2023, Vol. 44
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 广西大学生命科学与技术学院, 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 南宁 530005;
4. 北京市水科学技术研究院, 北京 100048
, ZHANG Yao-fang4 , LI Tian-yu4 , YE Zhi-han4 , SHEN Pei-hong3 , WEI Yuan-song1,2 , GAO Chao-long1,2 , SONG Shu-xing1,2 , ZHANG Jun-ya1,2
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China;
4. Beijing Water Science and Teachnology Institute, Beijing 100048, China
河流生态系统的生态化学计量学特征根据污染程度不同, 起主导作用的元素差别显著.河流污染一般经过3个阶段：黑臭治理阶段(有机物污染为主)、富营养化控制阶段(氮磷等无机物污染为主)和病原微生物控制阶段(生物污染为主), 污染阶段不同, 关键化学元素亦有差异.黑臭水体治理阶段, C元素起主导作用, 该阶段以控制COD为主[1].随着我国“水污染防治行动计划”(水十条)的严格实施, 以及连续3个“五年”水专项工作的贡献, 有效控制了河流的黑臭问题.而污水处理厂的增加和污水处理率的提高, 污水由直排变为处理后通过尾水排放, 大幅削减C、N、P等, 河流污染的防治进入以氮磷等无机物为主的富营养化控制阶段.
密云水库是北京市的重要水源地, 在保障首都水源安全中起着关键性枢纽作用.2019年7月23日密云水库最大蓄水量超过26亿m3, 水质稳定在《地表水环境质量标准》 (GB 3838-2002)Ⅱ类标准.但2008~2019年密云水库及入库河流总氮指标总体呈现波动上升趋势, TN指标超过地表水Ⅱ类限值[2, 3].密云水库氮主要源于入库河流氮输入、大气氮沉降和消落区氮释放等, 2008~2019年由入库河流带来的TN负荷平均占比达85%, 远超其他来源; 而COD和TP等其它水质指标, 密云水库和入库河流均能稳定在地表水Ⅱ类标准[2, 4].因此, TN成为影响密云水库入库河流中生态化学计量学的关键因素.
微生物在自然界中氮素形态的转化起到了主导作用.水体中由于硝化菌、反硝化菌和厌氧氨氧化菌等的广泛存在, N元素存在不同形态之间的相互转化：NH4+-N NO2--N NO3--N N2O N2.而污水生物处理过程中的N2O和N2进入大气环境, 削减进入受纳水体中的N[5, 6], 改变河流中的生态化学计量学特征[7~9].相对水体, 河流底质中微生物数量和种类则更加丰富.
半城子水库位于密云水库上游入库河流牤牛河上, 每年可向密云水库输水约300万m3, 对密云水库起着重要作用[10].因此, 本文以密云水库上游典型入库河流牤牛河为例, 开展密云水库入库河流中“以氮元素为核心”的生态化学计量学研究, 考察各形态氮素变化的空间分布规律, 并明确河流中氮素形态转化与水体和底质中微生物群落间的相互关系, 从微生物群落组成和功能预测的角度, 解析氮素形态的转化, 以期为河流水体改善和氮素污染削减提供理论参考, 且对密云水库水质保障和水生态保护具有一定的理论价值和现实意义.
1 材料与方法 1.1 区域概况研究区域为密云水库上游牤牛河流域(包含半城子水库在内).牤牛河是半城子水库的主要入库河流, 长19.9 km, 流域面积为47.0 km2.半城子水库位于密云区不老屯镇半城子村北, 在密云水库上游二、三级保护区范围内[11].水库建于1976年, 总库容1 020万m3, 属于中型水库, 每年向密云水库输水约300万m3[10].本研究于2021年11月对密云水库上游牤牛河流域进行采样, 为全面反映密云水库来源水质情况, 监测点名称和位置设置如图 1所示.干流和主要支流共设置11个采样点, 其中S1~S8为牤牛河流域采样点, R1~R3为半城子水库采样点; 水体样品和底质样品取样地点一致, 半城子水库未收集底质样品.
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图 1 牤牛河采样点设置示意 Fig. 1 Sampling sites of Mangniu River |
于水面下10~20 cm处采集2 L水体样品; 同点位采集相应河流底质.由于牤牛河流速较快, 底质冲刷较重, 河床底质以砾石为主.本研究共采集了11个水体样品和8个底质样品.水体样品命名为S1_W~S8_W (河流)和R1_W~R3_W (库区), 底质样品命名为S1_S~S8_S.冷藏所有样品并于当天运回实验室, 于4℃保存, 24 h内测定相关指标.样品的采集、保存按照《环境水质监测质量保证手册》(第二版) 要求进行.
1.2.2 常规指标检测分析测定水质的7个常规指标：总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、总磷(TP)、正磷酸盐(PO43--P)和化学需氧量(COD)等指标.水质监测和分析方法按《地表水和污水检测技术规范》(HJ/T 91-2002)规定的分析方法执行.
1.3 样品DNA提取和微生物群落结构分析采用抽滤设备, 过滤500 mL水样于0.22 μm无菌滤膜, 剪碎滤膜置于-80℃保存.取2~3块底质样品, 采用浸润PBS的无菌棉签, 擦拭底质样品表面, 截取棉签头-80℃保存.采用FastDNA SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, USA) 试剂盒进行DNA提取.通过1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000对DNA提取效果进行质检和浓度测定.本研究DNA样本交由上海美吉生物医药科技有限公司进行质量检测、扩增、纯化和测序.采用引物515F (5′-GGACAGAAAGACCCTATGAA-3′)和806R (5′- TCAGCCTGTTATCCCTAGAG-3′)对微生物16S rRNA的V3~V4区域进行PCR扩增, 目标片段大小约为290 bp[12].PCR扩增产物经检测、纯化和定量分析后, 构建MiSeq文库, 利用Illumina MiSeq (PE300) 测序平台进行高通量测序.
高通量测序原始数据使用Fastp软件[13]进行质控后, 每个样本平均有效读条(reads)为149 932.后续处理基于QIIME2 2021.4实现[14].首先采用双末端合并方式将原始数据导入QIIME2, 然后使用DADA2去除引物、降噪, 拼接, 获得扩增子序列变体(ASV)[15].比对RDP 16S rRNA数据库[16]对每条ASV进行物种分类注释, 得到各样本的物种分类信息.
1.4 统计分析采样点分布地图基于ArcGIS 10.3 (Esri, USA) 绘制.本研究的图片制作通过Origin 2018 (OriginLab, USA) 完成, 所有试验数据采用Excel 2016 (Microsoft, USA) 软件进行预处理和误差分析; 运用SPSS 26.0 (IBM, USA) 进行统计分析, 组间差异性分析采用one-way-ANOVA, 显著性分析采用t检验.使用MOTHUR软件计算各个样品的α多样性指标; 使用HemI 1.0 (http://hemi.biocuckoo.org/down.php) 构建热图; 采用Canoco 5.0 (Microcomputer Power, USA) 进行主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA); 网络结构分析基于微生物群落结构(基于ASV) 的Spearman相关关系, 从中挑选具有显著相关的项(P<0.05), 通过软件Gephi (https://gephi.org/users/download/gephi-0.9.2)绘图.采用PICRUSt2软件进行功能预测, 参考KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库, 得到KO (KEGG Orthology)功能和KEGG Module的丰度预测.
2 结果与讨论 2.1 密云水库上游牤牛河水体理化性质解析如图 2所示, 密云水库上游ρ(TN)高, 整体均值为(6.62±2.17) mg·L-1, 超地表水Ⅲ类标准3.0~9.5倍.监测点S2_W和S6_W的ρ(TN)最高, 分别为11.574 mg·L-1和9.223 mg·L-1; S5_W最低(3.325 mg·L-1).以半城子水库为分界, 库区(R1_W~R3_W)的TN浓度低于入库前(S1_W~S5_W)和入库后(S6_W~S8_W).且TN中以NO3--N为主, 占比为77.68%~92.94%, 不同监测点的ρ(NO3--N)趋势与TN相同.入库河流TN浓度显著高于库区, 这可能与大气沉降、河道土壤的冲刷导致氮素入河有关, 而河流自净能力不足以及时分解进入河流的氮营养盐, 导致河流氮的浓度较高[17, 18].同时, 库区ρ(NH4+-N)最高[(0.74±0.15) mg·L-1].
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图 2 密云水库上游牤牛河取样点水质变化情况 Fig. 2 Changes in the water quality of Mangniu River located in the upstream of Miyun Reservoir |
整体上ρ(TP)基本都低于地表水Ⅱ类, 库区中游R2_W轻微超标(0.196 mg·L-1), 而S3_W的ρ(TP)则远超于标准, 达到了0.838 mg·L-1.N/P是评价湖泊、水库等封闭性水体富营养化以及浮游植物生长研究的重要参数[19], 而河流整体N/P较高(平均值为314.5), 显著高于浮游植物适宜生长的范围.只有S3_W和R2_W的N/P小于30, 适宜浮游植物生长[20], 应注意防范富营养化风险.
除去R1_W和R2_W位点外, 整体上COD浓度均低于地表水Ⅱ类.库区的C/N较高, Xu等[21]研究发现C/N低于3会降低污水中营养物的有效去除.Yan等[22]研究发现, 污水中C/N为2.5时, 最有利于垂直潜流湿地去除TN.另外, 当C/N比处于2.5~5范围时, 可产生相对较低的温室气体.显然, 本研究河段水体的C/N远低于这一水平, 较低的C/N会影响生物的反硝化过程, 只有R1_W~R2_W处于这个范围内.这可能是库区的TN和NO3--N浓度低的原因之一.
2.2 密云水库上游牤牛河微生物群落α多样性分析α多样性指数中, Shannon指数和Simpson指数反映微生物群落的多样性, 而Chao指数和Ace指数则反映微生物群落丰富度(图 3).根据水体微生物群落α多样性分析发现, S2_W多样性最高; S5_W多样性最低.而S2_W丰富度最高, R1_W丰富度最低.整体上库区的微生物群落丰度都较低.而S2是汇入支流, 携带大量的营养盐和微生物进入干流, 故S2的NO3--N浓度显著高于其他监测点, 并且微生物群落的多样性和丰富度较高.根据底质微生物群落α多样性分析发现, S7_S和S8_S的多样性和丰富度较高, 而S4_S的多样性和丰富度最低.整体上, 底质的微生物群落多样性和丰富度高于水体.
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图 3 密云水库上游牤牛河微生物群落α多样性指数 Fig. 3 Changes in the α diversity index analysis for the microbial community of Mangniu River located in the upstream of Miyun Reservoir |
在门水平上[图 4(a)], 水体和底质的主要优势菌门均为: Proteobacteria (变形菌门)、Bacteroidetes (拟杆菌门)和Cyanobacteria/Chloroplast (蓝藻/叶绿体), 它们在水体中的相对丰度分别为: (39.9±16)%、(13.6±7.1)%和(27±16.2)%; 在底质中的相对丰度分别为: (44±10)%、(19.3±1.5)%和(11.5±11)%.水体中蓝藻/叶绿体菌门浓度更高, 而底质中则含有更多的变形菌门和拟杆菌门.除此之外, 部分菌门在底质中显著高于水质, 如Verrucomicrobia (疣微菌门)和Acidobacteria (酸杆菌门).
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(a)门水平相对丰度堆积图; (b)属水平Heatmap图, d1~ d4表示丰度变化区别性较强的区域; (c)属水平PCA分析 图 4 密云水库上游牤牛河微生物群落组成和分布 Fig. 4 Changes in the microbial community in Mangniu River located in the upstream of Miyun Reservoir |
在属水平上[图 4(b)], 水体和底质中的主要优势菌属为Bacillariophyta (硅藻属)和Flavobacterium (黄杆菌属).它们在水体中占比分别为(17.3±16.8)%和(5.5±4.9)%; 在底质中占比分别为(10.6±10.2)%和(6.0±2.7)%.硅藻是饮用水源中常见藻类菌属[23], 而黄杆菌则在异化硝酸盐的过程中发挥着重要的作用[24].
属水平上的PCA分析结果表明[图 4(c)], 除了部分监测点外, 底质和水体的微生物群落具有显著差异性; 其中差异性最大为硅藻, 水体和底质中的相对丰度分别为(17.3±39.6)%和(10.6±19.3)%.而部分菌属水体中丰度较高[图 4(b)中d1], 主要为变形菌门, 如：Acinetobacter、Brevundimonas、Chryseobacterium、Massilia、Porphyrobacter和Ralstonia等.其中Acinetobacter、Brevundimonas和Ralstonia是一类重要的氮代谢微生物[25~27], 而Acinetobacter的部分物种属于条件致病菌[28]. Chryseobacterium也为污水中常见微生物, 是一种潜在的人类病原体[29].而部分菌属则在底质中丰度较高[图 4(b)中d2], 如Luteolibacter、unclassified_Bacteroidetes、Arenimonas、GP6、unclassified_Cytophagales、unclassified_β_Proteobacteria、unclassified_γ_Proteobacteria和unclassified_Chitinophagaceae. Chlorobiales与COD去除和反硝化显著相关[30]. Chitinophagaceae是沉积物和土壤中的常见物种[31]. 有研究表明, β-变形菌门(β-Proteobacteria) 在底质丰度更高, 易于生长于缺氧环境[32].PCA结果发现, 库区样品相较于其它监测点有显著差异性, 这是因为库区独特的水文条件和理化性质, 进一步影响了微生物群落的组成和功能.有些菌属在库区丰度显著低于其余监测点[图 4(b)中d3], 主要为变形菌门和Thaumarchaeota (奇古菌门), 如：Aeromonas、Cellvibrio、Gp6、unclassified_Rhodobacteraceae、Pseudomonas、Rheinheimera、Sphingorhabdus、unclassified_Bacteroidetes、unclassified_Burkholderiales、Nitrosopumilus和Luteolibacter, 其中Aeromonas、Pseudomonas和Luteolibacter均为潜在条件致病菌[33], 可能由降雨冲刷入河导致丰度增加.部分菌属在库区丰度显著高于其余监测点[图 4(b)中d4], 如：Acidovorax、Arenimonas、Cryptomonadaceae、Ilumatobacter、unclassified_Cyanobacteria、unclassified_FamilyI、unclassified_Micrococcales和unclassified_Oxalobacteraceae等, 这些菌属大部分属于蓝藻/叶绿体菌门.库区由于流速缓慢, N/P适宜等水文水质条件, 易于藻类繁殖[34, 35]; 部分菌属, 如Acidovorax则与氮代谢相关, 而Arenimonas与磷代谢有关[32], 也是一种重要的硫自养反硝化菌属[36].
2.4 密云水库上游牤牛河微生物群落结构演替的环境因子分析Mantel检验结果表明, 水体和底质中微生物群落结构无显著相关性(P=0.407 5), 且微生物群落和环境因子也未发现有显著相关性[水体微生物(P=0.530 3), 底质微生物(P=0.517 4)].而根据门水平上的RDA分析可知[图 5(a)], 水体微生物的主要环境影响因子因监测点不同而具有差异性, 库区的主要环境影响因子为NH4+-N和COD, 而其它监测点的主要环境影响因子为NO3--N和TN.属水平上的网络结构分析结果表明[图 5(c)], 核心微生物为Aeromonas、Chryseotalea、Chryseobacterium、Sideroxydans和Pseudomonas. Chryseotalea可以将产生的甲醇或脂肪酸转化为乙酸或氢, 作用于反硝化[37]. Sideroxydans是主要的亚硝酸盐还原优势微生物[38]. Pseudomonas是一种好氧反硝化菌[39]. Aeromonas和Chryseobacterium则是潜在的病原体微生物.而属水平上的主要环境影响因子为NH4+-N和NO3--N, 且与相关微生物呈显著正相关; 其中NH4+-N的主要影响微生物有Subdivision3_genera_incertae_sedis、Spartobacteria_genera_incertae_sedis、unclassified_Burkholderiales和Delftia等; NO3--N的主要影响微生物则为Vogesella和unclassified_Burkholderiales.其中, unclassified_Burkholderiales和Vogesella可进行反硝化作用; 而Delftia可以有机氮或无机氮为氮源进行化能营养生活[40~42].
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(a) 水体微生物群落RDA分析; (b) 底质微生物群落RDA分析(圆形为样品, 箭头为水环境因子); (c) 水体微生物群落网络结构分析; (d) 底质微生物群落网络结构分析 图 5 密云水库上游微生物群落门水平上的RDA分析和属水平上的网络结构分析 Fig. 5 Analysis of RDA at phylum level and network structure at genus level of microbial community in the upper reaches of Miyun Reservoir |
底质微生物群落的环境影响因子随监测点不同有所区别[图 5(b)].在属水平上, 主要影响作用的微生物为Rheinheimera、Massilia、Acinetobacter和unclassified_Chitinophagaceae[图 5(d)].其中, 最主要的菌属Rheinheimera是一种反硝化菌属.底质微生物群落的主要环境影响因子为NO3--N和COD, 其中NO3--N的主要影响微生物有Pseudomonas、Massilia、Brevundimonas、Cellvibrio和Sphingorhabdus等.COD的主要影响微生物则为unclassified_Rhodobacteraceae、Acinetobacter、Ralstonia、Vogesella、Chryseotalea和Porphyrobacter; 同时, 这两部分微生物之间又相互作用.水体和底质的主要作用微生物菌属不同, 相较水体微生物群落, 底质微生物群落与环境影响因子的相关性明显下降, 说明底质微生物群落稳定性强, 密云水库上游流域高NO3--N的主要影响对象为水体微生物群落.
2.5 密云水库上游牤牛河氮素转化微生物组成和PICRUSt2功能预测分析为明确牤牛河氮素转化的微生物学机制, 本研究对水体和底质中的硝化菌和反硝化菌的相对丰度进行分析(图 6), 结果发现, 整体上硝化菌相对丰度为0.1%~4.0%, 反硝化菌相对丰度为0.7%~21%, 反硝化菌相对丰度高于硝化菌.
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(a)水体硝化菌相对丰度, (b)底质硝化菌相对丰度, (c)水体反硝化菌相对年度, (d)底质反硝化菌相对丰度 图 6 密云水库上游牤牛河硝化和反硝化功能微生物相对丰度分析 Fig. 6 Changes in the relative abundance of nitrifying and denitrifying bacteria in Mangniu River located in the upstream of Miyun Reservoir |
硝化菌在水体和底质中的相对丰度分别为(0.5±2.9)%和(1.3±2.7)%, 底质高于水体.水体中硝化菌相对丰度：S2_W最高, R1_W~R3_W最低; 底质中的硝化菌相对丰度：S7_S最高.S2_W和S7_S的主要硝化菌均为Nitrosopumilus, 相对丰度分别为1.8%和2.7%. Nitrosopumilus是一种主要的氨氧化菌属[43], 该菌属通过好氧产生亚硝酸盐[44], 而氨氧化是硝化作用的第一个反应步骤, 也是限速步骤.
反硝化菌在水体和底质中的相对丰度分别为(6.2±14.8)%和(7.2±11.8)%, 无显著差异性.水体样品中反硝化菌相对丰度：S7_W最高, R1_W~R3_W最低, 但是库区的Thauera占比较高, Thauera是典型的异养反硝化菌[45], 可与Candidatus Kuenenia协同负责厌氧氨氧化中的碳氮代谢[46].底质样品中的反硝化菌相对丰度：S6_S最高, 其次为S2_S.S7_以Rheinheimera为主, 相对丰度为11.6%, S6_S则以unclassified_Rhodobacteraceae为主, 相对丰度为9.5%, S2_S以Pseudomonas为主, 占比为6.3%.但S2和S6的TN和NO3--N浓度较高.S2_S的微生物群落丰富度和多样性较高, 但COD浓度较低.而S6_S的COD浓度较高, 有助于反硝化的进行, 但是S6_S的微生物群落丰富度和多样性不高.
为了进一步研究氮代谢微生物作用机制, 通过PICRUSt2功能预测筛选出与氮代谢相关的功能基因.具有相同功能的基因被归类到KEGG Orthology中, 每个KO代表具体的一个功能.将参与同一过程的多个KO划分在一起, 形成了KEGG Module数据库.KEGG Module数据库中的每条记录代表一个功能单元, 是多个KO的集合, 通过大写字母M和数字进行标识.本研究一共找到了47个参与氮代谢的功能基因, 其中有26个功能基因参与5个氮转化模块(图 7和图 8), 包括硝化、反硝化、异化硝酸盐还原(DNRA)、同化硝酸盐还原(ANRA) 和固氮模块, 其中硝化模块包括硝化和完全硝化模块, 但整体上反硝化模块的功能基因丰度高于硝化模块, 这与主要氮循环功能微生物的丰度结果是一致.
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图 7 密云水库上游氮转化模块丰度 Fig. 7 Abundance values of nitrogen conversion process in the upstream of Miyun Reservoir |
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图 8 密云水库上游氮代谢路径 Fig. 8 Map of nitrogen metabolic pathways in the upper reaches of Miyun Reservoir |
硝化模块以完全硝化反应为主, 主要发生于底质.底质中硝化模块的功能基因丰度最高为S8_S, 而水体中则为R1_W~R3_W.反硝化模块以DNRA为主, 主要发生于水体.水体中反硝化模块的功能基因丰度最高为R1_W~R3_W, 而底质中则为S8_S.对映硝化反应丰度较高的监测点, 其反硝化反应丰度也较高.Mantel检验结果可知, 硝化模块和反硝化模块的P=0.007 4, 具有极显著相关性.
微生物参与的硝化过程功能基因主要包括氨单加氧酶基因(pmoABC-amoABC)、羟胺脱氢酶基因(hao)和亚硝酸盐氧化酶基因(narGH).而参与NO3--N还原的则有ANRA、DNRA和反硝化反应.ANRA主要功能酶基因为nasAB和nirA, DNRA主要功能酶基因为narI、napAB、nirBD和nrfAH.反硝化反应主要的功能酶基因为nirK、nirS、norBC和nosZ.参与固氮作用的主要功能酶基因有nifDKH, 这些基因具体作用如图 8所示.
硝化模块功能基因主要为narGH基因(图 9), 该基因可将NO2--N氧化为NO3--N, 其占比为34.7%~49.9%.在水体中, 该模块功能基因于R1_W~R3_W丰度最低, S7_W和S8_W最高.值得注意的是, 相应菌种和模块丰度的高低不一定决定主要功能基因丰度的高低, 上述研究结果可知, 库区硝化模块的功能基因丰度较高, 但其NO3--N浓度低于S7~S8, 这可能与其主要功能酶基因的丰度较低有关.同理, 虽然底质中的硝化菌和硝化模块的丰度高于水体, 但是其narGH丰度较水体低, 所以底质硝化微生物并不起主要的硝化作用.整体上, 参与NO3--N还原反应的功能基因, 主要源于底质并以DNRA为主, 其中nirBD丰度最高, 其负责将NO3-还原成NH4+.而反硝化模块功能基因主要为nirK, 该基因主要将NO2-还原为NO, 在反硝化模块功能基因占比为0.8%~23.1%.在水体中, 参与NO3--N还原反应的主要功能基因于R1_W~R3_W丰度最低, S7_W和S8_W最高, 这与硝化反应功能基因相对应.在底质中, 则是S8_S最高, 这与该位点较低的NO3--N浓度有关.S2_S的相关功能酶基因较高, 且NO3--N还原菌相对丰度较高, 但其NO3--N还原反应过程丰度较低, 这可能与其COD浓度较低有关.较低C/N导致反硝化菌无法有效发挥作用.
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图 9 密云水库上游氮代谢相关KO基因相对丰度堆积 Fig. 9 Accumulation map of relative abundance of KO genes related to nitrogen metabolism in the upstream of Miyun Reservoir |
(1) 密云水库上游入库河流——牤牛河存在TN超标问题, 且TN以NO3--N为主, 占比达77.68%~92.94%.
(2) 牤牛河水体和底质中微生物群落结构具有显著差异, 呈现一定的空间分布特征, 高NO3--N是影响微生物群落结构演替的主要环境因子.
(3) 牤牛河中存在大量硝化和反硝化功能微生物, 反硝化菌相对丰度均高于硝化菌, 且均表现出底质高于水体.牤牛河优势硝化菌和反硝化菌分别为Nitrosopumilus和Pseudomonas.
(4) 氮代谢主要以NO3--N还原模块为主, 且主要发生于水体.硝化反应的主要功能基因narGH于水体中丰度最高.而参与NO3--N还原反应的主要功能基因, 主要位于底质, 以DNRA的nirBD为主, 而反硝化模块功能基因主要为nirK.河流中较低C/N比是导致反硝化菌无法有效发挥作用的主要原因.
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