2023, Vol. 44
2. 西北农林科技大学苹果试验站, 白水 715600
, LIANG Kai-lin1 , JI Bing-jie1 , ZHENG Zhao-xia1,2 , ZHAO Zhi-yuan1,2 , LI Li-min1 , LI Zi-yan1,2 , ZHENG Wei1,2
, ZHAI Bing-nian1,2
2. Apple Experimental Station of Northwest A&F University, Baishui 715600, China
土壤酶是土壤生态系统的重要组成部分, 参与土壤中的众多生物地球化学过程, 对土壤养分循环与转化、有机质的分解与固存等有着重要的意义, 是评价土壤质量和生态环境变化的重要指标[1~5].其中, β-1, 4-葡萄糖苷酶(BG)、β-1, 4-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶(NAG)、L-亮氨酸氨基肽酶(LAP)和碱性磷酸酶(PHOS)与土壤中C、N、P元素的周转和微生物代谢密切相关, 是微生物养分需求和资源配置的重要指标.Sinsabaugh等[6]提出应用生态化学计量学研究自然生态系统中的酶活性, 来衡量土壤微生物养分需求与土壤养分供给之间的关系[6~9], 该方法已被广泛用于研究土壤微生物能量和养分资源限制状况[2, 6, 10].此外, Moorhead等[8]提出通过BG∶(NAG+LAP)、BG∶AP、(NAG+LAP)∶AP来计算生态酶化学计量的矢量长度和角度, 以量化土壤微生物是受C限制还是受N或P限制, 可有效反映土壤微生物代谢限制、养分需求和环境因子有效性之间的生物地球化学平衡.
近年来, 基于酶化学计量学进行土壤微生物代谢的研究在森林、草地和农田等生态系统中得到了广泛的应用, 结果表明不同生态系统土壤微生物代谢限制受多种因素的影响[2, 10~13].有研究表明, 土壤酶活性和酶化学计量在不同植被类型间也存在显著差异, Cui等[2]认为其差异的主要原因在于植物根系系统和生理过程的不同.然而, He等[14]研究认为, 森林土壤酶化学计量受气候和根系的影响较小.另外, 有研究表明土壤酶活性与温度之间存在正相关[11]、负相关[9, 15]和无显著相关关系[16]等不同的结果.一项全球尺度的研究发现, 与土壤C、N、P循环相关的土壤酶化学计量比, 即ln BG∶[ln(NAG+LAP)]∶ln AP约为1∶1∶1[16], 这意味着在全球尺度上土壤酶C∶N∶P相对稳定, 趋于内稳态结构[2, 17].然而, 在特定的生态系统中, 这一比例将被不同的环境因子打破.例如, Peng等[9]研究发现与土壤C、N、P循环相关的酶活性比值为1∶1.2∶1.4, 偏离了1∶1∶1的比值, 认为在中国北方温带系统中, 土壤微生物C、N和P的化学计量是养分依赖型的, 而非内稳态.同样地, Rosinger等[18]研究指出土壤酶化学计量法得到的养分限制模式与养分添加试验得到的养分限制模式不一致, 这也说明土壤微生物的养分需求是影响土壤酶化学计量的主要因素.因此, 分析特定环境下土壤酶化学计量特征, 来衡量土壤生态系统养分周转和养分限制状况尤为重要.
有机无机肥配施作为保持土壤生产力和减少化肥施用的一种传统而有效的方法, 可以达到节约成本和增加养分有效性的双重作用[19~23].由于有机肥具有养分的缓效性, 单施有机肥会造成养分供给不足, 致使产量下降[24~28], 而过量施用化肥增产效果不显著, 甚至导致较高的土壤氮素残留[29, 30], 并引起一系列土壤及环境问题.有研究表明, 化肥配施有机肥显著提高作物产量、改善土壤养分含量和土壤质量, 对维持土壤的可持续利用具有深远意义[31, 32].因此, 适量的有机肥配施化肥是苹果园一项提升土壤质量的合理施肥技术.然而, 基于土壤酶化学计量学, 从微生物资源限制角度出发, 深入探索长期有机无机肥配施对土壤酶化学计量特征、土壤元素平衡和限制状况的研究还鲜见报道.本研究依托西北农林科技大学白水苹果试验站, 分析土壤酶化学计量对长期有机无机肥配施处理下果树不同生育期的响应特征, 探讨长期不同施肥微生物养分限制和酶活性表达的反馈机制.旨在: ①探讨长期不同施肥土壤酶活性及其化学计量的差异, 以及深入分析土壤酶化学计量与土壤养分之间的关系; ②评价长期不同施肥下土壤性质的差异并探究调节土壤微生物代谢限制的途径; ③阐明土壤微生物碳、磷限制对果园土壤微生物碳周转的影响.
1 材料与方法 1.1 试验地概况和试验设计本试验在西北农林科技大学白水苹果试验站进行, 该试验站位于陕西省白水县(109°56′E, 35°21′N), 海拔838 m, 年平均气温11℃, 年降水量为570 mm, 降雨量的60%集中在7~9月, 属于暖温带大陆性季风气候.试验区土壤为黄绵土(粉质壤土: 沙粒8%、粉粒67%、黏粒25%).苹果园于2005年5月建立, 供试品种为长富2号, 种植密度为1 200株·hm-2, 试验前0~20 cm土壤的基本理化性质如下: pH为8.30, 土壤ω(有机质)为13.02 g·kg-1, ω[全氮(TN)]为1.03 g·kg-1, ω[速效氮(AN)]为24.9 mg·kg-1, ω[有效磷(AP)]为15.94 mg·kg-1, ω(速效钾)为151.3 mg·kg-1.
施肥试验建立于2008年.试验设置4个处理: 不施肥(CK); 单施氮磷钾化肥(NPK); 有机肥配施化肥(MNPK)以及单施有机肥(M).每个处理小区面积约为200 m2, 重复3次, 随机区组排列.施肥方式为沟施, 深度约为40 cm, 试验施用氮、磷和钾肥为尿素、普通过磷酸钙和硫酸钾, 有机肥为羊粪[ω(有机质)为35 g·kg-1、ω(AN)为5.3 g·kg-1、ω(AP)为39 mg·kg-1和ω(有效钾)为41 mg·kg-1], 具体施肥量如表 1所示.其中, 有机肥和磷肥均于秋季果实收获后(10月下旬)一次性基施, 氮、钾化肥分3次施入(50%于秋季果实收获后基施, 余下的30%和20%分别于开花期、果实膨大期进行追施).
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表 1 果园处理及施肥情况 Table 1 Treatments and fertilizer application rates for the apple orchard |
1.2 样品采集与分析
土壤样品的采集在田间施肥处理9 a后进行, 分别在果树萌芽期(3月底)、膨果期(7月初)和成熟期(10月初) 采集0~20 cm土壤样品, 每个小区分别在树盘和树行下各采集6份土壤样品, 并将样品充分混合作为一个代表样品.随后将土壤样品过2 mm筛并分成3份, 一份放置于4℃冰箱内进行冷藏, 测定土壤酶活性; 一份鲜土用于测定土壤含水量和硝、铵态氮含量; 一份进行自然风干, 用于测定土壤其他理化指标(有机碳、全氮、速效磷等).在果树萌芽期、膨果期和成熟期采集植物样品, 每个处理随机选定5株树, 分别从每棵树的东、西、南、北方向共采集20片植物叶片, 用于测定叶片全氮和全磷含量.
土壤含水量(SWC)采用烘干法测定; 土壤有机碳(SOC)采用K2CrO7-H2SO4氧化法测定; 可溶性有机碳(DOC)的测定采用0.5 mol·L-1 K2SO4浸提并振荡45 min, 浸提液采用TOC分析仪测定(Elementar, Germany)[33]; 全氮含量采用凯氏定氮法测定[34]; 硝态氮和铵态氮含量用1 mol·L-1 KCl浸提, 振荡30 min, 过滤后的滤液用连续流动分析仪测定(AAS, SEAL Company, Germany); 全量养分的测定方法为浓硫酸-过氧化氢消煮, 半微量凯氏定氮法测定全氮含量, 钼锑抗比色法测定全磷(TP)含量.土壤速效磷含量采用碳酸氢钠-钼锑抗比色法测定.
1.3 微生物量碳和土壤酶活性测定微生物量碳、氮和磷(分别记为microC、microN和microP)采用氯仿熏蒸浸提法进行测定[35, 36], 转化系数分别为0.45、0.54和0.40[37].采用微孔板荧光法[38]测定4种与C、N、P循环相关的土壤酶(β-1, 4-葡萄糖苷酶, BG; β-1, 4-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶, NAG; L-亮氨酸氨基肽酶, LAP; 碱性磷酸酶, PHOS)活性.分别选用4-MUB-β-D-葡萄糖苷、4-MUB-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷、L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素和4-MUB-磷酸作为测定BG、NAG、LAP和AP的荧光底物.主要过程为: ①土壤悬浮液的制备, 土水质量比为1∶125; ②土壤样品孔的制备, 取200 μL悬浮液和50 μL酶底物加入到96微孔板中, 重复6次; ③阴性对照孔的制备, 200 μL去离子水和50 μL酶底物加入到96微孔板中, 重复6次; ④样品对照孔的制备, 取200 μL悬浊液和50 μL去离子水加入到微孔板中; ⑤参考标准孔的制备, 200 μL去离子水和50 μL酶的标准液加入到微孔板中; ⑥淬火孔的制备, 取200 μL悬浊液和50 μL酶标准液加入到微孔板中.将加好样品的微孔板放置于25℃黑暗培养4 h.采用酶标仪(Tecan M200 PRO)进行荧光检测, 激发波长为365 nm, 发射波长为450 nm[39].对阴性对照、空白和淬火标准孔的荧光测量进行校准, 测定的酶活性表示每g土壤有机质每h释放底物的纳摩尔数[nmol·(g·h)-1].
1.4 化学计量内稳态、微生物养分限制和碳利用效率的计算微生物养分内稳态程度(H′)的计算公式如下:
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(1) |
式中, m为ln(N∶P)土壤与ln(N∶P)微生物的线性回归斜率, 或ln(N∶P)土壤与ln(N∶P)植物的线性回归斜率.若H′≫1表示有较强的内稳态, H′≈1表示内稳态程度较弱或不存在内稳态[17].
酶化学计量比的矢量长度(vector length)和矢量角度(vector angle)用于量化微生物养分受限的相对程度.矢量长度表示C受限[公式(2)], 矢量角度表示N或P受限[公式(3)].
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(2) |
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(3) |
式中, x为C循环相关土壤酶与P循环相关土壤酶活性的相对比值[BG∶(BG+PHOS)], y为C循环相关土壤酶与N循环相关土壤酶活性的相对比值[BG∶(BG+NAG+LAP)][8, 10].矢量长度值越大, 表示微生物相对C限制越严重; 矢量角度＜45°和＞45°分别表示微生物N限制和P限制的相对程度.
微生物碳利用效率(CUE)采用生物地球化学平衡模型(biogeochemical-equilibrium model)[7]进行计算, 如公式(4)~(6).
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(4) |
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(5) |
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(6) |
式中, EEAC∶N为BG∶(NAG+LAP); EEAC∶P为BG∶AP; LC∶N和LC∶P为不稳定底物的C∶X量比, DOC、AN和AP用于计算C、N和P的不稳定性底物有效性; 微生物量(C∶N)和(C∶P)(BC∶N和BC∶P)也以量比进行计算; KC∶N和KC∶P为半饱和常数(0.5), CUEmax为0.6[7].
1.5 统计分析采用SPSS软件包进行单因素方差分析(ANOVA), 检验不同处理对叶片养分含量、微生物量、微生物养分限制以及CUE的影响, 平均值采用Duncan比较检验, 并在0.05水平上差异显著(SPSS 20.0 Inc. USA).采用双因素方差分析(ANOVA)比较处理、生长期及其交互作用对上述测定指标的影响.采用线性回归(广义线性模型)分析土壤有效磷与叶片磷含量、微生物C限制和微生物N或P限制、微生物和植物元素化学计量内稳态、及微生物代谢限制与CUE之间的线性关系(SigmaPlot 12.5, Systat Software Inc. San Jose, CA).
采用冗余分析(RDA)确定土壤酶、微生物量和土壤基本理化性质之间的关系.为确定影响土壤酶活性和酶化学计量的显著因子, 对酶活性数据进行Hellinger转换, 并使用R v. 3.1.3中的Vegan软件包对环境因子数据进行标准化处理.采用结构模型方程(SEM)进一步确定影响微生物代谢限制的可能途径, 该模型在SPSS AMOS v. 24.0(https://www.ibm.com/)中进行.采用IBM SPSS 20.0(SPSS Inc. USA)进行Spearman相关分析, 确定微生物养分限制与CUE之间的关系.
2 结果与分析 2.1 长期有机无机肥配施下微生物量碳氮磷和果树养分含量在不同生育期中不同施肥处理显著影响土壤微生物量碳氮磷含量(图 1).结果表明, 在果树不同生育期, 施用有机肥处理(MNPK和M)的土壤microC含量显著高于不施有机肥处理(CK和NPK).microN含量, 与CK相比, 果树萌芽期NPK、MNPK和M处理分别增加了89%、269%和213%, 并均与CK处理达到显著差异水平; 膨果期和成熟期, 除M处理显著高于CK和其他施肥处理外, NPK和MNPK处理均与CK处理无显著差异.土壤microP在果树不同生育期表现略有差异, 萌芽期和膨果期表现为施肥显著提高了microP含量, 尤其是有机肥的施用显著高于单施化肥处理; 成熟期单施化肥处理的microP含量与CK无显著差异, 有机肥施用处理(MNPK和M)显著高于CK和NPK处理.双因素方差分析也发现, 施肥处理、果树生育期及其两者交互作用均对microC、microN和microP有显著影响(P＜0.01, 图 1).
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microC: 微生物量碳; microN: 微生物量氮; microP: 微生物量磷; 误差棒表示数值±标准误差(n=3); 不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05); **表示P＜0.01, ***表示P＜0.001 图 1 不同生育期不同处理苹果园土壤微生物量碳氮磷差异 Fig. 1 Variations in microbial biomass at different treatments in different stages in an apple orchard |
不同生育期, 施肥显著影响果树叶片全氮、全磷含量及氮磷比(表 2).相比于施肥处理, CK处理在萌芽期有较高的叶片ω(N)和ω(P)(29.8 g·kg-1和2.17 g·kg-1), 而膨果期和成熟期的叶片氮、磷含量逐渐降低, 并且各处理的叶片氮磷含量均随着果树的生长而降低.从双因素方差分析结果也可看出, 不同处理对叶片氮、磷含量的影响不显著, 而生育期以及处理和生育期的交互作用对叶片氮、磷含量有显著影响.从叶片氮磷比中可以看出, 单施有机肥显著增加了膨果期叶片氮磷比, 比CK处理增加了11%; 而成熟期施肥处理均显著降低了叶片氮磷比, 尤其是NPK和M处理叶片氮磷比最低, 比CK处理分别降低了14%和18%.处理、生育期及其交互作用对氮磷比均有显著影响.另外, 本研究发现仅果树萌芽期的叶片磷含量与土壤有效磷含量呈显著负相关(P＜0.05, 表 2).
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表 2 不同处理及作物不同生育期叶片N、P含量及其比值1) Table 2 Variations in apple leaf N and P contents and leaf (N∶P) in different treatments and growth stages |
2.2 长期有机无机肥配施下酶化学计量的矢量特征和化学计量内稳态特征
根据BG∶(BG+NAG+LAP)与BG∶(BG+PHOS)生态酶化学计量的结果发现, 本研究中的所有数据点均在1∶1线以上, 表明微生物代谢存在较强的磷限制[图 2(a)].在不同生育期, 矢量长度和角度的变化范围分别为0.56~0.79和59.3°~67.7°, 且在不同生育期中不同处理间的变化趋势不同[图 2(b)和图 2(c)].从不同处理来看, 各生育期内, M处理的矢量长度显著低于CK(14%)、NPK(24%)和MNPK(23%)处理, 而MNPK处理的值最高(平均为0.75)[图 2(b)].同样地, 矢量角度在各生育期中不同处理间表现不一致[图 2(c)].整体上, 本研究中矢量角度均>45°, 表现为较强的P限制.萌芽期, CK处理的矢量角度值最大, 显著高于NPK处理, 其次为MNPK处理; 膨果期, 矢量角度在不同处理中表现为: M>MNPK>NPK>CK, 且各处理间差异达到显著水平; 成熟期, M处理的矢量角度显著高于其他处理, 其次为CK处理, NPK和MNPK处理的值最低.通过矢量长度和角度的线性回归分析发现, 在不同生育期中两者均呈现出负相关关系, 并且在果树膨果期和成熟期两者达到显著相关[P＜0.05, 图 2(d)].
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BG: β-1, 4-葡萄糖苷酶, NAG: β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶, LAP: L-亮氨酸氨基肽酶, PHOS: 碱性磷酸酶; 误差棒表示重复间的标准误差(n=3); 不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05); *表示P＜0.05, ns表示无显著性差异 图 2 不同生育期不同处理的苹果园土壤酶化学计量比和矢量特征 Fig. 2 Enzymatic stoichiometry of the relative proportions of C to N acquisition versus C to P acquisition |
为探究土壤微生物和果树的化学计量内稳态特征, 对微生物量ln(N∶P)、叶片ln(N∶P)与土壤ln(N∶P)进行线性回归分析(图 3), 发现除了萌芽期的土壤微生物量ln(N∶P)与土壤ln(N∶P)有显著正相关关系(P＜0.01)之外, 其他生育期的微生物元素比值以及全生育期的植物ln(N∶P)与土壤ln(N∶P)之间均无显著相关性(P＞0.05).另外, 结合线性关系的斜率＜1并且呈不显著关系(P＞0.05), 表明在各生育期微生物和植物均有较强的内稳态性质.
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图内不同颜色的实线表示不同生育期的线性回归拟合线 图 3 土壤微生物和作物在不同生育期的养分内稳态特征分析 Fig. 3 Identification of elemental homeostasis for soil microorganism and leaf in the different stages |
RDA分析表明, 在果树生长阶段, 土壤理化性质对BG、NAG、LAP和PHOS的酶活性以及microC、microN和microP均有显著影响[图 4(a)].随机森林模型分析结果发现, SOC和AN是影响矢量长度的主要理化因子, 而AP、AN和SWC是影响矢量角度的主要理化因子[图 4(b)].SEM分析表明, 土壤理化性质和微生物量碳氮磷对微生物C限制和微生物P限制有直接或间接的影响[图 5(a)].从矢量长度分析, AN和DOC直接影响microC和microN, AP直接影响microP和microN, 并且DOC和AP直接影响矢量长度.从矢量角度分析, AP和microN直接影响矢量角度.
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BG: β-1, 4-葡萄糖苷酶, NAG: β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶, LAP: L-亮氨酸氨基肽酶, PHOS: 碱性磷酸酶, microC: 微生物量碳, microN: 微生物量氮, microP: 微生物量磷, SWC: 土壤含水量, TN: 全氮, SOC: 土壤有机碳, TP: 全磷, AN: 速效氮, DOC: 可溶性有机碳, AP: 速效磷, %IncMSE: 相对重要性; 蓝色箭头表示土壤理化性质, 红色箭头表示酶活性及微生物量特征; ***表示土壤性质对排序结果呈极显著相关(P＜0.001) 图 4 土壤酶活性、微生物量和土壤基本理化性质的关系 Fig. 4 Relationships between soil enzymes, microbial biomass, and soil properties |
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红色箭头和蓝色箭头分别表示正效应和负效应(P＜0.05), 箭头上的数字为标准化路径系数, 绿色数字为模型解释因变化量的方差百分比; CUE: 微生物碳利用率, AN: 速效氮, DOC: 可溶性有机碳, AP: 速效磷, microC: 微生物量碳, microN: 微生物量氮, microP: 微生物量磷 图 5 微生物碳磷代谢限制的主要路径及其与微生物碳利用率的关系 Fig. 5 Major pathways that influenced microbial C and P nutrient limitation and its relationship with CUE |
不同生育期, 微生物碳利用率在不同处理中的变化趋势相似(图 6).与CK相比, NPK和MNPK处理微生物碳利用率在各生育期中平均增加了39%和34%, 且与CK处理间达到差异显著(P＜0.05); M处理在萌芽期和膨果期均显著高于CK处理, 分别增加了32%和18%(P＜0.05), 成熟期CK和M处理间无显著性差异.双因素方差分析结果也表明, 处理、处理×生育期对微生物碳利用率有显著影响.另外, 还分析了微生物碳利用率与微生物代谢限制之间的关系[图 5(b)], 结果发现微生物碳利用率与矢量长度呈显著正相关(P＜0.05), 与矢量角度呈显著负相关(P＜0.05).
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误差棒表示重复间的标准误差(n=3); 不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05); *表示P＜0.05, ns表示无显著性差异 图 6 不同生育期不同处理的苹果园土壤微生物C利用率 Fig. 6 Microbial carbon use efficiency in an apple orchard at different treatments in different stages |
有研究表明, 在干旱和半干旱地区不同植物不同管理措施间的C∶N∶P化学计量学特征具有显著的差异性[40, 41].有研究发现, 在林地植被自然演替过程中, 并未发现植物存在内稳态特征[12].而本研究中, 长期有机无机肥配施果树叶片ln(N∶P)与土壤ln(N∶P)在不同生育期均无显著相关性, 并且线性斜率＜1, 表明果树对养分的吸收一直保持较强的化学计量内稳态特征[图 3(b), P＞0.05].萌芽期, 果树生长所需的养分主要来源于前一年植物吸收养分后贮藏在树体内的N、P养分, 因此该时期植物存在较强的养分内稳态特征; 膨果期, 果树生长需要大量的营养物质, 但该时期叶片ln(N∶P)与土壤ln(N∶P)相关关系不显著, 主要因为膨果期进行了追肥, 肥料中的N、P养分完全能够满足果树生长发育的需求.另外, 本研究也发现在该时期叶片P含量与土壤有效磷含量不存在显著的相关关系, 这也从另一方面验证了膨果期果树养分的吸收主要依赖于肥料而不是土壤; 成熟期, 叶片逐渐脱落, 果树本身不需要大量的养分来供给生长发育, 因此, 在该阶段观察到果树养分的内稳态特征.
与植物吸收养分的内稳态特征不同, 在果树萌芽期, 微生物量ln(N∶P)与土壤ln(N∶P)呈显著正相关, 表明微生物对N、P的吸收依赖于土壤[图 3(a)].可能的原因在于萌芽期果树生长不需要消耗土壤或肥料中的养分, 大部分肥料源养分和土壤源养分主要用于微生物的生长与繁殖, 显著提高的生物量刺激其消耗更多的养分, 表现出养分依赖型特征[42].另外, 施用有机肥也增加了土壤微生物量与酶活性, 促进土壤生态系统中的养分循环[43]; 相似地, 施用化肥直接增加了养分投入, 刺激根系分泌物的分泌, 从而向微生物提供一定量碳源, 且无机氮肥能调节土壤C∶N值, 这也进一步体现出微生物可以通过优化酶促合成过程中C、N和P等养分的分配来获得相对稀缺的资源[2, 6].而在膨果期和成熟期微生物养分吸收表现为内稳态特征, 这与其他研究的结果相似[44, 45], 可能的原因是大多数土壤微生物都有固定氮素的能力, 而另外一部分微生物则能矿化土壤中难溶性磷, 用于自身的生长与发育[46, 47].此外, 根据酶化学计量学特征发现在果树整个生长阶段微生物代谢均受磷限制[图 2(a)], 说明果树根系对土壤磷的吸收减少了土壤中的有效磷含量, 这与微生物获取土壤磷形成了养分竞争的现象, 从而导致了微生物磷限制的发生[48].此外, 磷素在碱性土壤中可能与钙、镁离子结合形成难溶性磷, 固定于土壤中[49, 50], 因此土壤磷是该区果园的主要限制元素, 这与在黄土高原进行的其他研究的结果一致[2].
进一步地, 本研究发现施肥处理、生育期以及两者的交互作用均对微生物磷限制产生较大的影响[图 2(c)].在果树萌芽期、膨果期和成熟期, NPK处理的微生物磷限制均处于较低水平, 原因在于长期施用化肥增加了该处理的土壤有效磷含量[图 2(c)], 直接缓解了微生物磷限制程度.而膨果期和成熟期单施有机肥处理的微生物磷限制程度显著高于其他处理, 一方面在于该时期果树生长需要消耗大量的磷素, 而有机肥中携带的可直接利用磷素含量较低, 且有机磷需要一定的时间、适当的温度和水分以及相应的微生物分解等条件才能矿化成可利用的磷[51, 52], 因此, 果树对磷的消耗, 不管是土壤磷或是肥料磷, 均与微生物对磷素的获取形成了竞争, 随之微生物磷限制程度也相应增加[44, 48].而化肥与有机肥配施管理则能缓解微生物磷限制程度, 并且MNPK处理的TN∶TP显著高于CK处理, 其DOC∶AP显著低于CK和M处理(数据未展示), 也说明了有机无机肥配施能有效促进土壤磷库的活化, 并且有机肥带入大量的有机氮, 微生物分解有机质释放有效磷的潜力也相应增大, 这些均有利于土壤磷素利用率的提高.在不同生育期对同一施肥处理下矢量长度差异不显著; 而对矢量角度有显著影响.这也从双因素方差分析的结果中可以看出, 生育期对矢量角度有显著影响(P＜0.05), 说明在同一施肥处理下果树不同生育期对微生物磷限制有显著差异.主要的原因在于: 一是施入土壤的肥料提供的可利用P素的量以及形态均存在较大差异, 如有机肥携带的可直接利用磷素含量较低, 而长期施用化肥处理的土壤有效磷含量相对较高; 二是果树不同生育期对不同养分的需求也存在较大的差异, 如萌芽期果树生长消耗的养分大多来源于树体上一年储存的养分, 对土壤源养分消耗较少, 而膨果期和成熟期果树的生长需要消耗大量的P素.
3.2 长期有机无机肥配施对微生物碳限制的影响微生物碳限制在不同处理间表现不同, 单施有机肥处理在不同生育期均表现为较低的微生物碳限制[图 2(b)], 原因在于连续9 a施用有机肥显著增加了土壤有机碳、可溶性有机碳含量以及DOC∶AP(数据未展示), 从而使微生物更易于获得可利用的碳源.而单施化肥和有机无机肥配施提供了大量的N、P养分, 而C的投入较少甚至没有.此时大量的土壤微生物需要消耗更多的土壤C源来供给自身的生长发育, 从而导致该处理的土壤C限制较高.另一方面, 单施化肥和有机无机肥配施处理, 显著增加了AP和AN含量, 降低了DOC∶AP值, 也说明该处理的微生物C代谢增加.有研究同样发现, 土壤AN和AP含量与土壤微生物碳代谢有显著正相关关系[53, 54].
微生物C、P限制的相关分析表明, 微生物C、P限制在膨果期和成熟期存在较强的相关性, 而在果树萌芽期相关性不显著[图 2(d)].总的来说, 较高的C限制表明土壤有机质分解的可能性较大, 这是由于与C相关的分解酶活性增加所致[12].土壤有机质分解可以释放更多的有效磷, 缓解微生物对磷素的限制[12].本研究中, 较高的微生物C限制同时降低了土壤中微生物P限制, 可能是因为微生物C代谢的增加导致了有机质的分解, 使得更多的有效磷从有机质中被释放出来[12, 53, 55].
3.3 微生物碳、磷限制对果园微生物碳周转的影响有研究表明, 微生物CUE与微生物C、P限制均有显著的相关性[56, 57].同样地, 本研究也发现微生物CUE与微生物P限制呈显著负相关[图 5(b)].本研究还发现土壤微生物群落在果树膨果期和成熟期存在养分吸收的内稳态特征, 从而也说明在养分竞争条件下微生物群落试图保持一个稳定、平衡的内部环境, 以保证其正常的功能[58].随着果树生长对土壤有效磷消耗的增加, 土壤微生物P限制相对增加, 破坏了土壤微生物养分内稳态.因此, 为了抵抗磷限制实现元素内稳态, 微生物将更多的能量从用于微生物自身的生长发育转移到通过细胞胞外酶产生更多分解磷相关的酶[44], 从而获取更多的磷素.前人的研究同样发现微生物P限制和微生物CUE之间存在潜在的权衡机制[59].本研究中, 微生物C限制主要受土壤AP和土壤C含量的影响(图 4和图 5), 土壤AP含量的增加可为微生物生长提供更多的P素, 从而增加微生物C代谢.同样, 本研究发现随着微生物C限制的增加, 微生物CUE也相应地增加[P＜0.05, 图 5(b)], 微生物代谢限制作为最重要的代谢特征, 其中土壤养分的有效性直接关系到微生物的生长和代谢.例如在果园生态系统中, 每年果树落叶可以向土壤中提供大量的新鲜C源, 用于微生物的生长和代谢.当可利用的营养物质缺乏时, 土壤微生物分解有机质释放更多的C源从用于繁殖生长到维持生长进行转变.另外, 土壤有效磷为微生物产能提供了更多的磷, 从而促进了微生物C代谢.因此, 该结果为苹果园有机无机肥配施条件下基于土壤酶化学计量学, 研究土壤微生物C、P代谢和C周转提供理论和实践参考.
4 结论(1) 不同施肥处理显著影响果园微生物量碳氮磷含量、酶活性及其化学计量, 并且在果树不同生育期(萌芽期、膨果期和成熟期)表现不同.
(2) 土壤酶化学计量分析表明, 在整个果树生育期, 土壤微生物代谢均受P限制.微生物C限制在不同生育期不同处理下表现不同, 并且土壤碳和速效氮含量是影响微生物碳代谢的主要因素.另外, 微生物碳利用率与微生物碳、磷限制显著相关.
(3) 土壤碳和有效磷对土壤碳代谢有直接的影响, 土壤有效磷的增加可以使更多的磷用于微生物的产能, 并增加微生物碳代谢.
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