释（10-1 ~ 10-8）构建好的各质粒, 用于制备标准曲线.反应体系包括10 μL 2× TB GreenTM Premix Ex TaqTM, 0.5 μL正反向引物, 2 μL模板, 无菌ddH2O补足至20 μL.将加好样品的96孔板置于CFX ConnectTM荧光定量PCR检测系统（BioRad公司, 美国）进行基因丰度的实时定量检测.反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性5 s, 50 ~ 60℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 40个循环.每个样品反应设置3次重复, 以无菌水作为阴性对照.扩增效率为85% ~ 108%, R2值为0.997 ~ 0.999.
1.6 数据分析基于细菌16S rDNA扩增子测序数据的分析流程如下：①群落多样性分析：采用RDP classifier贝叶斯算法对扩增子序列变异体（amplicon sequence variation, ASV）代表序列进行分类学分析, 应用Mothur分析α多样性指数（Sobs、Shannon、Simpson、Ace、Chao1和覆盖度）；使用UPGMA算法构建层级聚类树呈现不同样本群落分布的差异程度, 基于Bray-Curtis距离矩阵分析样本群落组成的相似性或差异性；②群落组成分析：基于ASV分类学分析各处理在不同分类水平的群落结构组成；③物种差异分析：采用单因素方差分析比较各处理是否存在显著性差异, 应用LEfSe发现样本中最能解释组间差异的物种特征；④功能预测分析：采用PICRUSt进行细菌的功能家族组成及丰度与代谢路径预测分析, 基于BugBase进行表型预测, 利用人工构建的FAPROTAX数据库对参与生物地球化学循环的物种进行功能预测.测序所得的原始数据均已上传至NCBI SRA数据库, BioProject登录号为PRJNA932950.
利用Microsoft Excel 2007和SPSS 20对试验数据进行统计分析, 采用单因素方差分析（ANOVA）及Duncan多重比较分析处理间差异, P < 0.05为差异有统计学意义.
2 结果与分析 2.1 水稻叶际细菌群落多样性分析使用序列降噪方法（DADA2/Deblur）处理优化数据, 获得ASV代表序列和丰度信息.为了更好地进行统计学和可视化分析, 将各样本按照最小序列数进行抽平处理, 获得一致的有效序列14 128条.物种种类数统计信息如下：30个门、69个纲、170个目、293个科、626个属和2 800个ASV.为获得叶际细菌群落中物种的丰富度和多样性信息, 对Sobs指数、Shannon指数、Simpson指数、Ace指数、Chao1指数和覆盖度等α多样性指数进行评估.结果表明, 尽管再生水灌溉及其叶面喷施硅肥处理群落组成丰富度和多样性均较高, 但未观察到α多样性指数有显著变化（表 1）.
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表 1 不同处理细菌α多样性指数1） Table 1 Bacterial community α diversity indices in different treatments |
基于Bray-Curtis距离的UPGMA聚类算法对不同样品间属水平群落组成差异进行层级聚类分析.叶际细菌物种组成丰度前10的菌属包括Bacillus、Exiguobacterium、Pseudomonas、unclassified Enterobacteriaceae、Pantoea、unclassified Erwiniaceae、Enterobacter、Chryseobacterium、Jeotgalibacillus和Aeromonas.RWI和RIS1处理距离较近, 表明这两组样品的细菌群落结构组成较相似, RIS2和RIS3处理组与其他处理细菌群落结构存在明显差异[图 1（a）].PCoA结果表明硅肥处理可影响叶际细菌群落结构, RIS2和RIS3与其他处理群落组成差异较大, 主成分PC1和PC2分别解释17.05%和12.87%群落组成差异[图 1（b）], 结合PERMANOVA分析表明, 不同分组对细菌群落组成影响显著（F = 1.450 3, R2 = 0.367 1, P = 0.003 0）.
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（a）层级聚类分析, （b）主坐标分析 图 1 不同处理细菌群落组成相似性分析 Fig. 1 Similarity analysis of bacterial community composition in different treatments |
通过Venn图比较不同处理的核心菌群（图 2）, 结果显示, PWI、RWI、RIS1、RIS2和RIS3分别包含239、391、349、309和361个核心菌属.5个处理组共有菌属为126个, 占比范围32.22% ~ 52.72%；PWI、RWI、RIS1、RIS2和RIS3独有的菌属分别为21、70、49、32和60个, 分别占各自叶际菌属总数的8.79%、17.90%、14.04%、10.35%和16.62%.PWI处理的菌属总数和独有菌属明显低于其他处理, 表明叶面喷施硅肥可增加叶际细菌群落组成的丰富度和多样性.
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图 2 不同处理间叶际细菌属水平组成Venn图 Fig. 2 Venn diagram of core genera in phyllosphere among different treatments |
为了研究不同处理组叶际细菌群落结构组成差异, 分别在门和属分类水平上统计分析各处理物种组成及相对丰度, 并且将相对丰度 < 1%的物种归为others.门水平上, 主要优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidota）和疣微菌门（Verrucomicrobiota）, 平均相对丰度分别为30.93% ~ 63.97%、25.31% ~ 58.49%、3.23% ~ 7.33%、0.1% ~ 1.07%, 在5个处理组中占97.09% ~ 98.77%[图 3（a）].厚壁菌门在RIS2和RIS3的相对丰度明显高于其他处理, 而RWI中变形菌门的相对丰度较高, 其中主要以γ-变形菌纲（γ-Proteobacteria, 18.42% ~ 48.75%）为主, 变形菌门在硅肥处理组（RIS1、RIS2和RIS3）中的相对丰度有所降低.RWI处理较PWI处理的放线菌门相对丰度有所增加, 而在RIS1中又表现为下降趋势, 但拟杆菌门在RIS1处理中的相对丰度呈增加趋势.属水平上, 5个处理组叶际细菌群落结构组成相似, 相对丰度 > 1%的22个菌属相对丰度存在差异[图 3（b）].以上优势菌属相对丰度超过80%, 主要归属于厚壁菌门（5个属）、变形菌门（14个属）、拟杆菌门（1个属）和放线菌门（2个属）, 其中丰度前10菌的属在5个处理组中的平均相对丰度如下：芽孢杆菌属（Bacillus, 13.52% ~ 49.97%）、微小杆菌属（Exiguobacterium, 1.31% ~ 18.27%）、假单胞菌属（Pseudomonas, 2.91% ~ 9.71%）、肠杆菌科中未分类的属（unclassified Enterobacteriaceae, 0.017% ~ 16.34%）、泛菌属（Pantoea, 0.13% ~ 22.65%）、欧文氏菌科中未分类的属（unclassified Erwiniaceae, 0.65% ~ 10.89%）、肠杆菌属（Enterobacter, 0.099% ~ 7.81%）、金黄杆菌属（Chryseobacterium, 0.27% ~ 10.71%）、咸海鲜芽胞杆菌属（Jeotgalibacillus, 0.27% ~ 9.75%）和气单胞菌属（Aeromonas, 0.20% ~ 8.50%）.通过叶际细菌群落比较分析发现, 硅肥处理下叶际细菌丰度比例差异主要体现在芽孢杆菌属、微小杆菌属、金黄杆菌属、气单胞菌属和柠檬酸杆菌属.与清水灌溉（PWI）相比, 再生水灌溉（RWI）使水稻叶际芽孢杆菌属、微小杆菌属和假单胞菌属的相对丰度均呈降低趋势, 而泛菌属相对丰度显著增加.叶面喷施硅肥使芽孢杆菌属在水稻叶际呈增加趋势, 其相对丰度表现为：RIS3 > RIS2 > RIS1.RIS1和RIS2处理较其他处理叶际微小杆菌属相对丰度显著增加.RIS1处理水稻叶际中未分类的肠杆菌科相对丰度较其他处理显著增加.与RWI相比, 假单胞菌属在叶面喷施硅肥处理组中的相对丰度均有所增加.
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（a）门水平；（b）属水平 图 3 门与属分类水平叶际细菌群落组成相对丰度 Fig. 3 Relative abundances of bacterial community composition in phyllosphere |
基于Kruskal-Wallis秩和检验方法, 对不同处理组样本进行优势属的组间差异显著性检验分析（图 4）.多组比较分析结果显示, 在属水平上, 芽孢杆菌属（Bacillus）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、泛菌属（Pantoea）、肠杆菌属（Enterobacter）、气单胞菌属（Aeromonas）、Pannonibacter菌属和柠檬酸杆菌属（Citrobacter）在5个处理组之间有显著差异（P < 0.05）.
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* 表示0.01 < P ≤ 0.05 图 4 不同处理组细菌群落之间的物种丰度差异 Fig. 4 Difference in relative abundances of bacterial community from different treatment groups |
利用LEfSe（LDA effect size, 线性判别分析及影响因子）分析不同处理组间最能解释组间差异的物种特征, 以及这些特征对组间差异的影响程度.从门到属分类水平上来看, 共有15个菌属存在组间显著差异（LDA > 3.0, P < 0.05, 图 5）, 以上菌属主要归属于厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门.RWI处理中存在的组间差异物种最多, 包括Enterobacter、Pantoea、norank Rhodothermaceae、Pannonibacter和Enterococcus.Exiguobacterium、norank Rhodothermaceae和norank Sphingomonadaceae在PWI处理中显著富集.RIS1仅有一个显著差异物种（Citrobacter）.RIS2显著富集了norank Rhizobiales和Lysinibacillus.RIS3中显著差异物种为Bacillus、Paracoccus、Haliscomenobacter和Thauera.再生水灌溉及叶面喷施硅肥对上述物种在不同处理组间的显著差异起重要影响作用.
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图 5 不同处理组细菌群落特征物种LDA分布 Fig. 5 LDA distribution of bacterial genera in different treatment groups |
PICRUSt功能预测分析表明, 叶际细菌共获得5类代谢功能通路, 包括代谢（metabolism）、环境信息处理（environmental information processing）、细胞过程（cellular processes）、遗传信息处理（genetic information processing）和人类疾病（human diseases）, 主要涉及氨基酸代谢、次级代谢产物生物合成、碳水化合物代谢、能量代谢、膜运输、信号转导和细胞运动等20个KEGG二级功能群（pathway level 2, 图 6）.所有处理中涉及全局和总览图（global and overview maps）、氨基酸代谢、碳水化合物代谢和膜运输的功能丰度增加.RIS1处理中涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜运输和信号转导的功能丰度低于其他处理.涉及的代谢、环境信息处理、细胞过程和遗传信息处理的代谢通路功能丰度在叶面喷施硅肥处理中表现为：RSI3 > RIS2 > RIS1, 表明RSI3处理所用硅肥对叶际细菌群落丰富度和功能多样性影响更大.
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色柱颜色梯度表示样本中不同功能丰度变化情况 图 6 不同处理组KEGG功能丰度变化 Fig. 6 Variation in KEGG functional abundance in different treatment groups |
利用BugBase对不同处理样本进行表型预测分析, 确定高水平表型.图 7反映了移动元件含量（mobile element containing）、致病潜力（potentially pathogenic）及生物膜形成（biofilm forming）表型对应的主要物种组成.RWI处理下对应移动元件和潜在病原表型的泛菌属（Pantoea）的相对丰度更高, RIS1、RIS2和RIS3则相对丰度降低, 推断叶面喷施硅肥使样本中不同物种对特定表型的贡献度降低.
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图 7 特定表型的叶际细菌群落物种组成 Fig. 7 Specific phenotypes of phyllosphere bacterial community |
FAProTax用于生物地球化学循环过程的功能注释预测, 通过人工构建的数据库将原核生物分类群映射到代谢或其他生态相关功能.基于16S rDNA序列的分类注释结果, 利用FAProTax共获得43个功能类群.不同处理的细菌功能类群存在差异, 样本中细菌的核心功能类群（相对丰度 > 1.0%）如图 8所示, 这些功能类群包括化能异养作用（chemoheterotrophy）、好氧化能异养作用（aerobic chemoheterotrophy）、硝酸盐还原作用（nitrate reduction）、发酵作用（fermentation）、动物寄生虫或共生体（animal parasites or symbionts）、人类肠道（human gut）、哺乳动物肠道（mammal gut）、烃类降解作用（hydrocarbon degradation）、尿素水解作用（ureolysis）、芳香化合物降解作用（aromatic compound degradation）、硝酸盐呼吸作用（nitrate respiration）和氮呼吸作用（nitrogen respiration）, 平均相对丰度分别为32.26%、24.59%、11.41%、8.74%、5.31%、4.84%、4.84%、1.37%、1.25%、1.09%、0.57%和0.57%.本研究中具有化能异养作用、好氧化能异养作用、硝酸盐还原作用和发酵作用的功能群是叶际细菌中优势生态功能类群, 硅肥处理下叶际细菌化能异养作用显著增加, 硝酸盐还原作用的优势功能菌群相对丰度在RIS2和RIS3处理中显著增加.
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图 8 不同处理间优势细菌功能分布相对丰度 Fig. 8 Relative abundance of dominate bacterial functional group distribution among different treatments |
各处理叶际中氨氧化细菌（AOB）和古菌（AOA）基因、固氮基因（nifH）及反硝化基因（nirK）的定量结果如图 9所示.所有处理叶际中AOA、AOB和nifH基因丰度均处于较低水平（2.88 ~ 3.64 copies·g-1, 以10为底数的对数值）, 并且各处理间无显著差异.同样, nirK基因丰度和真菌总数基因丰度在各处理间也未表现出显著差异, 而细菌总数的基因丰度仅在RIS3处理下有显著增加.从定量结果来看, 灌溉水质及叶面喷施硅肥处理并未对叶际中氮相关功能基因丰度产生显著影响.
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图 9 不同处理功能基因定量丰度变化 Fig. 9 Abundances of functional genes in different treatments |
水稻作为典型的喜硅类作物, 施用叶面硅肥不仅可以提高水稻品质和增加产量, 还能有效降低水稻籽粒重金属的累积[32].有研究表明, 施用硅肥可改善土壤的理化和生物学特性来提高或恢复土壤肥力水平, 减少化肥从耕地中淋失[11].除了提高作物生产力, 降低传统农用化学品的使用外, 叶面喷施硅肥还会对植物叶际微生物组成及多样性产生很大的影响.本研究中, 通过再生水灌溉结合叶面喷施硅肥比较研究了不同种类硅肥对水稻叶际细菌群落结构及多样性的影响.高通量测序结果显示, 尽管各处理间的α多样性指数无显著差异, 但PCoA表明不同硅肥处理下的叶际细菌群落分布特征存在明显差异.水稻叶际细菌具有丰富的群落组成和多样性, 优势菌群由厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和疣微菌门组成, 灌溉水质与硅肥处理均对叶际物种相对丰度有一定影响.有研究发现硅肥增加了水稻土中放线菌种群丰度[33], 在本研究的叶际生境中也观察到一致的结果.厚壁菌门和变形菌门是其优势菌门, 厚壁菌门在RIS3处理中所占的比例最高, 明显高于未喷施硅肥处理.其中变形菌门主要包括α-变形菌纲和γ-变形菌纲, 厚壁菌门主要是芽孢杆菌纲.不同处理样品中细菌菌属结构存在差异, 硅肥处理叶际优势菌群分布结构相似度较高.属水平上, 再生水灌溉会导致泛菌属和肠杆菌属在水稻叶际中显著富集, 这两个菌属是潜在的植物病原菌和人类条件致病菌.芽孢杆菌属具有生物防治和抗逆促生作用[34, 35], RIS3处理显著增加了芽孢杆菌属相对丰度.微小杆菌属在RIS1和RIS2处理叶际中相对丰度增加显著, 其主要在有机污染物降解及生物修复方面发挥作用[36].与PWI处理相比, RWI处理叶际中假单胞菌属显著降低, 但3种硅肥叶面喷施后其相对丰度均显著增加.假单胞菌属除了参与生物防治和促生过程, 也可能是一类侵袭性的植物病原菌[37, 38].未分类的肠杆菌科、未分类的欧文氏菌科和气单胞菌属均属于常见病原菌, 金黄杆菌属相对丰度仅在RIS1处理下显著增加.有研究发现外源硅对土壤微生物群落组成有显著影响, 并能够降低潜在致病镰孢霉菌属、假单胞菌属和粪杆菌属的丰度[39].叶面施硅处理在增加叶片和果实中硅含量的同时, 也是预防褐腐病发生的一种有效方法[40].可以看出, 叶面喷施硅肥可降低作物疫病发生率, 具有一定的经济和环境效益.本研究中, 叶际致病菌属对喷施硅肥处理也表现出丰度降低的趋势, 这为进一步探究叶面施用硅源肥料促进叶际抗病潜能提供了基础.各处理中未分类的细菌仍占有一定比例, 表明在水稻叶际中仍存在大量未知和稀有细菌.RIS1处理所用硅肥为无机硅, 而用于RIS2和RIS3处理的硅肥属于螯合硅, 二者性质不同可能是导致叶际群落结构发生变化的主要原因.关于叶面喷施硅肥对水稻叶际微生物群落影响的文献报道较少, 相关研究主要集中于施用硅肥对土壤微生物群落多样性影响.施硅可能通过促进根系分泌物的产生而引发土壤细菌的增殖和活性, 硅肥处理下土壤中假单胞菌属和放线菌门数量显著增加[41, 42].有研究表明, 高氮水平条件下配施硅肥可显著提高水稻土壤真菌群落多样性, 但对细菌和古菌群落结构没有显著影响[43].有研究发现, 硅肥能够改善土壤肥力和增加土壤酶活性, 并抑制作物疫病的发生[44].有研究表明, 生物有机肥配施硅肥可通过提高土壤微量元素有效性、微生物功能活性及改变微生物群落组成来减缓果树早期落叶率, 果实产量也随微生物生物量和生态系统多功能性的增加而显著提高[45].硅含量与细菌群落呈显著正相关, 细菌多样性表现出组织依赖性分布模式, 与茎叶组织相比, 非根际土、根际土和根内的细菌丰富度和多样性最高[46].叶际细菌群落在维持农业生态系统功能中也起着至关重要的作用, 叶际细菌群落结构变化的驱动因素不仅与宿主植物种类有关, 也与植物生理状态和环境因素等密切相关.在本研究中, 初步探明了叶面硅肥施用对水稻叶际细菌群落结构组成及多样性的改变作用, 这有助于提高人们对硅肥改善农业生态系统健康和可持续性的认识.
硅肥处理不仅使叶际细菌群落结构及多样性发生变化, 还影响叶际细菌功能代谢通路和表型差异.PICRUSt功能预测分析结果表明, 叶际细菌主要涉及代谢（氨基酸代谢、次级代谢产物生物合成、碳水化合物代谢、能量代谢）、环境信息处理（膜运输、信号转导）、细胞过程（细胞运动）、遗传信息处理（翻译、复制与修复）和人类疾病（药物抗性）等5个KEGG一级功能（pathway level 1）和20个KEGG二级功能（pathway level 2）.Zhou等[47]利用PICRUSt预测叶际细菌群落功能基因的变异, 发现叶际中参与膜运输、细胞运动、脂质代谢和细胞分裂等功能的微生物相对丰度较高, 推断叶际微生物对外界环境的易感性可能导致叶际特征功能微生物的富集.与重金属抗性和C/N代谢相关的土壤细菌对硅肥的响应呈显著正相关[48].从不同层级KEGG代谢途径分析可以看出, 代谢是叶际细菌群落的核心功能, 叶际微生物通过代谢活动参与物质循环和生物合成等功能.有研究发现叶面施用纳米硅肥能够显著改变根际土代谢谱及代谢产物的分布[49].BugBase表型预测结果显示, 移动元件、潜在致病性和生物膜形成在喷施和未喷施硅肥处理组间对应的物种组成及贡献度差异显著, 并且同一物种对应了潜在致病性和生物膜形成这2个表型.RWI处理组对应潜在致病性表型的物种丰度增加, 并且各处理间以细菌为基础的生物膜的形成作为一种保护机制可增强宿主植物的抗逆能力.利用FAProTax预测叶际微生物群落之间潜在功能, 结果显示化能异养、好氧化能异养、硝酸盐还原和发酵是叶际细菌主要的生态功能.有研究发现, 叶际细菌的主要功能是化能异养（39.02%）和好氧化能异养（37.01%）, 表明叶际细菌群落主要参与生态系统中化学元素的循环[50].叶面喷施硅肥处理使叶际细菌拥有更强的化能异养、好氧化能异养和烃类降解功能, RIS2和RIS3处理强化了叶际细菌硝酸盐还原功能.文献[51]报道了脂肪族和芳香族烃类降解功能主要集中于叶际样品中.另有研究也表明, 叶际细菌群落参与了氮/磷循环和降解过程[52].推测硅源肥料施用有可能增加细菌多样性的维持、共存和植物-土壤系统细菌的联结, 从而增加植物各组织的功能多样性, 并诱发植物的正向生理生长效应.本研究及相关文献报道的指定物种均对特定环境及生物因素具有敏感性, 关于这些物种在作物生态系统中发挥的调节作用, 还需要通过菌株分离鉴定及试验验证来获取更准确的信息.
本研究通过定量PCR检测手段探讨了水稻叶际功能基因丰度变化对再生水灌溉及叶面喷施硅肥的响应.叶际生境已被证明能够为各种功能微生物提供适宜的定植条件[53].叶面喷施固氮蓝藻使水稻叶际nifH基因丰度显著增加, 但对AOB基因丰度无显著影响[54].生物固氮是固氮菌介导元素氮进入生态系统的重要途径, 固氮菌群主要分布于变形菌门、厚壁菌门和蓝藻菌门[53].Knief等[55]利用宏蛋白组学方法对水稻叶际和根际微生物种群进行了表征, 发现叶际细菌的转运过程和胁迫响应更显著, 并且nifH基因也存在于多种叶际细菌中.本研究结果表明, 叶面喷施硅肥对氮功能基因丰度的影响均无显著差异.已有多项研究报道了硅肥处理对水稻土功能基因丰度的影响, 施用硅肥使水稻土中参与CH4产生和反硝化功能基因丰度显著降低, 而增加了参与土壤易分解碳、碳氮固定、磷利用、CH4氧化和金属脱毒等功能基因的丰度[56].施用硅肥处理可增加水稻土中AOA基因丰度, 且降低AOB基因丰度, 提高AOA/AOB值[57].另一项研究发现, 施用硅肥既可降低土壤N2O排放速率和反硝化潜势, 又使参与反硝化过程的nirS和nirK基因丰度显著降低, 因此水稻生长期间施用硅肥可作为减少N2O排放的有效途径[58].尽管本研究中未发现叶面喷施硅肥会导致氮相关功能基因有显著差异, 但仍初步揭示了叶面喷施硅肥处理水稻叶际中功能基因的变化.
4 结论（1）本研究初步揭示了再生水灌溉联合叶面喷施硅肥对水稻叶际细菌群落结构组成及多样性的影响, 发现水稻叶际细菌群落结构相似但相对丰度存在差异, 其主要菌群由厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和疣微菌门组成.属水平细菌类群对不同硅肥处理表现出较大的响应差异, RIS1和RIS2处理促进微小杆菌属相对丰度增加, 而芽孢杆菌属在RIS3处理中相对丰度最高.在再生水灌溉下, 叶面喷施硅肥处理能够显著抑制潜在致病性泛菌属（Pantoea）和肠杆菌属（Enterobacter）相对丰度的增加.尽管各处理间α多样性无显著差异, 但PCoA结果显示叶面喷施硅肥导致叶际细菌群落发生显著变化.关于硅肥在农业中的叶面应用及其调控作物元素循环的微生物机制还有待进一步研究.
（2）功能预测分析表明, 叶际细菌丰富的代谢通路涉及多个功能家族, 获得的功能信息显示叶际细菌主要富集代谢和降解能力.移动元件、潜在致病性及生物膜形成表型对应的主要物种组成占更高的相对丰度, 其中叶面喷施硅肥显著降低潜在致病性表型.FAProTax预测结果表明, 水稻叶际主要富集化能异养、好氧化能异养、硝酸盐还原和发酵等相关功能菌群, 并且硅肥处理对化能异养和硝酸盐还原相关功能菌群具有促进作用.由此可见, 再生水及叶面喷施硅肥使叶际代谢功能丰富度及功能产生变化, 硅肥处理有降低潜在致病菌发生率的可能性.本研究为人们理解水稻叶际微生物功能过程对硅源肥料改良的响应提供了新的见解, 并对水稻可持续生产具有重要意义.
（3）定量结果表明, 氮相关功能基因丰度并未受灌溉水质及叶面喷施硅肥处理的显著影响, 仅RIS3处理下细菌总数基因拷贝数显著增加.叶施硅肥对叶际细菌群落结构组成影响显著, 但对功能基因丰度变化影响不显著.
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