随着微塑料（microplastics, MPs）研究的不断深入, 越来越多的研究发现海洋^[1]、淡水^[2]、土壤^[3]和大气^[4]等各种环境中均有微塑料存在, 但相关研究更多集中于海洋生态系统^[5], 对土壤生态系统影响方面的研究尚较少^[6].据报道^[7], 每年释放到陆地上的废塑料量比释放到海洋中的多4~23倍, 且海洋环境中大量塑料颗粒来自陆地, 通过沉积物转移或土壤侵蚀等方式进入^[8].由此可见, 微塑料污染对土壤的影响可能更严重.微塑料在土壤中极难降解^[9], 易吸附携带有害污染物并改变土壤性质.如酸性土壤中微塑料污染会影响土壤理化性质和酶活性^[10], 这种影响取决于微塑料类型及其污染水平；不同粒径聚苯乙烯微塑料（polystyrene, PS）通过改变土壤理化性质, 进而潜在地改变植物生长^[11]；有研究发现PS会影响黄瓜（Cucumis sativus）植株的总生物量、抗氧化和糖代谢系统^[12], 且PS降解产生的苯环可能是影响叶绿素代谢和糖代谢的主要因素, 微塑料不仅可以改变土壤理化性质, 还直接或间接影响土壤中的植物生长.

此外, 土壤中普遍存在严重的重金属污染问题.根据2014年《全国土壤污染调查公报》数据, 镉（Cd）在全国土壤点位超标率最高, 高达7.0%.2020年农用地土壤污染状况详查结果显示, 影响农用地土壤环境质量的主要污染物是重金属, 其中Cd为首要污染物.Cd进入植株体后, 与养分共同竞争植物根系的吸收位点, 干扰植物对养分的吸收或利用, 从而影响植物的正常生长发育^{[13, 14]}.Cd进入植株体后分布在不同部位^[15], 通过食物链对生命健康产生威胁.已有研究表明, 环境中MPs可以吸附重金属, 并产生更强的毒性^[16].然而, 目前关于微塑料联合重金属污染的研究多集中于水生植物, 针对二者复合污染胁迫土壤植物的研究尚较缺乏.

生菜（Lactuca sativa）是可直接食用的蔬菜, 营养丰富, 具有多种功效.有研究通过激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察发现, 生菜不仅可吸收微塑料^[17], 并能将其运输、积累和分布在茎叶之中.而在实际种植条件下, 生菜受到MPs污染的同时, 也会受土壤中重金属的毒害作用.基于此, 本文以生菜作为供试植物, 选用聚苯乙烯微塑料（polystyrene microplastics, PS-MPs）联合重金属Cd污染物, 研究二者单一或复合污染下土壤理化性质的变化及其对生菜生理生态的影响, 旨在为微塑料和重金属复合污染对土壤-植物系统的生态影响提供一定的基础数据.

现有研究发现粒径4.8 µm的MPs能在植物种子囊孔隙中累积, 并延迟种子萌发和根系生长^[18]；还有研究通过设置10 mg·kg^-1和100 mg·kg^-1的暴露条件, 也发现5 µm的PS-MPs可显著抑制陆生高等植物（小麦、蚕豆等）的根、茎伸长, 破坏叶片的光合系统并抑制其抗氧化酶活性^{[19, 20]}.据此, 本文利用土壤培养条件, 选取粒径3 μm的聚苯乙烯微球（购自纳瑞新材料有限公司）, 设置暴露量为0（空白对照）、10、50、100、200和400 mg·kg^-1, 并参考国家《土壤环境质量标准》（GB 15618-2018）, 设置施加Cd污染物含量分别为0（空白对照）、1.2和6.0 mg·kg^-1, 分别标记为C₀、C₁和C₂.

选取颗粒均匀饱满的玻璃生菜种子（购自欣欣然公司, 实测发芽率为99.7%）, 采用3%的H₂O₂消毒30 min, 用蒸馏水反复冲洗3次以去除种子表面残留H₂O₂, 然后将其置于蒸馏水中浸泡12 h.将一部分种子置于含胁迫污染物的玻璃培养皿（直径9 cm, 高3 cm）中进行土培, 以测定发芽指标, 每皿90 g土、10粒种子, 共设3个平行；剩余种子置于含胁迫物的培养盆（口径18.0 cm, 底径16.5 cm, 高8 cm）中进行土培, 以测定幼苗指标与土壤环境指标, 每盆1.5 kg土、12粒种子并设3个平行.以上处理均置于人工气候箱中培养（光照/黑暗为12 h/12 h, 日温/夜温为20℃/15℃；光照强度5 000 lx）, 每日浇水1次, 保持土壤持水量70%左右.胁迫7 d后测定种子生长指标, 45 d后测定幼苗生长指标与生理指标, 并测定土壤理化性质.

土壤有机质（soil organic matter, SOM）测定采用重铬酸钾氧化-外加热法^[21]；有效磷（available phosphorous, AP）含量测定采用盐酸-氟化铵法^[22]；速效钾（available kalium, AK）含量测定采用四苯硼钠比浊法^[23]；碱解氮（alkali-hydrolyzable nitrogen, AHN）含量测定采用碱解扩散法^[24].

在种子发芽第3 d和第7 d时, 记录种子发芽数, 并在第7 d时将生菜幼苗置于103℃烘箱中烘干24 h至恒重, 采用电子天平测定苗干质量.参考连加攀等^[25]的方法计算种子发芽率（germination rate, GR）、发芽势（germination vigor, GV）、发芽指数（germination index, GI）和活力指数（vigor index, Ⅵ）等萌发指标, 计算公式如下：

(1)

(2)

(3)

(4)

式中, G_t为t天内的发芽数；D_t为对应的发芽天数；a为3 d内供试种子发芽数；n为供试种子总数；m为苗干质量；b为7 d内发芽种子数.

参考刘幸红等^[26]的方法测定生菜鲜重、干重和株高；叶绿素a含量（C_a）、叶绿素b含量（C_b）、叶绿素总量（total chlorophyll, C_t）和叶绿素a与叶绿素b含量比（C_a/C_b）等指标测定采用分光光度法^[27]；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性测定采用氮蓝四唑法, 过氧化物酶（peroxidase, POD）活性测定采用愈创木酚法, 过氧化氢酶（catalase, CAT）活性测定采用紫外吸收法^[28]；丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法^[29].

数据处理采用Excel 2019软件；数据统计分析采用SPSS 21.0软件；采用单因素方差分析（one-way, ANOVA）和Duncan法对数据进行差异性比较, 结果采用均值±标准误差表示；采用冗余分析（redundancy analysis, RDA）对数据进行相关分析；采用Origin 2022软件进行制图.

为确保实验过程的质量保证和质量控制, 在实验操作和数据分析全程执行严格的控制方案, 包括：检查并消除所有的潜在污染, 尽量减少或避免外来微塑料污染的可能性, 全程避免使用塑料制品；所有实验步骤均使用乳胶手套和棉质实验服；玻璃实验用品在使用前进行清洁、干燥；供试植物在培养箱中生长以减少空气中微塑料污染；测定指标时避免样品间交叉污染；确保试剂、量具的准确度与仪器的精确度.

如图 1所示, 土壤理化性质在PS-MPs联合Cd（C₀、C₁和C₂）污染条件下均有不同程度变化.Cd在C₀条件下, AHN含量随PS-MPs暴露量增加呈下降趋势, AK、AP和SOM含量在PS-MPs暴露量为200~400 mg·kg^-1下显著降低, 并在400 mg·kg^-1时降到最低, 与0 mg·kg^-1相比分别降低了49.9%、43.7%、14.5%和27.8%.C₁条件下, AHN和SOM在PS-MPs暴露量200~400 mg·kg^-1范围内均显著降低, 分别降低了23.1%和21.5%；AK与AP在PS-MPs暴露量为400 mg·kg^-1时降到最低, 分别降低了25.2%和14.0%.C₂条件下, AHN和AK在PS-MPs暴露量为400 mg·kg^-1时降到最低, 分别降低了37.5%和20.8%；AP和SOM在PS-MPs暴露量为10 mg·kg^-1时升高, 分别升高了5.9%和9.7%, 200~400 mg·kg^-1范围内显著降低, 在400 mg·kg^-1时降到最低, 分别降低了16.0%和34.4%.

图 1

Fig. 1

不同小写字母表示差异显著（P < 0.05） 图 1 PS-MPs和Cd复合污染下土壤理化性质的变化 Fig. 1 Changes in soil physicochemical properties under combined contamination with PS-MPs and Cd

如图 2所示, 不同含量PS-MPs与Cd（C₀、C₁和C₂）联合处理对生菜种子发芽的影响有一定差异.Cd在C₀条件下, PS-MPs暴露量为50~400 mg·kg^-1时种子发芽率、发芽势和发芽指数均显著降低, 并在200 mg·kg^-1时降到最低, 与0 mg·kg^-1相比分别降低了65.7%、80.8%和65.7%.C₁条件下, 不同PS添加下的种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数等指标均受明显抑制, 表明ω（Cd）为1.2 mg·kg^-1时, PS-MPs会加剧Cd对种子萌发的抑制作用.C₂条件下, PS-MPs暴露量为50 mg·kg^-1时种子发芽率和发芽指数均上升到最高, 但在PS-MPs暴露量为200~400 mg·kg^-1时显著降低, 并在400 mg·kg^-1时降到最低, 均降低了80.0%.表明ω（Cd）为6 mg·kg^-1时, PS-MPs暴露量为50 mg·kg^-1时能削弱Cd对种子萌发的抑制, 在PS-MPs暴露量为200~400 mg·kg^-1范围内会加剧Cd对种子萌发的抑制作用.

图 2

Fig. 2

不同小写字母表示差异显著（P < 0.05） 图 2 PS-MPs和Cd复合污染下生菜种子萌发指标的变化 Fig. 2 Changes in lettuce seed germination indicators under combined contamination with PS-MPs and Cd

如图 3所示, PS-MPs联合Cd（C₀、C₁和C₂）污染条件下, 随着PS-MPs暴露量增加, 生菜幼苗干重（DW）、鲜重（FW）与株高（PH）等生长指标总体呈先升后降趋势.Cd在C₀条件下, PS-MPs暴露量为10~100 mg·kg^-1下生菜的干重和鲜重显著升高；PS-MPs暴露量为200~400 mg·kg^-1时干重和鲜重呈下降趋势, 并在400 mg·kg^-1时均降到最低, 与0 mg·kg^-1相比降低了28.7%和22.3%.C₁条件下, PS-MPs暴露量在10~50 mg·kg^-1时, 幼苗的干重和鲜重均显著升高；400 mg·kg^-1时均显著降低, 与0 mg·kg^-1相比降低了30.5%和44.8%；随PS-MPs含量增加, 株高受到的抑制逐渐增强.C₂条件下, 植物干重和鲜重与株高变化趋势与C₁处理下大体一致.表明不同Cd浓度污染下, PS-MPs暴露量低时能促进生菜幼苗生长, 而PS-MPs暴露量高时会加剧Cd对幼苗生长的抑制作用.

图 3

Fig. 3

不同小写字母表示差异显著（P < 0.05） 图 3 PS-MPs和Cd复合污染下幼苗生长指标的变化 Fig. 3 Changes in lettuce seedling growth indexes under combined contamination with PS-MPs and Cd

图 4所示, Cd在C₀条件下, 当PS-MPs暴露量为50~400 mg·kg^-1时, 生菜叶绿素指标C_a、C_b和C_t持续降低, 在400 mg·kg^-1时降到最低, 与0 mg·kg^-1相比分别降低了21.5%、19.1%和20.9%.C₁条件下, PS-MPs暴露量在10~400 mg·kg^-1时, C_a、C_t和C_a/C_b均显著降低, 在400 mg·kg^-1时降到最低, 分别降低了47.7%、39.1%和39.5%；而叶绿素C_b在PS-MPs暴露量为50~200 mg·kg^-1范围内显著升高, 在10 mg·kg^-1和400 mg·kg^-1时显著降低, 分别降低了7.8%和13.8%.C₂条件下, 叶绿素C_b在PS-MPs暴露量为100~400 mg·kg^-1范围内显著下降, 在400 mg·kg^-1时降到最低, 降低了35.6%；C_a、C_a/C_b和C_t随PS-MPs暴露量增加而呈下降趋势, 均在400 mg·kg^-1时显著降低, 分别降低了63.7%、43.5%和54.5%.总体结果表明, PS-MPs暴露量高会加剧Cd污染对生菜幼苗叶绿素的抑制影响.

图 4

Fig. 4

不同小写字母表示差异显著（P < 0.05） 图 4 PS-MPs和Cd复合污染下幼苗叶绿素指标的变化 Fig. 4 Changes in chlorophyll indicators of lettuce seedlings under combined contamination with PS-MPs and Cd

图 5所示, 生菜幼苗的抗氧化酶活性与MDA含量在PS-MPs联合Cd污染条件下均有变化.Cd在C₀条件下, CAT在PS-MPs暴露量为100~400 mg·kg^-1时显著降低, POD在PS-MPs暴露量为50~400 mg·kg^-1时显著降低, SOD活性随着PS-MPs含量增加显著降低, 均在400 mg·kg^-1时降到最低, 分别下降了44.7%、40.6%和28.0%；MDA含量呈上升趋势, 在400 mg·kg^-1时升到最高值, 上升了104.5%.C₁条件下, CAT、POD和SOD在PS-MPs暴露量为200~400 mg·kg^-1时显著降低, 均在400 mg·kg^-1时显著降低, 分别降低了22.1%、40.0%和21.4%；MDA随PS-MPs暴露量增加呈先降后升趋势, 在400 mg·kg^-1时升到最高, 上升了16.1%.C₂条件下, CAT、POD和SOD在PS-MPs暴露量为100~400 mg·kg^-1时显著降低, 均在400 mg·kg^-1时降到最低, 分别下降了35.8%、36.4%和21.4%；MDA含量持续升高, 在400 mg·kg^-1时升到最高值, 上升了30.0%.

图 5

Fig. 5

不同小写字母表示差异显著（P < 0.05） 图 5 PS-MPs和Cd复合污染下幼苗生理指标的变化 Fig. 5 Changes in physiological indicators of lettuce seedlings under combined contamination with PS-MPs and Cd

如图 6, 不同PS-MPs暴露量联合不同Cd污染（C₀、C₁和C₂）条件下, 各环境因子与生菜幼苗各生理指标间存在一定相关性, 排序轴1和排序轴2对幼苗指标的累计解释量分别达66.64%、69.56%和67.28%.Cd在C₀条件下幼苗MDA与AK、SOM、AP和AHN呈显著负相关, 且相关性大小表现为：AP > AHN > SOM > AK；幼苗其它指标与土壤指标呈正相关, 且相关性大小表现为：SOM > AK > AP > AHN.C₁条件下幼苗MDA与土壤指标呈显著负相关, 且相关性大小表现为：SOM > AHN > AK > AP；其它指标与土壤指标呈显著正相关, 且相关性大小表现为：AP > SOM > AHN > AK.C₂条件下幼苗MDA与土壤指标呈显著负相关, 且相关性大小表现为：SOM > AHN = AP > AK；其它指标与土壤指标呈显著正相关, 且相关性大小表现为：AP > SOM > AK > AHN.

图 6

Fig. 6

FW：植物鲜重；DW：植物干重；PH：植物株高；蓝色箭头：幼苗指标；红色箭头：土壤指标 图 6 生菜幼苗指标与土壤环境指标间的的冗余分析 Fig. 6 Redundancy analysis (RDA) between lettuce seedling indicators and soil environment indicators

土壤理化性质的变化对植物生长和生理等活动均有重要影响, 研究土壤理化性质的变化极其关键.本研究发现不同PS-MPs暴露量及其联合Cd污染（1.2 mg·kg^-1）会显著降低土壤中的AK、SOM、AP和AHN等含量, 而400 mg·kg^-1的PS-MPs暴露量联合Cd污染（6 mg·kg^-1）也显著降低土壤各理化指标含量.上述结果表明, 一定量的PS-MPs + Cd复合污染会对土壤理化性质产生不利影响, 这与已有研究的结果较一致^{[30, 31]}, 可能与土壤酶活性有一定关联^[32], 具体机制有待深入研究.

本研究还发现土壤SOM、AP、AK和AHN等指标含量与生菜叶片的MDA含量呈显著负相关, 与其它幼苗指标呈正相关, 表明土壤理化性质在MPs和重金属复合污染下会影响生菜幼苗的生长, 与其他研究结果较一致^{[33, 34]}.其中, SOM和AP与幼苗指标的相关性最显著, 可能是因为SOM含量降低对土壤孔隙度、通气性和结构等产生负面影响, 会阻碍植物根系吸收养分与水分, 从而影响生菜幼苗的生长和生理生态；土壤中的AP、AK和AHN等含量的降低会导致植物能够吸收的土壤养分减少, 从而无法维持其正常生长.以上结果表明, 微塑料与重金属复合污染会直接影响土壤理化性质, 从而间接影响植物的生长.

发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数是衡量植物种子发芽能力的重要指标.本文结果表明, 单因素PS-MPs或其联合Cd的不同暴露量对生菜种子萌发具有不同抑制作用, 这与吴佳妮等^[35]研究的结果一致.有研究认为^[18], PS-MPs抑制生菜种子发芽是由于MPs会粘附在种皮表面并对种子囊孔隙产生物理堵塞, 抑制种子吸收水分及营养成分进而延缓萌发.但也有研究发现, MPs不会显著降低植物种子发芽率^[36], 甚至会促进发芽^[37], 这可能与MPs种类、粒径、暴露量及其所带电荷等因素有关^{[38, 39]}.此外, 微塑料能够通过富集金属离子增大毒性效应并损害种子某些组织^[40], 如PS-MPs联合Cd（1.2 mg·kg^-1）和PS-MPs（200~400 mg·kg^-1）联合Cd（6 mg·kg^-1）暴露下均加剧抑制种子萌发, 这与王泽正等^[37]研究的结果一致.本文还发现50 mg·kg^-1 PS-MPs会减缓Cd（6 mg·kg^-1）对种子萌发的抑制, 这可能是MPs在一定暴露量范围内发生团聚并吸附Cd, 导致土壤中游离态微塑料和重金属含量减少, 削弱重金属的生物可利用性, 从而降低污染物与种子的可接触性, 减缓发芽抑制^{[41, 42]}.在不同环境条件下, 不同暴露量微塑料对不同量重金属的吸附能力不同^[43], 因此, 微塑料联合重金属污染对种子萌发产生不同程度的抑制作用与二者的暴露量均有直接关系.

生物量能够直观反映外界因子对植物生长发育的影响.本文发现低暴露量PS-MPs与Cd的复合污染能显著升高生菜幼苗的鲜重和干重, 促进植物生长发育, 表明低暴露量MPs可提高植物幼苗的抗逆能力, 并在一定程度上缓解Cd污染对生菜幼苗的毒害, 这与周颖等^[44]研究的结果一致.MPs通过降低土壤容重, 减小植物根系的渗透阻力、增加土壤孔隙率和改善土壤通气性, 从而促进植物生长和增加生物量^{[45, 46]}.高暴露量PS-MPs及其Cd复合污染下幼苗的鲜重、干重显著降低, 表明生菜在逆境条件下通过减少生物量的积累, 以应对外界伤害, 这与已有研究的结果相一致^[47], 郭丽丽等^[48]认为植物在逆境时具有调节生物量分配模式的能力, 为适应胁迫环境需要维持细胞正常功能, 需消耗其体内能量, 最后导致植物生长受到抑制^[49].

叶绿素在光合作用的光吸收中起关键作用, 是植物进行光合作用的主要色素.有研究认为MPs通过降低光合作用主要产物——可溶性糖, 影响植株光合作用, 进而降低植物生物量^[12].本研究也发现, 随着PS-MPs暴露量增加, 生菜幼苗叶片的叶绿素含量降低, 表明土壤中PS-MPs不利于叶绿素积累, 且高含量MPs抑制效果更强, 这和Li等^[12]认为PS-MPs降解产生的苯环可能是影响叶绿素代谢的主要因素的研究结果相似.叶绿素a起转化光能的作用, 存在于类囊体膜上, 其含量降低导致植物C_t和C_a/C_b下降, 进而抑制光合作用和光能利用^[49].在Cd污染条件下, C_a和C_a/C_b和C_t随着PS-MPs暴露量增加变化趋势一致, 说明幼苗类囊体可能受到破坏并引起叶绿素含量和光能转化率下降, 导致叶绿素含量降低, 从而影响植物生长.这和Dong等^[47]研究的结果相似.本研究还发现, 一定暴露量范围内PS-MPs暴露会导致C_b升高, 但叶绿素总量C_t呈现降低趋势.综合以上分析, 认为C_a是影响植物利用光能和叶绿素含量的主要因素；而PS-MPs联合Cd污染可能通过影响植物叶片光能的转化并影响叶绿素含量.

外界胁迫会引起植物体内活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）积累, 导致细胞膜脂过氧化, 产生过量MDA, 造成细胞膜系统受到破坏.本研究单一PS-MPs暴露或Cd（6 mg·kg^-1）胁迫下, MDA含量呈上升趋势, 表明生菜幼苗体内积累了大量ROS, 膜系统受害程度较严重；PS-MPs联合Cd（1.2 mg·kg^-1）处理下, MDA含量先降后升, 说明一定暴露量MPs或能减轻Cd（1.2 mg·kg^-1）对幼苗的氧化损伤, 这与已有研究的结果较相似^{[50, 51]}.生菜幼苗体内的抗氧化酶活性整体呈抑制现象, 活性均显著低于对照组, 且表现出随PS-MPs暴露量增高而降低的趋势, 表明Cd对幼苗的毒害作用会随PS-MPs暴露量增加而加剧, 导致幼苗无法启动抗氧化酶系统进行自我调节.这与Jia等^[52]研究认为土壤中MPs有利于重金属进入植株体内, 加剧植物受害的结果较一致.刘玲等^[53]研究表明, 水稻（Oryza sativa）抗氧化酶活性在低暴露量MPs和重金属胁迫下会升高, 供试植物具有一定耐受性, 这与本文研究的结果不同, 可能是本实验植物种子发芽阶段幼苗耐受性减弱, MPs加剧了Cd对叶片抗氧化酶活性的抑制作用.总体上, 微塑料与重金属复合污染会抑制植物抗氧化系统的活性, 诱导胁迫反应, 影响植物正常生理代谢与生长.

（1）PS微塑料与重金属Cd的复合污染会直接影响土壤理化性质的变化, 并间接影响植物的生长.

（2）单一PS-MPs暴露或PS-MPs联合Cd污染均能抑制生菜种子的萌发并影响其幼苗的生理活动, 且表现为随着暴露量增加, 抑制作用显著增强.

（3）低暴露量PS-MPs或其联合Cd的复合污染对生菜幼苗的生长表现为促进作用, 但高含量胁迫下则表现出显著的抑制作用.

（4）高含量Cd联合PS-MPs污染对生菜幼苗会产生显著的生态效应；高暴露量PS-MPs会加剧Cd对幼苗的生态毒理效应, 二者表现为协同作用.