2023, Vol. 44
2. 中国石化管道储运有限公司科技研发中心, 徐州 221008
2. Research and Development Center for Science & Technology, SINOPEC Pipeline Storage & Transportation Co., Ltd., Xuzhou 221008, China
原油开采、储运、加工和利用过程中使环境石油污染日趋严重.石油污染物不仅改变土壤pH值等理化性质和影响生物养分有效性, 还改变微生物群的数量和活动[1].利用微生物代谢将碳氢化合物转化为CO2和H2 O的生物修复技术, 在石油污染土壤修复应用中得到了广泛研究.微生物在好氧和缺氧条件下有特定生物降解途径: 好氧微生物可使用单或双加氧酶将1或2个氧原子整合到碳氢化合物分子中[2]; 缺氧情况下, 厌氧微生物及兼性厌氧微生物以硝酸盐和二氧化碳作为最终电子受体, 以有机物作为电子供体降解有机物生成化学能[3].生物修复可大幅降低石油污染对土壤环境造成的影响, 改善土壤功能.其中生物强化是污染场地的有效修复方法[4].
生物强化可以解决降解体系中土著菌生长受抑制、降解潜力较低和单一外源混合菌降解效果不够稳定等问题, 而优势混合专性菌系的选择和获得等是保证修复生物强化效果的关键因素[5, 6].由于微生物的代谢机制和适应恶劣环境的能力, 它们可以降解许多有机污染物, 然而在某些情况下, 本土微生物群落可能没有降解目标污染物的适当代谢潜力[7].Szulc等[5]研究提出, 在实地工作之前进行初步的实验室测试以选择接种的微生物, 能增加实地研究成功的机会.Ameen等[8]研究从沙特阿拉伯红海海岸红树林分离的真菌对柴油的降解效果, 发现这些分离株具有快速的柴油生物去除作用.Alisi等[9]基于使用与选定的本地菌株量身定制的微生物配方, 42 d内总碳氢化合物减少约75%.
本研究从20年以上石化污染场地获得菌源, 将经定向驯化后获得的高效石油降解菌系投加到污染场地进行原位修复.在整个修复过程中, 对土壤的总石油烃(TPH)含量、理化性质、营养元素含量和酶活性等进行监测, 了解修复过程中土壤参数的变化; 同时利用Pearson相关性等分析方法, 解析土壤参数修复过程中变化原因; 通过群落结构变化与物种与功能贡献度分析, 探求引入石油烃降解菌系实现高效降解效率的原因并确认关键菌属; 通过烷烃代谢酶及相关功能基因分析, 揭示烷烃的生物降解路径与石油降解菌系的强化作用机制.
1 材料与方法 1.1 生物强化实验本研究原位修复场地位于徐州市某厂区内, 修复实验面积为10 m×5.5 m, 原始ω(TPH)为(16 622.87±23.06) mg ·kg-1, 土壤为粉(沙)壤土, ω(砂粒, 2.0~0.05 mm)为296 g ·kg-1, ω(粉粒, 0.05~0.002 mm)为582 g ·kg-1, ω(黏粒, < 0.002 mm)为122 g ·kg-1.本实验共两组, 石油降解菌系强化实验组(Exp-BT)及空白对照组(Ctrl).使用采样器根据五点取样法采集土壤, 每个采样点设置D1(0~15 cm)、D2(15~30 cm)和D3(30~45 cm)这3个采样深度, 将取得的样品均匀混合带回实验室检测.取样监测频次为每30 d 1次.
生物强化实验组第0 d取样后接菌.菌源来自广州20 a以上石化污染土壤, 10℃条件下, 经石油烃驯化2个月得到耐低温高效石油降解菌.接种石油烃降解菌群至10 L灭菌后的LB培养基, 培养至D600为1~1.5, 完成一级扩繁.将一级扩繁菌液接种到40 L灭菌后的LB培养基, 至D600为1~1.5完成二级扩繁.将50 L二级扩繁菌液均匀接种到污染土壤, 翻耕搅拌.
1.2 石油浓度及组分测定使用经石油标准样品校准后的专用红外测油仪(北京华夏OIL480), 应用红外分光光度法(HJ 1051-2019)对样品总石油烃浓度进行检测.TPH去除率(%)的计算公式为：
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式中, C0表示初始土壤TPH含量(mg ·kg-1), Ct表示时间t时土壤中的残留TPH含量(mg ·kg-1), t表示修复时间(d).
将采集土壤样品冷冻干燥4~6 h, 过30目筛, 取土壤1.00 g, 加入10 mL正己烷∶丙酮=1 ∶1混合萃取溶液, 涡旋振荡1 min, 超声30 min, 然后以2 500 r ·min-1转速离心5 min, 过0.45 μm滤膜后放到进样瓶中, 使用GC-MS分析石油组分.
1.3 理化性质测定采用SANXIN(上海三信仪表厂)SX751型便携式pH/ORP/电导率/溶解氧测试仪(ISO9001:2015)测定理化性质(pH、EC和ORP); 采用普锐森社PR-ECTH-SC-35DC型土壤参数速测仪测量土壤温度.
1.4 酶活性测定脂肪酶的测定使用Margesin等[10]的方法, 土壤脂肪酶活性(以pNP/土壤干重计)为μg ·(g ·10 min)-1; 土壤脱氢酶活性的测定采用TTC比色法, 其活性以1 g土壤样品24 h产生的TPF (1, 3, 5-三苯甲臜)来衡量, 单位为μg ·(g ·h)-1.
1.5 宏基因组测序及生物信息学分析对所取得样品中初始污染土壤(B0)、驯化所得高效石油降解菌系样本(GZ)和生物修复后土壤样本(BT)进行宏基因组测序及生物信息学分析.测序流程为：环境样品进行DNA抽提片段化约300 bp构建PE文库桥式PCR-Illumina测序.使用软件fastp剪切序列3′端和5′端的adapter序列进行质量剪切, 并去除剪切后长度小于50 bp、平均质量值低于20和含N碱基的reads, 得到高质量的质控数据(clean data).使用软件MEGAHIT v1.1.2对质控后得到的短片段序列进行组装.使用MetaGene对拼接结果中的contigs进行ORF预测.选择核酸长度大于等于100bp的基因, 并将其翻译为氨基酸序列, 获得各样本的基因预测结果统计表.通过CD-HIT软件对样本预测出来的基因序列进行聚类, 构建非冗余基因集, 得到非冗余基因集基因的碱基序列.针对SOAPaligner比对后的信息, 统计基因在各个样本中的丰度信息, 并对得到的基因进行物种与功能上的分类, 包括NR、COG和KEGG等.在上述分析的基础上, 进行了物种与功能组成分析、物种功能注释、物种与功能贡献度分析和功能基因分析等.
1.6 数据分析采用Origin 2020和R语言软件进行数据整理及绘图.
2 结果与讨论 2.1 土壤修复过程中TPH含量及其衍生物分析120 d修复过程中TPH含量变化与去除率如图 1所示, Exp-BT组ω(TPH)从初始16 622.87mg ·kg-1经30 d修复降为6 005 mg ·kg-1, 去除率达63.88%; 后续降解速率趋缓, 90 d后稳定, 总去除率达81.23%, 显著高于仅依靠土著菌修复的对照组(20.49%). 张金秋等[11]发现, 在石油质量分数为0.6%时, 经56 d修复, 对照组降解率为12.5%, 微生物组仅达45%; 且其通过石油污染程度对石油污染土壤修复效果的影响实验结果表明, 石油初始质量分数为1.2%和1.5%时, 其56 d降解率都不足45%, 过量的石油会产生一定毒性, 抑制微生物生长发育.花莉等[12]利用前期已筛选的高效石油降解菌, 修复延安某油田石油烃初始含量为14 720mg ·kg-1的污染土壤.未灭菌污染土壤42 d对照组降解率为12.03%的情况下, 投加游离菌组降解率仅为21.05%, 且在21 d后基本保持稳定.可以看出在基本相同的边界条件下, 本研究对石油污染土壤石油烃的降解速率和效果等均较优.
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图 1 修复过程中TPH含量变化与累计去除率 Fig. 1 TPH content change and cumulative removal rate during remediation |
表 1显示了120 d修复期前后土壤样品中石油烃及其衍生物的GC-MS分析结果.在进行修复前, 从石油污染土壤中鉴定出20种污染物, 其中多为相对分子质量低、中的直链烷烃, 另还有相对丰度排序为芳烃＞环烷烃＞烯烃的污染物和其他有机物.Exp-BT组120 d修复后相对分子质量低的脂肪族(C8~C16)烃占比从17.74%提升至76.18%, 相对分子质量中的脂肪族烃(C17~C28)占比为82.26%降至23.82%.根据GC-MS分析, 短链烷烃优先于长链烷烃降解, 其后由于微生物的作用, 大部分长链烷烃被降解为短链烷烃、烯烃和其他产物, 导致相对分子质量低的烷烃占比增多, 这与Liu等[13]研究的结论一致.此外经修复后, Exp-BT组样品中残留石油烃的含量与种类均显著降低, 但对照组降解则并不彻底, 尤其是在烷烃降解方面.
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表 1 修复前后土壤样品中碳氢化合物及其衍生物的GC-MS分析 Table 1 Hydrocarbon compounds and their derivatives analyzed by GC-MS in soil samples before and after remediation |
2.2 修复参数及相关性分析 2.2.1 理化性质
pH值大小影响土壤中常量、微量元素的迁移和有效性.Exp-BT组土壤pH值变化如图 2(a), 与初始土壤(pH=8.36)相比, 接种石油降解菌后约下降了0.18, 这可能是由于微生物降解石油过程中产生羧酸类物质造成的.其后基本呈上升趋势, 这与Chakravarty等[14]关于土壤pH由高酸性向低转变的研究结果一致.在微生物修复期间pH一直保持在8.17~8.60之间, 为烃类矿化提供了更好条件[15, 16].
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图 2 Exp-BT组土壤修复过程中pH、ORP、EC和温度的变化 Fig. 2 Changes in pH, ORP, EC, and temperature during Exp-BT soil remediation |
氧化还原电位(ORP)能反映微生物的代谢活性与所处环境氧化还原状态.Exp-BT组土壤ORP变化如图 2(b), 总体呈先降后升.接菌后ORP约为70.67 mV, 较初始土壤(ORP=86 mV)略有降低, 这可能是由于高浓度污染物质对微生物的抑制作用, 但土壤中易被降解的石油烃为微生物提供了充足碳源.随其浓度及环境温度降低, 微生物降解速度变缓, ORP逐渐趋于稳定.整体上修复后ORP值高于原始土壤, 证明接入石油降解菌后土壤环境内的氧化能力增强.
Chakravarty等[14]指出导电性是土壤健康的一个重要参数, 因其与土壤结构和水分入渗有关.Exp-BT组土壤电导率(EC)变化如图 2(c)所示, 接种石油降解菌后由于LB营养液的引入其值升高; 随修复时间延长逐渐降低, 可能因土壤中营养盐被微生物吸收和代谢, 且进入秋冬季节环境气温低, 影响微生物活性.整个修复过程中EC值处于0.18~0.41 mS ·cm-1之间, 均处于0.11~0.57 mS ·cm-1的农业活动适宜范围内[14].
2.2.2 酶活性在土壤生物修复过程中, 酶在烃类生物降解过程中发挥重要作用, 酶的活性反映了微生物的代谢活性.一般而言, 酶活性越强, 生物降解性能越好.
脱氢酶是重要的氧化还原酶, 参与分解有机污染物.如图 3(a)所示, 脱氢酶活性(以TPF计)在第30 d达到峰值0.98 μg ·(g ·h)-1, 而后缓慢下降.在整个处理过程中, 脱氢酶趋势与Liu等[13]和Zhen等[17]报道的结果基本一致.本实验初期, 石油污染土壤中存在易生物降解的碳氢化合物, 脱氢酶活性最高.随着生物利用度高的污染物被降解, 脱氢酶活性降低.Liu等[13]在处理石油污染土壤过程中, 脱氢酶活性在27 d内下降了约60%.本实验在120 d周期内, 脱氢酶酶活性仅降低了32.7%, 整个过程中均保持了高活性.此外, 90 d后气温显著降低, 同时也证明接种石油降解菌提高了菌群抗低温的能力.
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图 3 Exp-BT组土壤修复过程中土壤脱氢酶、脂肪酶活性和温度的变化 Fig. 3 Changes in soil dehydrogenase, lipase activity, and temperature during Exp-BT soil remediation |
脂肪酶能够将土壤中羧酸脂类有机化合物水解, 生成可溶性物质.脂肪酶活性变化趋势与脱氢酶类似, 图 3(b)显示脂肪酶在30~60 d均保持较高活性, 而后逐渐下降, 这与王华金等[18]研究的结果一致.修复过程中, 脂肪酶活性(以pNP/soil计)最高可达387.92μg ·(g ·10 min)-1.有研究表明, 与脱氢酶不同, 在生物修复后期可利用组分减少和难降解物质积累对土壤脂肪酶活性的影响不明显[19].本研究中生物修复后期脂肪酶活性出现明显下降, 可能是修复过程中产生了毒性较强的中间代谢产物.
2.2.3 相关性分析对修复过程中各时间点样品的土壤理化性质(pH、EC、ORP)、环境温度(TEMP)和土壤酶活性(脂肪酶LIP、脱氢酶DEH)进行相关性分析, 如图 4所示.温度、脱氢酶和脂肪酶活性三者之间均呈显著正相关(P < 0.05), 较高的温度可以提高微生物的代谢活性; TPH浓度与脱氢酶和脂肪酶显著正相关(P < 0.05), 微生物的高活性促进了石油污染物的快速降解, 这与Devi等[20]和张博凡等[21]研究的结论一致; 而pH与脱氢酶呈显著负相关(P < 0.05), 降解烃类细菌在pH接近中性的条件下发育最好, 土壤样品偏碱性随修复过程逐渐上升, 加之修复后期微生物的脱氢酶活性受环境温度降低的影响, 导致了这一结果.
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*表示显著相关(P < 0.05), **表示极显著相关(P < 0.01) 图 4 Exp-BT组土壤修复参数的Pearson相关矩阵 Fig. 4 Pearson correlation matrix of Exp-BT soil remediation parameters |
Illumina测序共获得B0：94 944 994、GZ：108 693 364和BT：88 625 538条序列(Raw reads), 每条read序列长度均为150 bp; 经质控后选择B0：92 706 180、GZ：106 026 290和BT：86 647 814条序列进行进一步分析.使用LCA方法对基因集进行了NR物种注释, Taxon个数统计结果如下：域4、界10、门106、纲182、目315、科565、属1 441和种3 490.
从门和属两个水平的Venn图中可以看出(图 5), BT和B0样本来说整体较为相似, 但BT样本微生物种类多样性更高, 本研究推测这种情况的出现是由于GZ混合菌的引入.GZ样品中超过80%的物种均出现在另外两个样本中, 但BT样本呈现出更高的相似程度.这一分析证明通过外源添加经驯化的石油降解菌群, 可以对降解体系的微生物群落结构与物种多样性的变化产生正向影响.
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图 5 不同样本间门水平和属水平的物种组成相似性及重叠情况Venn图 Fig. 5 Venn chart of similarity and overlap of species composition at phylum and genus levels among different samples |
图 6给出修复过程中土壤样中微生物多样性与丰度的变化.门水平上已识别变形菌门和放线菌门最丰富, 在所有样本中均处于优势地位, 尤其是GZ样本, 两个菌门占总样本丰度达99.91%, 其中Proteobacteria门相对丰度更是高达98.53%, 这与余天飞等[22]在细菌富集培养研究中的结论一致.有研究表明, Proteobacteria是包括土壤和海水等各类环境中最丰富的门, 并且还是各类石油烃污染场地中占主导的菌门[23, 24].此外, Jiao等[25]也提到变形菌门和放线菌门能够通过自身代谢活动降解石油烃类污染物, 在许多石油污染土壤中均占优势地位.在属水平上GZ样本中优势菌主要为Pseudomonas、Achromobacter和Rhodococcus.在其他生物强化研究中, 丁明山等[26]从油田退役井场老化油泥中分离出3种石油烃降解菌, 分别为短杆菌TK-3、DM-2和红球菌TM -1; Rahman等[27]从130种石油降解细菌培养物中筛选出5种高效菌株Micrococcus sp.GS2-22、Corynebacterium sp.GS5-66、Flavobacterium sp.DS5-73、Bacillus sp.DS6-86和Pseudomonas sp.DS10-129; Varjani等[28]研究发现利用碳氢化合物的细菌群(HUBC)由Ochrobactrum sp.、Stenotrophomonas maltophilia和P. aeruginosa组成.由此可知对于生物强化, 各研究所获得的优势降解菌在门水平层面较为相似, 而在属水平或具体菌株则差异较大.结合本研究对石油污染土壤TPH降解率高达81.23%, 可以看出本研究中长期污染场地菌源选择合适(来自广州石油污染场地), 采用定向驯化方式驯化所得石油降解菌的降解效果优异.
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图 6 不同样本门水平和属水平的物种群落柱状图 Fig. 6 Histograms of species communities at phylum and genus levels of different samples |
与B0样本相比, 虽然石油碳氢化合物抑制了修复初期大多数微生物的生长, 但在引入外源石油降解菌群并经过120d修复后, 变形菌门与放线菌门的优势地位进一步扩大, 总相对丰度增加17.1%.其中放线菌门相对丰度由33.96%升至51.61%, 变形菌门相对丰度虽略有降低, 但根据NR物种注释其丰度提升了15.01%.虽然根据图 5与NR物种注释结果BT样本微生物种类更为丰富且总丰度更高, 但从图 6中可以看出其群落结构发生了较大变化, 与石油烃降解相关的功能菌门物种更为集中.而相对丰度≥1%的除变形菌门和放线菌门的其他菌门, 大多数不论在丰度还是相对丰度上均呈现不同程度减少.此外, 虽然土壤中酸杆菌门丰度较原始土壤有所下降, 但仍占不小比例, Chen等[29]研究结果表明酸杆菌门也具有降解石油烃的能力.后续可通过改变驯化条件等方式, 进一步研究如何通过调整石油烃降解混合菌门相对丰度, 以获得更优的石油烃降解效率.
属水平微生物多样性与丰度的变化如图 6(b)所示.可以看出在3个样本中相对丰度≥1.5%的菌属, 按照在BT样本中的丰度排序, 放线菌门中主要为Achromobacter(7.91%)和Pseudomonas(4.07%)等; 变形菌门中主要为Nocardioides(17.63%)、Gordonia(7.75%)和Rhodococcus(5.53%)等. Nocardioides[30]、Pseudomonas[31]、Achromobacter[32]、Gordonia[33]、Rhodococcus[34]和Acinetobacter[35]这6种菌属均为已报道过的石油降解菌.
与B0相比, BT样本中Nocardioides仍为优势菌, 相对丰度由11.79%上升到17.63%, 在样本所有菌属中的优势地位进一步扩大; 剩余菌属相对丰度情况发生较大改变, 其中8种相对丰度上升尤为明显：Achromobacter(0.14%→7.91%)、Gordonia(0.11%→7.75%)、Agromyces(3.81%→5.98%)和Rhodococcus(0.83%→5.53%), 还有Alcanivorax、Solimonas、Ramlibacter和Shinella等.其余如unclassified_c__Betaproteobacteria、unclassified_p__Candidatus_Rokubacteria、Nocardia和Acinetobacter等菌属的相对丰度则呈现出不同程度的减少.
GZ样本中其他优势菌属Achromobacter和Rhodococcus等在BT样本中表现出积极正向作用, 提升相关石油烃降解菌属的相对丰度, 改善了降解体系的微生物群落结构组成; 值得注意的是, Pseudomonas在GZ样本中占有绝对优势, 但BT样本中其相对丰度却略有降低.结合图 1分析, 30d时TPH降解速率最快, 120d时降解率基本维持不变.分析认为由于取样时间过长, 石油降解菌发挥完降解作用后占比恢复稳定, 从而最后表现为土著菌更占优势.此外微生物在污染体系中的生存情况受多方面影响, 除微生物本身对污染物质的利用能力外, 还与污染物种类、浓度和环境条件等密切相关.随修复时间延长, 降解体系中的碳源不断被消耗, 且环境温度逐渐下降, 后期B0原始污染土壤样品中的优势土著菌Nocardioides相较于外源引入的功能菌属Pseudomonas可能在此降解体系中更具竞争力, 从而导致这一结果的出现.
2.3.2 微生物功能的COG和KEGG分析与物种贡献度图 7为两样本COG和KEGG物种与功能差异分析.COG的高度丰富的功能类别按以下顺序排列：氨基酸转运和代谢、功能预测、能量产生和转换、信号转导机制、脂质转运和代谢、细胞壁-膜-包膜生物发生、辅酶转运和代谢、翻译、核糖体结构和生物发生、无机离子转运和代谢、转录、复制、重组和修复、防御机制和核苷酸转运和代谢等.而根据图 7(b)的KEGG注释, 可以看出来两个样本中最丰富的途径均为次级代谢物的生物合成、不同环境下的微生物代谢, 此外低丰度的KEGG途径包括碳代谢、氨基酸生物合成、辅因子生物合成、ABC转运体、双组分系统、群体感应、嘌呤代谢、丙酮酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、氧化磷酸化、糖酵解/糖异生、原核生物中的碳固定途径和氨酰-tRNA生物合成等.
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图 7(a1)纵坐标为COG功能注释分析数据库中不同功能缩写; *表示0.01 < P≤0.05, **表示0.001 < P≤0.01, ***表示P≤0.001 图 7 修复前后样本间COG和KEGG功能差异性检验 Fig. 7 Functional difference test of COG and KEGG between samples before and after remediation |
在应激环境中, 微生物需要足够的能量供应来维持基本的细胞代谢.石油污染土壤中, 微生物以石油烃为碳源, 通过碳代谢促进细胞生长.细胞外膜可以保护细胞免受环境有毒分子的伤害, 对细胞在应激条件下的生存非常重要[36].通过氨基酸、脂质、磷和无机离子的转运与代谢, 可以改变细胞外膜的通透性, 减轻外界污染物对细胞的影响.细胞通过转录和翻译中进行相对变化, 改变不同核糖体蛋白的表达水平以产生差异基因, 适应不同环境的要求[37].基于KEGG通路分析, ABC转运蛋白也得到了富集.石油烃类污染物不溶于水, 难被微生物吸收, 需要一些特定的受体转运体来帮助其吸收和利用, ABC转运蛋白是细菌获取碳源的最重要途径[38].
根据图 8(a)COG物种与功能贡献度分析, BT中对氨基酸运输与代谢转化、主要功能预测、能源生产与转换、信号转导机制和脂肪转运代谢等功能贡献度较大的主要有Nocardioides、g__unclassified_c__Betaproteobacteria、g__unclassified_p__Candidatus_Rokubacteria、Agromyces、Achromobacte、Gordonia和Rhodococcus.KEGG分析展现了类似的结果, 图 8(b)表明代谢途径、次级代谢物的生物合成、不同环境下的微生物代谢、碳代谢和氨基酸生物合成与Nocardioides、g__unclassified_c__Betaproteobacteria、g__unclassified_p__Candidatus_Rokubacteria、Agromyces、Achromobacte、Gordonia和Rhodococcus有关.与B0相比BT组中Nocardioides、Achromobacter、Gordonia和Rhodococcus对主要功能的贡献度明显增加.结合KEGG和COG结果分析推断本实验中的Nocardioides、Achromobacter、Gordonia和Rhodococcus对石油烃的降解有着重要贡献.
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图 8 修复前后样本COG和KEGG物种与功能贡献度热图 Fig. 8 Heat map of COG and KEGG species and function contribution of samples before and after remediation |
另基于KEGG中代谢通路丰度排名, 发现BT样本中与烷烃降解代谢相关的ko00071“FATTY ACID DEGRADATION”路径富集.根据KEGG网站(http://www.KEGG.jp/KEGG/), ko00071中建议了烷烃的ω/α羟化脂肪酸降解途径, 其中相关代谢酶基因：alkane 1-monooxygenase[EC: 1.14.15.3]、alcohol dehydrogenase[EC: 1.1.1.1]、aldehyde dehydrogenase (NAD+)[EC: 1.2.1.3]在BT样本中丰度水平均很高, 此外还有long-chain acyl-CoA synthetase[EC: 6.2.1.3]及TCA相关酶基因等.且BT样本中上述相关酶基因丰度水平均高于B0样本, 增加了18.16% ~41.12%不等, 并与GZ样品中相对丰度水平基本保持一致.这些结果证明石油降解菌系的引入提高了相关酶基因的表达水平, 且微生物对烷烃的降解主要是通过末端氧化途径进行.但是由于目前KEGG数据库中烷烃代谢通路信息不全, 通过此方法不能全面且具体获得微生物对烷烃的代谢途径, 因此本研究结合相关文献对样本中与石油烃降解相关的功能基因进行了研究.
为获得石油污染土壤微生物群落中的石油烃降解相关基因, 对样品B0、GZ和BT这3个样本的基因进行了KEGG功能注释, 在其中发现5个石油烃降解相关基因, KEGG NAME和对应的KEGG Orthology分别为: alkB1_2/alkM (K00496)、tamA(k07278)、rubB/alkT(k05297)、ladA(K20938)和alkB(K03919).通过对B0、BT样品的功能基因丰度表进行比较分析, 可看出由于GZ外源微生物的引入, BT样本相较于B0样本中与石油烃降解相关基因总丰度增加32.20%.具体来说, 除rubB/alkT基因丰度减少19.67%外, alkM、tamA、ladA和alkB各功能基因丰度均有增加, 比例分别为22.64%、60.27%、64.03%和23.42%.
在此基因注释表的基础上, 进一步通过Circos样本与基因关系图清晰描述其丰度对应关系.从图 9可看出, alkM基因在两个样品中均占主导地位, 其余基因丰度关系为：tamA>rubB>ladA>alkB.降解体系中基因相对丰度比例有所改变, 部分基因相对丰度比例增加：tamA(32.92%→39.91%)、ladA(5.56%→6.90%); 其余均略有降低：alkM(44.88%→41.63%)、rubB(12.20%→7.41%)和alkB(4.44%→4.15%).
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1.BT, 2.B0, 3.K00496, 4.K07278, 5.K05297, 6.K20938, 7.K03919; 左边半圆(较小圈)表示样本的功能丰度组成情况, 右边半圆(较大圈)表示在该聚类水平下功能在不同样本中的分布比例情况; 圆圈从外到内, 第一、二彩色圈：左半部分圆圈表示不同样本对应的功能组成, 不同颜色表示不同功能, 长度表示某一功能在该样本中的丰度比例(第二圈内显示的百分比); 右半部分圆圈表示不同样本在优势功能中的分布比例, 不同颜色表示不同样本, 长度表示该样本在某一物种中的分布比例(第二圈内显示的百分比); 第三圈：圈内的彩色条带, 一端连接样本(左边半圆), 条带端点宽度表示功能在该样本中的丰度, 另一端连接功能(右边半圆), 条带端点宽度表示该样本在相应功能中的分布比例, 圈外数值表示相应功能的丰度数值 图 9 修复前后Circos样本与基因关系 Fig. 9 Circos sample and gene relationship diagram |
据报道, 所选基因(alkM、tamA、rubB、ladA和alkB)在石油烃的转化和代谢中起着重要作用[39, 40].AlkM是烷烃羟化酶编码基因, Ratajczak等[41]通过基因的失活实验表明ORF1、alkR和alkM是烷烃利用的潜在必须基因; AlkM对于烷烃上的生长是必不可少的, 但对于相应的烷醇上的生长却不是, 这表明它是末端烷烃羟化酶.TamA是碳链选择性腺苷酸化酶, Marchetti等[42]研究表明TamA能够利用C6~C13的脂肪酸(C14形式几乎检测不到), 而且对C12的酰化形式的转化是最高的; TamA可以将链长范围从C6~C13的脂肪酸转移到一个孤立的ACP结构域, 因此TamA通过连接脂肪酸和吡咯生物合成途径, 弥合初级和次级代谢之间的差距.烷烃单加氧酶(AlkB)是一种非血红素二铁酶, 催化烷烃的羟基化.它通常存在于以烷烃为唯一碳源和能量来源的烷烃营养生物中[39].它与AlkG和AlkT基因形成的酶复合物共同组成红素氧还蛋白依赖酶.Alkb的活化是通过其二铁活性位点的双电子还原实现的, 这有助于分子氧的结合、活化和裂解, 以插入惰性C—H键[43].电子通常由NADH通过红素氧还蛋白还原酶(AlkT)到红素氧还蛋白(AlkG)到AlkB, 如图 9所示.在分枝杆菌、戈登菌、红球菌、伯克霍尔德菌、红杆菌、弗兰克氏菌、军团菌、不动杆菌和海洋杆菌的基因组序列中发现了alkB基因的存在[44]; LadA基因控制长链烷烃单加氧酶的形成, 利用末端氧化途径将长链烷烃(至少C36)转化为相应的伯醇; LadA通过的黄素蛋白单加氧酶机制催化长链烷烃的转化, 其能力取决于长链烷烃底物的结合模式[45].与B0相比, BT样本这些基因的丰度更大, 表明在样品BT中可能有更大的降解能力.
3 结论(1) 石油污染土壤添加高效降解菌系进行为期120 d生物修复, TPH降解率达到81.23%, 强化了污染体系中土著菌群的TPH降解能力.修复过程中pH、EC值均处于较佳范围内, 土壤环境内的氧化能力增强, 微生物的代谢活性维持较高水平, 保证了生物修复体系好氧降解能力.生物强化对石油污染土壤石油烃的降解速率、效果等均较优.
(2) 揭示外源石油降解菌系实现高效降解效率的原因并确认关键菌属.高效石油降解菌系对石油污染场地土著微生物有强化作用, 可改善降解体系的微生物群落结构组成; 关键石油烃降解菌属Nocardioides、Achromobacter、Gordonia和Rhodococcus等的相对丰度得到提升.
(3) 生物信息学分析表明, 外源高效石油烃菌系主要是通过末端氧化途径降解石油烃; 其强化机制是通过增强微生物相关酶的代谢活性与相应功能基因alkM、tamA、rubB、ladA和alkB等的表达.
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