2024, Vol. 45
塑料及其制品具有价格低、质轻和耐腐蚀等优点而被应用于工业、农业生产和日常生活中, 导致大量的废旧塑料进入环境中.土壤中的农用塑料薄膜和农药、化肥废弃包装等经过长期的物理风化、磨损、紫外线照射、高温、生物和人为作用, 逐渐磨损和破裂形成粒径更小的碎片和颗粒, 当尺寸小于5 mm时称为微塑料.有机肥、污泥的施用、农业灌溉和大气沉降等也会导致微塑料进入到土壤中[1, 2].据报道, 固原市农田土壤（耕作层）微塑料丰度为186.32~1 286.24个·kg-1, 农膜的使用是该地区微塑料的主要潜在来源[3], 云南滇池南部农田表层土壤中微塑料的丰度范围为13 020~28 100个·kg-1[4].此外, 随着工业化进程的加快, 化石燃料的消耗量不断增加, 导致环境中的PAHs污染日趋严重.单德鑫等[5]研究发现东营市农田土壤中ω（PAHs）为36.08 mg·kg-1, 其中菲（phenanthrene, PHE）含量高达12.60 mg·kg-1.农用地作为农业生产的主体, 是人类生存和发展的重要基础.因此, 农用地中的微塑料和PAHs污染问题应引起足够重视.
PAHs可长期存在于土壤环境中, 具有致畸、致癌和致突变效应.微塑料的性质稳定且具有较大的比表面积和强疏水性, 通过吸附/解吸与共存的PAHs发生相互作用, 进而影响PAHs的生物有效性及毒性效应.微生物是土壤生态系统中物质循环和能量流动的关键驱动者, 在维持/恢复土壤功能、调控土壤养分和改善土壤结构等方面起到重要作用.PAHs污染后的土壤微生物数量会发生变化[6]；高浓度的PAHs会抑制微生物活性和生长[7]；PAHs对土壤中细菌群落的结构和功能具有显著的影响[8], 微生物具有适应性进化的遗传机制, 形成可以降解PAHs的优势菌群[9].微塑料的存在影响了水稻土中微生物群落的组成、多样性和丰富度, 抑制了氮循环过程[10], 改变了土壤pH、有机碳/氮/磷含量和酶活性[11].微塑料通过降低土壤碳、氮含量而降低了土壤肥力[12], 还会释放化学添加剂来抑制微生物的生长[13], 从而引起土壤微生物群落多样性的变化.由此可见, 微塑料或PAHs会对土壤生态系统产生一定的影响, 但目前关于微塑料-PAHs复合污染对土壤特性和微生物群落的长期影响尚不清楚.
鉴于微塑料与PAHs在土壤中长期共存的现状, 本研究选用PHE作为目标PAHs, 以聚乙烯（PE）和聚丙烯（PP）作为微塑料的代表, 通过室内土壤培养实验, 系统地研究微塑料（PE、PP）和PHE的单一及复合污染对土壤化学性质、酶活性、微生物数量和群落结构/功能的影响, 探讨PE/PP和PHE共存下土壤性质、酶活性和菌群的互作关系, 以期为农用地土壤中微塑料-PAHs复合污染的生态风险评估及其微生物修复提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 室内土壤培养实验土壤样品来源于广东省肇庆市高要区的农用地, 采用S形布点法采集土样, 采样深度为0~20 cm, 混合均匀后运回实验室, 自然风干, 去除较大的石块、残根和凋落物等, 过2 mm筛混匀, 备用.将PHE溶解于丙酮中, 然后加入到土壤中, 待丙酮挥发后, 分别加入PE和PP微塑料, 充分混匀, 装入玻璃烧杯中, 具体分组如下：①CK, 土壤中不加入PE/PP和PHE；②PHE, 土壤中ω（PHE）为50 mg·kg-1；③PP, 土壤中添加5%（质量分数）PP；④PE, 土壤中添加5%（质量分数）PE；⑤PHE-PP, 土壤中ω（PHE）为50 mg·kg-1, 添加5%（质量分数）PP；⑥PHE-PE, 土壤中ω（PHE）为50 mg·kg-1, 添加5%（质量分数）PE.每个处理设置3个平行.在恒温恒湿培养箱中培养300 d后取样, 进行土壤性质、酶活性和微生物高通量测序分析.
1.2 土壤化学性质分析采用电位法（水土比2.5∶1）测定土壤pH, AN的测定采用碱解扩散法, AP利用浸提-钼锑抗比色法进行分析, SOM的测定采用水合热重铬酸钾氧化-比色法[14, 15].
1.3 土壤酶活性测定土壤酶活性参照Yi等[16]和关松萌[17]的方法进行分析.脲酶活性通过次氯酸钠-苯酚钠比色法测定, 以24 h后1 g土壤中NH4+-N的质量（mg）表示；采用磷酸苯二钠比色法测定土壤中酸性磷酸酶活性, 以24 h后1 g土壤中释出的酚的质量（mg）表示；利用荧光素二乙酸比色法测定FDAse活性, 以20 min后1 g土壤中荧光素质量（μg）表示；脱氢酶活性通过2, 3, 5-三苯基四唑氯化物（TTC）还原比色法测定, 以1 g土壤中H+的产量（µL）表示.
1.4 土壤微生物数量测定土壤中微生物数量利用稀释平板法测定, 细菌采用营养肉汤琼脂固体培养基（NB）, 放线菌采用改良高氏1号琼脂培养基（GA）, 霉菌采用马铃薯-蔗糖琼脂培养基（PSA）.将5 g土壤和50 mL无菌水加入到三角瓶中, 放入摇床振荡10 min, 使土壤均匀分散在无菌水中, 吸取1mL土壤悬液到9 mL无菌水中, 依次按10倍法进行稀释, 用无菌移液枪吸取稀释液于装有NB、GA和PSA的培养皿内, 用涂布棒涂抹均匀.将培养皿放入恒温培养箱中, 30 ℃条件下培养3~5 d, 待菌落完全长出后进行计数.
1.5 土壤微生物群落的宏基因组测序称取土壤样品200 mg, 放入灭菌离心管中, 加入70%乙醇1 mL后充分混匀, 10 000 r·min-1, 离心3 min, 倒掉上清液, 加入PBS溶液, 混匀后离心, 弃上清液, 将离心管倒置于吸水纸上至没有液体流出, 放入烘箱中（55℃）使残留乙醇完全挥发.采用磁珠法提取土壤DNA, 利用裂解液和蛋白酶进行裂解消化, 经结合液和磁珠吸附纯净DNA, 加入清洗液和洗脱液进行洗涤和洗脱后回收DNA, 1%琼脂糖凝胶检测DNA完整性, Qubit定量检测DNA样本浓度.利用超声波将DNA片段化, DNA片段经末端修复-连接接头-磁珠分选纯化连接产物-文库扩增-文库纯化, 通过检测文库大小、浓度和长度分布进行质控.采用Illumina HiSeq平台进行高通量测序, 对原始数据进行质量评估和过滤处理, 获得有效数据, 拼接组装优质reads, 根据reads间的overlap关系获得contigs, 使用Prodigal软件对拼接的contigs进行ORF预测, 根据NCBI的微生物分类学信息数据库, 获得基因的物种分类注释信息, 在各个分类学水平上统计物种的相对丰度.通过Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库进行代谢通路分析, 基于Superior Evolutionary Element Destined-factor（SEED）数据库对土壤微生物群落的生物学功能进行分析.
1.6 数据处理采用Origin 2019b对数据进行处理和绘制图片, 利用SPSS 22.0软件进行相关性分析和显著性检验, 冗余分析（RDA）和主成分分析（PCA）通过Canoco 5.0软件完成, 选取优势物种或功能信息进行双侧检验, 使用R语言的igraph包绘制网络关系图.
2 结果与讨论 2.1 微塑料和PHE对土壤化学性质的影响从表 1中可以看出, PHE的添加提高了土壤pH值, PE、PP、PHE-PE和PHE-PP降低了土壤pH, 但均未达到显著水平（P > 0.05）.Liu等[18]的研究也发现PE未对农田土壤的pH产生影响.但也有研究指出PE和PP的添加会促使土壤pH值的升高[19, 20], 可能是由于微塑料增强了土壤的通气性和孔隙度.Boots等[21]的研究发现PE可能会释放添加剂进入到土壤中, 降低了pH值.可能因为在这些研究中微塑料的形状、粒径、添加浓度和暴露时间不同.PHE添加到土壤中会导致pH值升高, 这与PHE在长期的降解过程中, 产生的一些碱性代谢产物有一定的关系[22, 23].在本研究中, 与CK相比, PHE轻微增加了土壤pH值, 推测土壤中微生物对PHE有一定的降解作用, 后文2.4.1节的结果也证实了土壤中存在Sphingomonas和Pseudomonas等可以降解PHE的菌种.但PE和PP可能会释放添加剂, 对PHE降解的碱性代谢产物起到了中和作用, 因此PHE-PE和PHE-PP轻微降低了土壤pH.此外, Wang等[24]指出土壤pH值与Acidobacteria的相对丰度呈负相关, 从图 1中可以看出, 与CK相比, PE、PP、PHE、PHE-PE和PHE-PP的添加对Acidobacteria的相对丰度基本没有影响, 这与pH值的变化规律一致.
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表 1 微塑料和PHE对土壤化学性质的影响1） Table 1 Effect of microplastics and PHE on soil chemical properties |
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图 1 土壤中属水平微生物的主成分分析 Fig. 1 PCA of microbial community in soil at genus level |
PE/PP和PHE的单一或复合污染增加了土壤SOM的含量, 尤其是PE、PP、PHE-PE和PHE-PP处理组, 达到显著水平（P < 0.05）.PHE的有机碳含量较高, PE和PP本身也含有一定的碳, 能够促进土壤中有机碳的积累.PP的碳原子个数要多于PE, 因此添加PP后SOM的含量要高于PE.PHE还可以作为微生物生长的碳源（例如：Sphingomonas和Pseudomonas）而被优先利用, 降低了处理组土壤中SOM的分解；PHE的生物降解过程会消耗氧气, 也会抑制SOM的矿化作用.PE和PP释放的添加剂在土壤中的迁移可能会对微生物产生毒害作用, 改变微生物群落的结构和功能, 使其分解SOM的能力降低[25~27]；微塑料的存在会和土壤微生物竞争物理化学生态位[28], 会抑制与有机碳降解相关的基因的表达[29]；以上可能是导致PHE-PE和PHE-PP组中SOM的含量显著高于PHE组的原因.
Zhou等[30]的研究指出, 可降解污染物作为碳源供应能够增强微生物对氮的固定.推测PHE可以被土壤中的一些微生物用作碳源进行生长和繁殖, 增加了对氮的利用, 导致PHE、PE-PHE和PP-PHE处理组中的AN含量明显低于CK组（P < 0.05）.在另一方面, 微生物通过氨化、硝化、反硝化和同化作用产生或分解NH4+-N和NO3--N, 实现AN的积累.菌Acidobacteria、Pseudomonas、Proteobacteria、Burkholderiaceae、Xanthobacteraceae和Pseudomonadaceae已被报道可以进行硝酸盐还原、硝化和反硝化反应[11, 31, 32], 本研究中PHE、PE-PHE和PP-PHE改变了上述菌群的相对丰度, 这也可能引起土壤中AN含量的降低.微塑料中的有机磷阻燃剂会使一定量的磷进入到土壤中, 因此PE和PP处理组中的AP呈现略微升高的现象.与CK相比, PHE、PE-PHE和PP-PHE在一定程度上降低了AP, 这说明微生物利用磷作为营养物质, 进行PHE的降解.微塑料引起的土壤pH值的升高会降低AP的含量[24]；Li等[33]的研究发现PP和PE对细菌群落没有产生明显的影响, 但显著降低了土壤中AP含量, 说明AP的变化与菌群的关系不大.本研究只关注了PE、PP和PHE的单独或复合作用对土壤细菌群落的影响, 并没有关注真菌群落的变化.Li等[34]的研究发现土壤真菌群落对微塑料胁迫的敏感性高于细菌, 未来开展微塑料和PHE对土壤真菌群落影响的研究将有助于进一步明确AN和AP变化的原因.此外, 微塑料还会诱导土壤团聚体出现断裂点, 改变团聚体的结构和数量, 这也可能会影响土壤中氮和磷的含量[35~37], 还需开展进一步的研究.
2.2 微塑料和PHE对土壤酶活性的影响脲酶能够促进含氮有机物的分解, 在氮循环中起到重要作用.已有的研究证明PE和PP的加入能够显著增强脲酶的活性[25, 38], 这与本研究的结果一致（表 2）.土壤中养分的含量会影响酶活性, 低养分水平会抑制土壤酶的产生[39], SOM中含有足够刺激酶活性的底物, 土壤化学性质与酶活性之间的相关性分析见表 3, SOM与脲酶活性呈现极显著正相关, 这说明PE/PP和PHE的单一或复合污染增加了土壤中SOM的含量, 是导致脲酶活性升高的原因之一.此外, PE和PP可以通过增强土壤中脲酶的活性而影响氮循环过程[25, 40], 因而降低了土壤中AN的含量（表 1）, 从表 3中可以得知, AN与脲酶活性具有极显著负相关关系.
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表 2 微塑料和PHE对土壤酶活性的影响1） Table 2 Effect of microplastics and PHE on enzymatic activities |
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表 3 土壤酶活性、微生物数量与土壤化学性质的相关性1） Table 3 Correlation between soil enzymatic activities, microbial quantity, and soil chemical properties |
FDAse酶是指示微生物活性的重要参数, 可以代表土壤细菌的整体代谢活动.有研究表明PE和PP显著增强了FDAse酶活性[41, 42].在本研究中, 与CK相比, PE/PP和PHE的单一、复合污染均明显增加了FDAse酶活性（P < 0.05, 表 2）, 说明了土壤中的微生物可以通过自身代谢活动将PE/PP和PHE降解.此外, 研究指出土壤中SOM含量高可以保护酶和微生物免受环境干扰, 从而减轻污染物对酶的毒性[43].PE、PP、PHE-PE和PHE-PP的添加显著提高了SOM含量, 有利于FDAse酶活性的增强.相关性分析表明, SOM与FDAse酶活性呈极显著正相关, 验证了土壤中SOM含量的增加对FDAse酶活性的促进作用.微塑料可以增加土壤通气性和孔隙度, 促进了空气循环, 导致好氧微生物的聚集, 进而提高土壤微生物活性, 因此, 与PHE相比, PHE-PP和PHE-PE增强了FDAse酶活性.FDAse酶活性的增强会促进土壤中微生物对氮的利用, 导致AN的含量降低（表 1）, AN与FDAse酶活性呈现极显著负相关（表 3）, 也验证了这一点.
脱氢酶是微生物呼吸过程中重要的氧化还原酶之一, 在所有活的微生物细胞中存在.有研究表明, 脱氢酶活性与PAHs的降解效果呈正相关[44, 45].与CK相比, PHE、PHE-PE和PHE-PP显著提高了脱氢酶活性（表 2）, 可能是PHE的存在使土壤中土著细菌（例如：Sphingomonas和Pseudomonas）对PHE的降解能力显著增强.与PHE相比, PHE-PE和PHE-PP的添加也显著增强了脱氢酶活性, 说明微塑料PE和PP能够促进PHE的生物降解；脱氢酶可以催化污染物通过电子链传输而被氧化, 同时氧化磷酸化途径会产生能量, 从而使土壤微生物数量和活性可以通过在降解聚合物过程中的生化反应而增加[46], PE、PP、PHE-PE和PHE-PP实验组中脱氢酶活性的增加表明土壤中微生物可能对微塑料具有降解作用.在PE和PP的分子结构链上分别存在甲基和亚甲基, 与PE相比, 甲基的存在增强了PP对生物降解的耐受能力, 因此, PP组中脱氢酶的增大幅度低于PE实验组.Fida等[47]的研究指出PHE的生物降解过程会消耗O2, 会导致土壤缺氧, 从而增强了脱氢酶活性.
磷酸酶可以催化土壤中磷酸单酯和磷酸二酯的水解, 将有机磷转化为无机磷, 提高有效磷的含量.添加PHE、PHE-PE和PHE-PP后, 土壤中性磷酸酶活性显著增加, 但PE和PP未对其产生明显影响（表 2）.有研究指出磷酸酶活性与一些细菌的丰度显著相关[42, 48], 包括Phenylobacterium、Pseudonocardia、Ramlibacter、Marmoricola、 Saccharimonadales、Burkholderia和Solirubrobacter等.本研究中, PE/PP和PHE的单独或复合添加均改变了Burkholderia、Marmoricola、Ramlibacter和Solirubrobacter的相对丰度, 可能是引起磷酸酶活性变化的原因之一.磷酸酶活性还与无机磷的生物利用性有关, 这说明PHE、PHE-PE和PHE-PP促进了土壤中细菌对磷的利用.此外, 土壤中AN含量的降低会引起pH的变化, 进而使磷酸酶活性增加；相关性分析显示, AN与中性磷酸酶活性具有极显著负相关关系（表 3）, 说明AN的变化对中性磷酸酶活性有一定的影响.
2.3 微塑料和PHE对土壤微生物数量的影响PP/PE和PHE的单一及复合添加对土壤中细菌、放线菌和霉菌的数量产生了一定的影响（表 4）.Liu等[18]的研究发现微塑料不能被微生物群落作为外加碳源而被降解, 导致微生物数量未发生变化, 可以推测微生物对微塑料的降解能力与其数量的增加呈正相关.本实验中, PP和PE增加了细菌的数量, 说明土壤中的细菌对PP和PE具有一定的降解能力, 但未达到显著水平.添加PHE、PHE-PE和PHE-PP的土壤体系中, 细菌、放线菌和霉菌的数量均增多, 这表明土壤中存在可以将PHE作为碳源的细菌、放线菌和霉菌；而且在PHE-PE和PHE-PP组中的细菌数量要大于PHE组, 这说明土壤中有可以利用PHE、PE和PP进行生长繁殖的细菌, 而且PE和PP的存在促进了细菌对PHE的降解.相关性分析表明（表 3）, 细菌数量与AN和AP含量呈显著负相关, 说明细菌可以利用AN和AP进行生长繁殖.与CK相比, 处理组中的AN和AP含量降低, 这进一步证实了PE/PP和PHE的单一和复合添加可以增加细菌数量.中性磷酸酶活性与细菌数量显著正相关, 磷酸酶活性的增强可促进有效磷的生成, 为细菌的生长繁殖提供营养物质, 表明磷酸酶的提高也是细菌数量增多的原因之一.微塑料中的添加剂等有害物质可能会释放到土壤中, 抑制微生物的生长活动, 这可能是本实验中添加PE和PP引起放线菌和霉菌数量轻微减少的原因之一, 但未对细菌的生长起到抑制作用.此外, 放线菌数量与pH呈极显著正相关, 这与Fu等[49]研究的结果一致, PE和PP的存在降低了土壤pH值也可能引起放线菌数量的减少.
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表 4 微塑料和PHE对土壤中微生物数量的影响 Table 4 Effects of microplastics and PHE on soil microbial quantity |
2.4 微塑料和PHE对土壤微生物群落的影响 2.4.1 土壤微生物群落结构
在属水平上对微生物群落进行主成分分析（PCA）, 结果见图 1, CK和PHE在同一区域, PE和PHE-PE在同一区域, 这说明CK和PHE、PE和PHE-PE的微生物群落结构差别不大, 但CK/PHE和PE/PHE-PE之间具有一定的群落差异性.PHE-PP和PP与其它组在不同的区域, 说明PHE-PP和PP与CK、PHE、PE和PHE-PE组的微生物群落存在差异, PHE-PP和PP间也存在微生物群落分布的差异.与CK相比, PHE处理组中的微生物群落变化不大, 经检测, 在培养300 d后土壤中ω（PHE）为0.083 8 mg·kg-1, 说明在培养过程中土壤中的PHE被微生物降解, 从而对微生物群落结构的影响较小.然而, 在PP、PE、PHE-PP和PHE-PE处理组ω（PP）、ω（PE）、ω（PP）和ω（PE）的剩余质量分数分别为4.48%、4.38%、4.72%和4.67%, 虽然土壤中的微生物对PP和PE有一定的分解作用, 但大部分的PP和PE仍存在于土壤中, 在300 d的培养过程中PP和PE会对微生物产生影响, 进而导致在PE、PP、PHE-PE和PHE-PP组中的微生物群落发生变化.
微塑料（PE/PP）和PHE的添加没有改变菌群的种类却改变了其相对丰度.与CK相比, PHE、PP、PE、PHE-PE和PHE-PP的存在均增加了β-变形菌（Beta-Proteobacteria）、伯克霍尔德菌（Burkholderia）、贪铜菌（Cupriavidus）、δ-变形菌（Delta-Proteobacteria）、假单胞菌（Pseudomonas）和红游动菌（Rhodoplanes）的相对丰度, 降低了溶杆菌（Lysobacter）、粘细菌（Myxococcus）、Pyrinomonas和土壤红杆菌（Solirubrobacter）的相对丰度（图 2）.β-变形菌、伯克霍尔德菌、贪铜菌、δ-变形菌、假单胞菌和红游动菌不仅可以直接参与PHE的降解, 还是在PP和PE表面定殖的主要微生物, 参与微塑料的降解[19, 50], 本研究中上述细菌丰度的增加再次验证了PHE、PP和PE在土壤中可以被降解；PHE-PE和PHE-PP污染体系中这些菌的丰度高于PHE体系中, 说明PP和PE的存在可以促进PHE的生物降解.Fu等[53]的研究表明, 微塑料可以通过增加土壤中碳水化合物和氨基酸的含量来降低溶杆菌的相对丰度.从2.4.2节中的SEED功能分析中可知, 微塑料（PP、PE）和PHE提高了碳水化合物和氨基酸的丰度, 因此, 这可能是导致溶杆菌的相对丰度降低的原因之一.Pyrinomonas和土壤红杆菌具有固碳作用, 有利于土壤中有机碳的积累, 这两种菌相对丰度的下降表明PP/PE和PHE的添加降低了微生物固碳能力, 但2.1节指出它们增加了SOM含量, 推测可能土壤中有机碳含量增加主要是由于PE/PP和PHE本身含有的有机碳积累导致的.
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图 2 微塑料和PHE对属水平上微生物群落相对丰度的影响 Fig. 2 Effects of microplastics and PHE on the relative abundance of microbial communities at genus level |
基于方差膨胀因子（VIF）分析筛选得到关键影响因子, 包括pH值、SOM、AN、AP、FDA酶和脱氢酶.用RDA对微生物群落的丰度与土壤化学性质、酶活性的相关关系进行分析, 结果如图 3所示.根据箭头连线长度可以看出, AN和SOM与微生物群落的相关性较好, 是影响群落结构的主要因素.通过Pearson相关性分析表明, AN与黄色土源菌（Flavisolibacter）显著负相关, 其能够降解PE/PP中的塑化剂和PHE[54, 55], 推测黄色土源菌利用AN进行生长繁殖而有利于污染物的降解.AN与火山岩海球菌（Marmoricola）、甲基养菌（Methylibium）和类诺卡氏菌（Nocardioides）均呈极显著正相关.SOM与酸杆菌（Acidobacteria）和溶杆菌（Lysobacter）呈显著负相关, 与沙壤土杆菌（Ramlibacter）呈显著正相关.添加PE/PP和PHE后, 由于土壤pH和AP没有发生显著变化, 微生物群落与pH和AP无显著相关性.从图 3（b）中可以看出, FDA酶和脱氢酶与微生物群落的相关性较好.Pearson相关性分析表明, 红游动菌与FDA酶呈显著正相关, 这与Zhou等[56]研究的结果一致.PHE和PE/PP的添加提高了FDA酶的活性和红游动菌的相对丰度（见2.2节和2.4.1节）, 推测FDA酶是促进红游动菌降解PHE和PE/PP的重要因素.假单胞菌属、Pyrinomonas与脱氢酶和FDAse酶呈显著负相关, β-变形菌与FDAse酶显著正相关.采用前向筛选法得到影响微生物群落的环境因子（表 5）, 土壤化学性质对微生物群落影响的重要性大小顺序为：SOM > AN > AP > pH, 酶活性影响的重要性大小顺序为FDAse酶 > 脱氢酶, 其中SOM达到显著水平（P < 0.05）, 其它均未达到显著水平（P > 0.05）, 说明PE/PP和PHE可以通过改变SOM来影响土壤微生物群落结构.已有研究表明其它土壤理化特性也可能对土壤微生物群落产生影响, Zhang等[57]指出微塑料会改变土壤的物理特性（容重、孔隙度和团聚体结构）, 进而引起微生物群落的变化；Chi等[58]指出PHE存在引起的盐度、铵态氮和硝态氮的变化也会影响土壤微生物群落结构.此外, 土壤中菌与菌之间的相互作用也会影响微生物的群落组成.通过微生物群落网络关系分析物种的相互关系（图 4）, 大多数菌属间呈正相关, 是相互协作的关系, 说明微生物为适应污染物的胁迫, 种群间会偏向互相合作.例如, β-变形菌、贪铜菌和假单胞菌彼此间呈显著正相关, 可以共降解土壤中的PE/PP和PHE, 它们的单一和复合污染均增强了这3种菌的丰度, 促进了菌群间的协作关系来抵抗污染胁迫.但也有一些菌属间显著负相关, 呈现竞争的生存关系, 例如鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）与酸杆菌、泉古菌（Crenarchaeota）、γ‐变形菌（Gamma-Proteobacteria）和溶杆菌为负相关.群落间的竞争关系会改变物种的丰度, 进而影响微生物群落的结构.
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（a）微生物群落与土壤化学特性的冗余分析, （b）微生物群落与酶活性的冗余分析；红色箭头表示环境因子（土壤化学性质/酶活性）, 蓝色箭头表示属水平上的细菌种类, 箭头长度表示环境因子与细菌群落的相关性强弱, 红色和蓝色箭头指向的同方向表示高度正相关 图 3 微生物群落与环境因子的冗余分析 Fig. 3 Redundancy analysis of soil microbial community and environmental factors |
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表 5 土壤化学性质和酶活性解释微生物群落变化的重要性及显著性 Table 5 Importance and significance of soil chemical characteristics and enzyme activities for microbial community |
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实线表示P < 0.01, 虚线表示0.01 ≤ P < 0.05；红色线表示正相关, 绿色线表示负相关 图 4 属水平上菌群相关性的网络分析 Fig. 4 Network analysis for the correlation of bacterial community at genus level |
由此可见, PE/PP和PHE的添加导致土壤SOM、AN和酶活性（脲酶、FDAse酶、脱氢酶和中性磷酸酶）发生了显著变化, 但只有SOM的变化与微生物群落显著相关.菌与菌之间的互作关系也是影响微生物群落的因素.此外, 土壤中不同碳源（PE/PP、PHE）的存在引起了群落组成的差异.因此, PE/PP和PHE的单一和复合污染引起的微生物群落的变化可能是SOM、菌间互作关系和碳源底物共同作用的结果.
2.4.2 微塑料和PHE存在下土壤微生物群落的功能特征（1）KEGG代谢通路 土壤中微生物在KEGG数据库（Level 2）注释的主要代谢通路见图 5.与CK相比, PP/PE、PHE的单一和复合污染的土壤中, 一些通路的相对丰度增加了, 包括能量代谢、细胞膜转运、核苷酸代谢、信号转导、转录和翻译.核苷酸代谢与细胞稳态直接相关, 有利于能量（ATP、GTP）的产生.土壤中微生物的能量代谢可用腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）来衡量, ATP是微生物量和活力的标志, 因此能量代谢可以促使土壤中细菌数量的增加.细胞膜转运能够调控微生物细胞对营养物质的吸收, 还可将代谢产物及时排出以防止它们在细胞中积累而产生毒性, 从而促进土壤中细菌的生长和生命活动.添加PHE、PE、PP、PHE-PE和PHE-PP后细菌数量增多（2.3节）可能与上述代谢途径的丰度增强有关.信号转导是生物细胞为应对环境变化而做出的生理应答反应, 能够改变细菌的基因转录表达以降低环境胁迫的影响[59]；转录和翻译在微生物体内是同时进行的生命过程, 通过调整基因的表达来适应环境的变化；这些代谢途径的相对丰度增强可能有助于土壤中微生物应对PHE和PE/PP污染的胁迫.
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图 5 基于KEGG的代谢通路 Fig. 5 Metabolic pathway of all samples based on KEGG |
（2）SEED功能注释 根据SEED数据库, 对CK和处理组土壤中微生物的生物学功能进行分析, 结果见图 6.氨同化作用是将氨氮结合到碳骨架中生成有机氮, 有利于微生物的代谢和能量产生；在此过程中, 氨氮还被结合到谷氨酸和谷氨酰胺中, 形成细胞内所有其它含氮成分的主要生物合成供体[60], 从而促进微生物的生长和繁殖.微生物细胞不仅要从环境中吸收铁来满足其生长的需求, 而且还要将细胞内铁浓度维持在无害水平, 因此铁的获取和代谢对于微生物的生长繁殖是十分重要的.ATP合成酶是微生物生长和繁殖的必需酶, 参与细胞生命活动所需要的能量合成.DNA代谢主要包括重组和复制, 是细菌的生长和存活不可缺少的部分, 对于维持细胞稳态至关重要.RNA代谢/加工/修饰与细菌的生长密切相关[61].蛋白质生物合成对细菌的生长至关重要, 蛋白质在肽链合成后需要进行加工和修饰才能具有生物活性.蛋白质和核蛋白的分泌在细菌的生长和繁殖过程中具有十分重要的作用, 提高微生物耐受污染物胁迫的能力.细菌的胁迫应答一个应对不利环境条件的复杂系统, 有利于细胞的生长.外源化学物的解毒是微生物的一种适应性特征, 可以增强细胞对污染物胁迫的耐受性.PHE和PE/PP的单一、复合污染均增加了上述生物学功能的相对丰度, 可能是微生物为了应对污染胁迫的调控机制, 代谢、生长和繁殖等生命活动的增强会提高微生物对PHE和PE/PP污染的适应能力.PHE、PHE-PE和PHE-PP的存在增强了芳香烃的代谢和厌氧降解功能, 说明土壤中的微生物对PHE具有一定的降解能力, 可以降低PHE对菌群的毒性效应.
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图 6 基于SEED的功能分析 Fig. 6 Functional analysis of all samples based on SEED |
（1）PE/PP和PHE的单一和复合污染对土壤pH和AP没有产生明显的影响, 显著地提高了FDAse酶活性；PE、PP、PHE-PE和PHE-PP显著增加了SOM含量和脲酶活性；PHE、PHE-PE和PHE-PP显著增强了脱氢酶和磷酸酶活性；PE/PP和PHE对土壤中细菌、放线菌和霉菌的数量产生了影响.
（2）pH、AP与土壤酶活性无显著相关性；AN与脲酶、FDAse酶、脱氢酶和中性磷酸酶呈极显著负相关；SOM与脲酶、FDAse酶呈极显著正相关；说明AN和SOM是添加PE/PP和PHE后土壤酶活性变化的主要影响因子.AN、AP与细菌数量呈显著负相关, pH与放线菌数量呈极显著正相关, 说明PE/PP和PHE引起的AN、AP和pH的变化是促进微生物数量增加的重要因素.
（3）PE/PP和PHE能够促使微生物产生能量, 加快污染物的代谢/降解和细胞膜转运过程, 促进微生物的生长和繁殖, 增强了菌群对污染胁迫的耐受能力.微生物群落的变化与土壤化学特性、菌间互作关系和碳源底物（PP/PE、PHE）具相关性, 其中SOM是主要的驱动因子.
（4）在土壤中添加PE/PP和PHE后, 随着培养时间的增加, 微生物会进行适应性进化, 微生物群落结构和代谢功能可能发生动态演替.因此, 未来需要针对微塑料、PAHs及其复合污染在不同胁迫时间下土壤微生物群落的变化开展进一步的研究, 对于明确微塑料/PAHs污染的土壤生态毒理学效应具有重要意义.
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