2023, Vol. 44
2. 湖南省灌溉水源水质污染净化工程技术研究中心, 长沙 410128;
3. 农业农村部南方产地污染防控重点实验室, 长沙 410128
, YAO Jun-fan1,2,3 , LIU Yu-ling1,2,3 , ZHANG Wei-yu1,2,3 , YIN Xue-fei1,2,3 , TIE Bo-qing1,2,3
2. Hunan Engineering & Technology Research Center for Irrigation Water Purification, Changsha 410128, China;
3. Key Laboratory of Southern Farmland Pollution Prevention and Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Changsha 410128, China
水稻作为全世界种植最为广泛的作物[1], 长期面临镉(Cd)和砷(As)等重金属的胁迫, 导致水稻生长不良而减产.人类长期食用Cd或As含量超标的水稻会诱发各种疾病, 如心血管疾病和神经系统疾病等[2, 3], 而快速的工业化和城市化导致农田重金属污染问题日益严重[4], 其中又以Cd-As复合污染土壤的治理最为棘手[5].据2014年环境保护部和国土资源部联合发布的公报显示, 我国19.4%的农用土壤重金属污染超标, 其中Cd超标率达7%, As超标率达2.7%.由于Cd和As在土壤中生物地球化学行为的差异[6, 7], 稻田淹水管理降低土壤Cd有效性时, 通常会导致As有效性的增加[8].有研究表明, 田间试验中, 水稻对Cd和As的积累能力呈负相关[5].如今研究阻控水稻单一Cd或As污染的学者有很多, 但如何同时降低水稻中Cd、As含量仍是技术难关[9], 也是近年来的热点议题.
硫(S)是植物生长的必需元素, 以硫酸盐的形式被植物根部吸收, 然后被还原并同化为半胱氨酸[10].S及其盐类常被用于修复农田重金属污染土壤, 外源S的添加能显著降低土壤中Cd和As的有效性[11], 并能抑制水稻籽粒对Cd和As的积累.淹水条件下, 施用S可抑制水稻根际CdS的溶解[12].赵娜娜等[13]研究还发现叶面喷施半胱氨酸会阻控Cd从水稻茎向叶的转运, 并使籽粒中Cd含量降低47.18%.S还可通过促进根表铁膜的形成而减少水稻幼苗中的As含量[14], 并降低土壤孔隙水中的As迁移率以及水稻植株对As的吸收[15].硫酸盐还原菌(SRB)在S的地球化学循环过程中起着重要的作用, 硫酸盐还原过程中SRB产生的硫化物可与重金属沉淀, 形成稳定的金属硫化物[16, 17].因其还原S的特性, SRB被认为是最有前途的重金属固定替代物之一, 已成功应用于废水、土壤和沉积物处理[18~20].目前, 单一修复技术很难解决Cd-As复合污染问题, 基本做不到二者兼顾.因此, 本试验选取硫磺、硫酸钙两种硫肥和1株具有硫酸盐还原能力的肠杆菌, 采用土壤调理剂耦合微生物菌剂的方式, 通过盆栽试验探究外源S和SRB联合施用对水稻土有效态Cd、As及水稻各部位累积Cd、As的影响, 以期为Cd-As复合污染农田粮食安全生产提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试水稻盆栽试验分为早稻和晚稻两部分.所用早稻品种为湘早籼24号, 于2021年4月27日移栽, 2021年7月18日收割; 晚稻品种为泰优390, 于2021年7月24日移栽, 2021年10月24日收割.水稻幼苗均由株洲市禄口区南洲镇农技站田间育秧培育后提供.
1.1.2 供试土壤土壤采自浏阳市蕉溪乡常丰村沙德组稻田, 采样深度为0~20 cm耕作层.将采集的土壤碾碎、除去石块和杂物后在塑料布上均匀铺开摊平, 于洁净处自然风干.经测定, 土壤pH为6.13, ω(总Cd)为1.02 mg·kg-1, ω(总As)为60.07 mg·kg-1, 依据《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618-2018), 土壤中Cd和As含量均超标.
1.1.3 供试肥料及菌株(1) 硫肥硫磺(S, 分析纯)、硫酸钙(CaSO4·2H2 O, 分析纯), 均由国药集团化学试剂有限公司生产.
(2) 菌株通过实验室从Cd-As复合污染土壤中所筛选的耐Cd、As菌株M5(Enterobacter sp.)[21], 保藏号为GCMCC No.22636.
1.1.4 试验装置试验盆栽桶为红色聚乙烯材质, 上口直径、下口直径和桶高分别为36、33和29 cm.每个盆栽桶中装入20 kg过10目尼龙筛的风干土壤, 将土壤填紧压实后室外淹水30 d左右, 土层约可下沉至桶高20 cm处.
1.2 试验设计水稻盆栽试验场地位于湖南农业大学环境科学楼前网室内.本试验共设计6个处理, 每个处理3次重复, 所有处理均淹水2~3 cm.细菌添加量以4.305×109 cfu·mL-1(D600=1.352)为标准添加.基肥(硝酸钾1.3 g、尿素3.5 g和过磷酸钙3.5 g)、硫肥及菌液于水稻移栽前一周施入盆栽桶, 并将土壤混合均匀.具体试验处理见表 1.
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表 1 试验处理1) Table 1 Treatments in potted experiment |
1.3 样品采集及预处理
于水稻成熟期采集非根际土及根际土样品, 冷冻干燥后用于测定有效态Cd和As含量.成熟期收获水稻样品后用自来水冲洗, 再用去离子水洗净.用不锈钢剪刀将水稻分为根、茎、叶和糙米这4个部分.其中水稻根系再小心分为两部分, 一部分置于-20℃冰箱保存, 用于根表铁锰胶膜相关指标的测定.其余根同茎、叶装入相应的信封袋, 于105℃烘箱内杀青1 h后将温度调至65℃烘至恒重.糙米置于日光下晒干后用砻谷机将籽粒和谷壳分离.处理后的水稻各部位均用植物粉碎机粉碎, 按编号装入封口袋封存.
1.4 样品分析 1.4.1 土壤样品分析方法采用0.1 mol·L-1 CaCl2提取土壤有效态Cd[22], 0.5 mol·L-1 NaH2PO4提取土壤有效态As[23], 所得提取液用ICP-OES测定Cd浓度, 原子荧光光谱仪测定As浓度.
1.4.2 水稻各部位重金属含量采用混合酸(HClO4 ∶HNO3=1 ∶4)湿法进行消解, 每台消解仪设3个空白样和3个质控样, 消解液稀释过滤后用ICP-OES测定Cd浓度, 用原子荧光光谱仪测定As浓度.其中水稻根、茎、叶消解时用灌木枝叶GBW07602(GSV-1)做质控样品, 籽粒用大米GBW(E)100360做质控样品.总Cd回收率为91%~97%, 总As回收率为95%~107%.晚稻还增测了浸提铁膜后的根系样品.
1.4.3 籽粒中As形态测定方法称取1g植物样品, 加入20mL 0.15mol·L-1HNO3, 静置过夜后, 于90℃条件下消煮150 min, 每30 min振荡一次, 所得提取液用LC-AFS测定无机As浓度.采用阴离子交换色谱柱(Hamilton PRP-X100, 柱长250 mm, 内径4.1 mm)进行As形态的分离, 流动相由45 mmol·L-1 KH2 PO4和5 mmol·L-1 Na2 HPO4组成, pH调节为6, 流速为1 mL·min-1, 于6 min内完成形态的分离测定.样品中有机As的浓度用总As和无机As的差表示.
1.4.4 根表铁膜浸提方法根表铁膜采用ACA法提取[24], 所得提取液用ICP-MS测定ACA提取态Cd(ACA-Cd)、As(ACA-As)、Fe(ACA-Fe)和S(ACA-S)的含量.
1.5 数据处理用IBM SPSS 25对数据进行统计分析处理及显著性差异分析.用Microsoft Excel 2021和Origin 2022软件对数据进行图表处理.
2 结果与分析 2.1 基施硫肥和菌株对水稻非根际土和根际土中有效态Cd、As的影响图 1为基施不同处理后早晚稻非根际土和根际土中有效态Cd、As含量.所有处理非根际土中有效态Cd和As的含量均高于根际土.由图 1可知, 联合施用的处理较单一施用的处理根际土有效态Cd、As含量均更低.早稻中C处理非根际土中有效态Cd的含量最低, CM5处理根际土中有效态Cd的含量最低.对比CK, 除S处理外, 早稻其它处理非根际土中有效态As的含量显著下降.晚稻各处理中非根际土和根际土中有效态Cd、As含量差异较早稻而言更为明显, 其它现象基本与早稻相符.
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不同小写字母表示同系列不同处理间差异显著(P < 0.05), 下同 图 1 水稻根际土和非根际土有效态Cd和As的含量 Fig. 1 Contents of available cadmium and arsenic in rhizosphere soil and non-rhizosphere soil of rice |
早、晚稻各处理水稻产量如图 2所示.对早稻而言, 同CK相比, SM5处理和S处理其早稻产量显著增加, 产量分别为99.66 g·盆-1和97.43 g·盆-1, 其余处理相较于CK无显著性差异.晚稻中, SM5处理和CM5处理相比CK产量显著增加, 产量分别为92.57 g·盆-1和91.86 g·盆-1.
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图 2 基施硫肥和菌株对水稻产量的影响 Fig. 2 Effects of different sulfur applications with M5 on rice yield |
早晚稻各部位Cd含量如表 2所示.从中可知, 与CK相比, 早稻中各处理均可降低水稻根、茎和叶中的Cd含量, 其中根部降低了10%~38%, 茎秆降低了19%~50%, 叶片降低了23%~50%.单一施用处理中, S处理根和叶中Cd含量最低; C处理茎中Cd含量最低.联合施用处理中, SM5处理根和茎中Cd含量最低, CM5处理叶中Cd含量最低.联合施用的处理其根和叶中Cd含量均高于仅添加同种硫肥的处理, 而茎中的Cd含量均更低.对比联合施用的处理与仅施用菌株的处理, 联合施用的处理其根、茎中Cd含量更少.由于早稻中联合施用的处理根部Cd含量高于仅施用硫肥的处理, 但茎部Cd含量更低, 与预期结果不符, 故晚稻增测了提取铁膜后的根系样品.与CK相比, 联合施用的处理会促进晚稻根部对Cd的吸收, 但可降低去铁膜根、茎和叶中的Cd含量, 其中去铁膜根部降低了24%~43%, 茎秆降低了13%~29%, 叶片降低了0%~28%.单一施用处理中, S处理去铁膜根和叶中Cd含量最低; M5处理茎中Cd含量最低.联合施用处理中, CM5处理去铁膜根、茎、叶中Cd含量均最低.所有联合施用处理去铁膜根中Cd含量均低于单一施用的处理.
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表 2 水稻各部位Cd含量1)/mg·kg-1 Table 2 Cd content in different parts of rice/mg·kg-1 |
2.3.2 基施硫肥和菌株对水稻各部位As含量的影响
早晚稻各部位As含量如表 3所示.从中可知, 与CK相比, 早稻中各处理均可降低水稻根、茎和叶中的As含量.其中根部降低了11%~60%, 茎秆降低了31%~70%, 叶片降低了38%~63%.单一施用处理中, S处理根中As含量最低; M5处理茎和叶中As含量最低.联合施用处理中, SM5处理降低根和叶中As含量效果最好; CM5处理降低茎中As含量效果最好.联合施用的处理根中As含量均高于单一施用同种硫肥的处理, 而茎和叶中As含量均更低, 这与晚稻的情况也一致.与CK相比, 晚稻中CM5处理降低水稻去铁膜根、茎和叶中As含量效果均最好.
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表 3 水稻各部位As含量/mg·kg-1 Table 3 As content in different parts of rice/mg·kg-1 |
2.3.3 基施硫肥和菌株对籽粒中Cd含量的影响
基施不同处理后, 早晚稻籽粒中Cd含量如图 3所示.从中可知, 所有处理籽粒中Cd含量均低于安全生产标准(0.200 mg·kg-1).联合施用的处理降低早稻籽粒中Cd含量的效果相较于单一施用的处理要更好, 其中CM5处理阻控籽粒积累Cd的效果最佳, 其籽粒中ω(Cd)为0.090 mg·kg-1, 相较于CK降低了51%.与早稻相同, 晚稻所有处理籽粒中Cd含量均达标, 且联合施用的处理降低籽粒中Cd含量的效果相较于单一施用的处理要更好.其中SM5处理阻控籽粒积累Cd的效果最佳, 晚稻籽粒中ω(Cd)为0.015 mg·kg-1, 相较于CK降低了92%.总体来看SM5处理和CM5处理抑制籽粒积累Cd的效果无显著差异.
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图 3 基施硫肥和菌株对籽粒中Cd含量的影响 Fig. 3 Effects of different sulfur applications with M5 on cadmium content in grains |
早稻和晚稻籽粒中不同As形态含量及占比如图 4所示.从中可知, 基施不同处理后, 早稻及晚稻籽粒中无机As含量均有不同程度地减低, 而有机As含量则无明显变化.相较于早稻, 晚稻籽粒中无机As含量占总As比例更少.同时基施硫酸钙及菌株(CM5)后早稻及晚稻籽粒中ω(无机As)均最少, 分别为0.199 mg·kg-1和0.186 mg·kg-1均低于安全生产标准(0.200 mg·kg-1).
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图 4 基施硫肥和菌株对籽粒中不同As形态含量的影响 Fig. 4 Effects of different sulfur applications with M5 on the contents of different arsenic species in grains |
基施不同处理后早晚稻根部ACA-Cd、ACA-As、ACA-Fe和ACA-S的含量如图 5和6所示.各处理早稻ACA-Cd[图 5(a)]和ACA-S[图 5(c)]含量相比CK均显著增加.SM5处理和CM5处理ACA-As[图 5(b)]和ACA-Fe[图 5(d)]含量相比CK均显著增加.由图 6可知, 晚稻根部ACA-Cd、ACA-As、ACA-Fe和ACA-S的含量相较于早稻均有不同程度的降低.与早稻相似, 各处理ACA-Cd[图 6(a)]和ACA-S[图 6(c)]含量较CK均显著增加.除仅基施硫肥的处理外, 其它处理ACA-As[图 6(b)]含量较CK有显著增加.CM5处理能显著提升晚稻根部ACA-Fe含量.
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图 5 早稻根部ACA-Cd、ACA-As、ACA-S、ACA-Fe的含量 Fig. 5 Contents of ACA-Cd, ACA-As, ACA-S, and ACA-Fe in the roots of early season rice |
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图 6 晚稻根部ACA-Cd、ACA-As、ACA-S、ACA-Fe的含量 Fig. 6 Contents of ACA-Cd, ACA-As, ACA-S, and ACA-Fe in the roots of late season rice |
图 7和图 8分别表示了早稻和晚稻不同因素间的相关程度.就籽粒中Cd含量而言, 除非根际土中有效态Cd和As含量外, 其它因素均与其在早晚稻数据分析结果中呈显著相关关系.其中, 籽粒中As及根际土有效态Cd、As含量与其在早晚稻中均呈极显著正相关(P < 0.01);ACA-Cd和ACA-S与其在早晚稻中均呈极显著负相关; ACA-As和ACA-Fe与其在早稻中呈极显著负相关, 在晚稻中呈显著负相关(P < 0.05).就籽粒中As含量而言, 除非根际土中有效态As含量外, 其它因素与其在早晚稻数据分析结果中均呈显著相关关系.其中, 根际土有效态As含量与其在早晚稻中均呈极显著正相关; 而ACA-S与其在早晚稻中均呈极显著负相关.
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1. 籽粒-Cd, 2. 籽粒-As, 3. ACA-Cd, 4. ACA-As, 5. ACA-Fe, 6. ACA-S, 7. 根际Cd, 8. 非根际Cd, 9. 根际As, 10. 非根际As; *P < 0.05, ** P < 0.01, 下同 图 7 早稻各因素相关性分析热图 Fig. 7 Heat map of correlation analysis of various factors in early season rice |
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图 8 晚稻各因素相关性分析热图 Fig. 8 Heat map of correlation analysis of various factors in late season rice |
在本研究中, 单施硫肥或SRB以及联合施用均会显著降低非根际土和根际土中有效态Cd和As含量, 进而导致水稻地上部Cd和As含量的降低.相关性分析的结果显示, 土壤有效态Cd、As含量是影响籽粒中Cd、As含量的重要因素.在淹水条件下, 土壤中的SO42-可被SRB还原为S2-, S2-可与Cd2+反应, 形成CdS沉淀物, 或与FeS和FeS2一起形成共沉淀物或表面沉淀物[25, 26].S2-还会与As3+形成水性硫砷酸盐络合物, 并可能沉淀为无定形的As2S3或AsS, 导致As3+的固定[27, 28], 而As主要以无机As的形式被水稻吸收, 且又以As3+更易被利用[29], 故施用硫肥或SRB会显著降低籽粒中无机As含量.本试验中, 联合施用较单一施用降低有效态Cd、As含量的效果更佳, 其原因可能是由于外源硫的添加促进了硫酸盐还原菌的还原功能.在硫酸盐的还原过程中, SRB主要利用SO42-作为电子受体, SO42-浓度会影响硫酸盐还原的强度[30, 31].Zhou等[32]的研究表明SO42-浓度的提升会促进硫酸盐的还原, 并会增强SRB的有机代谢提升SRB的丰度.Yang等[33]的研究也发现在缺氧条件下外源输入SO42-会增强硫酸盐的还原.
无论土壤中的Cd水平如何, 外源S的添加都会抑制Cd从水稻根部到茎部的转运[34], 其原因可能是随着S供应的增加导致根部S的同化及谷胱甘肽代谢的增加[35].谷胱甘肽是植物体内络合物的前体[36], 水稻根部的植物络合物越多, 液泡对Cd的固存程度就越高, 这可能也是本试验中联合施用的处理其根部Cd含量高于单一施用的原因之一.另一个原因是联合施用会促进根表铁膜的形成以及铁膜对Cd、As的吸附.王丹等[37]的研究也指出外源S能诱导根表铁膜形成.相关性分析的结果说明, ACA-Cd、ACA-As、ACA-Fe和ACA-S含量的增加是引起籽粒对Cd、As累积量降低的重要因素.根表铁膜可以吸附Pb、Cd和As等金属元素, 并影响水稻对其的吸收, 导致金属在植物组织中的转移和分布受到限制[38~40].本研究中由于持续淹水的影响, 水稻土pH值趋于中性并处于还原状态, 这会利于硫酸盐还原菌将SO42-还原成S2-[41], 而S2-又能将MnO2还原成Mn2+; 将Fe3+还原成Fe2+, 加强Mn2+、Fe2+向水稻根表移动形成铁膜[42].基施硫肥或菌株均会促进根表铁膜对硫的吸附, 而硫酸盐对氧化铁有很强的亲和力, 根表铁膜上硫浓度的增加可以抑制Fe(OH)3与铁还原菌的接触, 从而限制铁膜的溶解, 促进铁膜的形成及对金属的固定[43].
早晚稻各部位对于Cd、As积累量的差异, 主要是由于温度、降雨、光照等自然因素及不同水稻品种的影响, 且品种的不同是造成差异的主要因素[44].由于基因型的不同, 不同品种水稻对重金属的耐受性和吸收、转运能力会存在明显的区别[45~47].总体来看, 在本研究中联合施用能降低水稻地上部Cd、As含量及土壤有效态Cd、As含量, 并促进根表铁膜的形成, 但由于试验长期处于淹水状态, 导致土壤中As的活性较高[48], 进而影响籽粒中As的含量.因此, 对于Cd、As复合污染农田的粮食安全生产, 还需进一步优化水分管理措施, 以便达到同时有效阻控籽粒对Cd、As吸收累积的目的.
4 结论(1) 本试验结果显示, 相较于单一施用硫肥或菌株的处理, 联合施用的处理降低籽粒中Cd、As含量的效果要更好, 其中以CM5处理最佳, SM5处理次之, 两种处理均能确保籽粒中Cd含量达安全生产标准.
(2) SM5和CM5处理会促进水稻根表铁膜的形成, 且SM5处理对水稻产量有促进作用.
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