内蒙古河套灌区地处内陆干旱区, 降雨量少, 蒸发量大, 由于政策性引黄水量锐减^[1], 淡水资源十分紧缺.该区拥有丰富的地下微咸水资源, 合理开发利用地下微咸水资源已成为有效缓解灌区淡水资源供需矛盾的重要举措之一^[2], 但微咸水含有大量的Na⁺和Cl^-等离子, 盐离子进入土壤会增加土壤容重, 降低孔隙度, 使土壤通气透水性变差, 易板结, pH升高, 降低土壤有机质含量^[3].土壤微生物参与了多种农业生态过程, 如营养循环和有机物料腐解等, 是衡量土壤肥力和土壤健康程度的重要指标^[4].咸水灌溉会减少土壤细菌数量^[5], 降低酸杆菌门和放线菌门的相对丰度等, 诸多研究结果认为, 盐分对土壤微生物活性和群落结构均有不利影响^[6].不合理的微咸水灌溉引发的土壤次生盐碱化等问题制约着微咸水广泛应用, 学者们采用施加生物炭、轮灌、活化微咸水及覆砂等多种措施降低微咸水的负效应^{[3, 7~9]}, 使其在一定程度上可被安全利用, 如何安全利用微咸水灌溉盐渍土成为当前的研究热点.

施加微生物菌肥是治理盐碱地的重要措施之一, 在保护生态等方面优势明显.微生物肥有益菌种可提高土壤有机质含量, 降低盐碱土中盐分含量, 改善盐碱土作物根际微环境.某些微生物菌肥中含有的嗜盐微生物可在自身生长繁殖过程中大量消耗游离Na⁺, 降低土壤中盐离子浓度^[10].土壤理化性质的改变势必会影响土壤微生物的变化.张蕾等^[11]研究认为, 施加土壤调理剂和微生物菌肥后土壤细菌群落多样性和丰富度增加; 有研究表明, 变形菌门和拟杆菌门相对丰度在施肥处理下增加^[12], 李金花等^[13]提出施加菌肥可提高土壤中鞘氨醇单胞菌和芽孢杆菌属的相对丰度.微咸水灌溉下微肥和稻草等可改良盐渍土^[14], 降低微咸水负效应.但微咸水灌溉下施不同量微生物菌肥对土壤微生物的影响鲜见报道, 因此, 阐明施用微生物菌肥对微咸水灌溉农田微生态的影响有重要的科学意义.

本研究以枸杞为指示植物, 在微咸水灌溉下施加微生物菌肥, 采用高通量测序方法, 探究枸杞生育期内土壤细菌多样性、群落结构和功能对菌肥的响应, 揭示土壤环境因子与土壤微生物间关系, 以期为河套灌区安全利用微咸水和维护生态健康提供重要的科学依据.

本试验于2020年5~10月在内蒙河套灌区下游三湖河灌域的红卫试验基地(东经108°45′~109°36′, 北纬40°30′~40°40′)展开.研究区属中温带大陆性多风干旱气候, 年平均降水量270 mm, 年平均蒸发量2 383 mm, 年平均气温7.9℃, 无霜期146 d, 积温(大于10℃)3 200℃.研究区西临新华支渠, 南有二斗沟, 具有良好的灌排条件.土壤以灌淤土、盐土为主, 颗粒组成为砂粒(0.05~2 mm)含量17.53%、粉粒(0.002~0.05 mm)含量73.40%和黏粒(< 0.002 mm)含量9.07%.田间持水量为30.26%(质量含水率/环刀法).试验区0~20 cm土壤平均EC值为1.25 mS ·cm^-1, 属于中度盐渍土.供试枸杞品种为宁杞9号, 树龄6 a, 栽培密度为1 m×1 m.本试验开始前已连续开展多年微咸水田间灌溉试验(2012~2019年), 2020年在枸杞生育期(5月中旬、7月上旬和7月末)采用当地地下微咸水(微咸水水质见表 1)进行灌溉, 在枸杞关键生育期(6月中旬)灌溉淡水, 灌水量采用地方标准^[7]中数值, 每次均灌溉40 mm.参照地方标准^[7]在5月一次性施入基肥：施氮肥量为37 500 kg ·km^-2, 施磷肥量为30 000 kg ·km^-2, 施钾肥量为22 500 kg ·km^-2, 无追肥.每次灌水前将枸杞株间和行间杂草拔掉, 以保证枸杞田间水养充裕; 灌后待土壤干燥, 逐株修剪枸杞杂枝, 保证枸杞养分主要供应果实.在枸杞开花、果实膨大期等生育关键期采用机械化逐行逐株喷洒哒螨灵、阿维菌素, 使枸杞免受虫害.

表 1 (Table 1)

表 1 灌溉微咸水水质1) Table 1 Irrigation brackish water quality 项目 pH 电导率 CO32- HCO3- Cl- SO42- Ca2+ Mg2+ K++Na+ 全盐量 总硬度 总碱度 数值 8.27 4.53 0 640.7 721.6 1 176.7 110.2 103.3 1 087.5 3 840 700.6 525.5 1)pH无量纲, 电导率单位为mS ·cm-1, 其余单位为mg ·L-1

表 1 灌溉微咸水水质1) Table 1 Irrigation brackish water quality

本试验设置4个处理, 每个处理3次重复, 12个小区.各小区随机布设, 规格为2 m×10 m.小区行间设保护带, 小区间用120 cm隔水板做地下防渗隔离.处理设置为：①不施加微生物菌肥, CK; ②每次随灌水冲施4 500 kg ·km^-2微生物菌肥, F1; ③每次随灌水冲施7 500 kg ·km^-2微生物菌肥, F2; ④每次随灌水冲施10 500 kg ·km^-2微生物菌肥, F3.微生物菌肥来自山东土秀才生物科技有限公司的不二菌碳, 该菌肥以腐植酸为底物, 将微生物和腐植酸络合在一起, 有效活菌数≥20亿·g^-1.

分别于枸杞的4个关键生育期(开花期：6月13日; 果实膨大期：7月8日; 盛果期：8月5日; 落叶期：10月24日)在每小区取0~20 cm的土样, 将土样烘干, 过1 mm筛, 用于土壤理化性质分析.同时, 在相同处理的3个小区内随机取0~20 cm土壤样品, 去除杂物和细根后充分混合成一份土样, 将新鲜土样装入无菌自封袋, 放入带冰的收纳盒并迅速带回实验室, 每个生育期有4份土样(全年总计16份)用于16S高通量测序分析.

参照文献[15], 采用烘干法测定土壤含水率(MC), 采用电位法测定土壤pH值.参照鲍士旦^[16]的测定方法：采用重铬酸钾容重法-外加热法测定土壤有机质(OM); 采用碱解扩散法测定碱解氮(AN); 采用NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法测定速效磷(AP).《森林土壤水溶性盐分分析(LT/T 1251-1999)》测定八大离子含量(Na⁺+K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cl^-、SO₄^2-、CO₃^2-和HCO₃^-, Na⁺+K⁺中Na⁺含量占98%以上, 全计为Na^+[17]), 八大离子之和为土壤全盐量.

土壤细菌高通量测序委托上海生工生物工程有限公司完成.

(1) DNA提取  称取200~500 mg土壤样品, 放入灭菌的2 mL离心管中, 加入1×PBS溶液, 振荡混匀, 在转速10 000 r ·min^-1室温离心3 min, 弃置上层液体.倒置2 mL管于吸水纸上1 min, 直至没有液体流出.采用E.Z.N.^TM Mag-Bind Soil DNA Kit提取试剂盒进行DNA提取.

(2) PCR扩增16S rRNA基因  V3~V4区序列采用引物341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)进行扩增.扩增条件为94℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 45℃退火20 s, 65℃延伸30 s, 5个循环; 94℃延伸20 s, 55℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 20个循环.进一步采用匹配Illumina测序接头和标签引物扩增, 采用生工琼脂糖回收试剂盒(cat：SK8131)对DNA进行回收.回收产物用Qubit 2.0定量, 根据测得的DNA浓度, 将所有样品按照1 ∶1的比例进行混合, 该混合样品可用于后续的测序.

(3) 测序  利用Illumina MiSeq平台进行16S rDNA基因V3~V4可变区高通量测序.将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类, 后根据序列之间的相似性将序列分成不同的操作分类单元(OTUs).在97%的相似水平下进行OTU生物信息统计分析, 每个OTU被视为一个微生物物种, 采用Mothur软件(version 1.30.1)计算群落多样性指数(Shannon指数)、丰富度指数(Chao1指数)来评价细菌群落多样性和丰富度.基于RDP(http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp)数据库对OTU进行注释.

数据采用SPSS软件(version SPSS 25.0)进行方差分析, 采用最小显著差异法(least significant difference, LSD)进行显著性检验, 显著性水平为0.05.用Origin软件(version Origin 2018)绘制生育期内土壤全盐量和土壤细菌门水平和属水平相对丰度; 用R4.2.0软件的VennDiagram和venn程序包绘制Venn图; 用R4.2.0软件的vegan和ggplot2程序包基于Bray-Curtis变异系数进行β多样性分析及相似性分析(ANOSIM).用R4.2.0的tidyverse和vegan程序包做DCA和CCA分析; 用R4.2.0的psych和reshape2程序包进行Spearman相关性分析和绘制环境因子与细菌门水平和属水平的热图, 用R4.2.0的pacman程序包进行聚类和绘制试验处理与微生物功能的热图.使用FAPROTAX数据库(http://www.loucalab.com/archive/FAPROTAX)来进行相关功能预测.

不同生育期内土壤盐离子含量如图 1. 4个生育期土壤全盐量平均值分别为8 211.16、4 804.91、7 436.17和9 998.18mg ·kg^-1, 土壤表层全盐量在生育期内波动较大.全生育期内土壤全盐量随施加微生物菌肥量的增加而减少, 相较CK, F1显著降低了开花期和果实膨大期的Na⁺含量(P＜0.05), 分别降低11.50%和26.61%, F2和F3均显著降低了全生育期的Na⁺含量(P＜0.05), 平均降低33.66%和57.98%.在全生育期内Na⁺随施肥量的增加而减少.相较CK, F1显著降低了枸杞生育旺盛期(开花期至盛果期)的Mg²⁺含量(P＜0.05), 平均降低42.83%, F2和F3均显著降低了全生育期的Mg²⁺含量(P＜0.05), 平均降低34.56%和64.39%.施肥处理(F1、F2和F3)显著降低了开花期和盛果期的Ca²⁺含量(P＜0.05), 相较CK降低了45.83% ~89.80%.开花期, 施肥处理均显著降低了SO₄^2-含量(P＜0.05), 相较CK降低了59.50% ~83.55%; F3在果实膨大期和落叶期显著降低了SO₄^2-含量(P＜0.05), 分别降低46.07%和63.86%.枸杞生育旺盛期, 施肥处理显著降低了Cl^-含量(P＜0.05), 平均降低49.08%.和CK比, 施肥处理平均降低了14.96% 的HCO₃^-含量, 但不显著.

图 1

Fig. 1

不同小写字母表示不同处理差异达到显著水平(P < 0.05) 图 1 生育期内不同微生物菌肥施用量对土壤全盐量的影响 Fig. 1 Effects of different microbial fertilizer application rates on soil salt content during the growth period

微咸水灌溉下施加微生物菌肥对盐渍化土壤水分、pH值及养分的影响如表 2.与CK相比, F2和F3显著增加了全生育期的土壤MC、OM和AN含量(P＜0.05), 显著降低了开花期、盛果期和落叶期的pH值(P＜0.05); 此外, F3显著提高了全生育期的AP含量(P＜0.05), F2在果实膨大期提高了AP, 但未达到显著水平.F1显著提高了全生育期的OM(P＜0.05), 提高了全生育期的MC、AN和AP, 降低了土壤pH值.F1处理下不同指标在部分生育期达显著水平.

表 2 (Table 2)

表 2 生育期内不同微生物菌肥施加量对土壤水、pH值和养分的影响1) Table 2 Effects of different microbial fertilizer application rates on soil moisture content, pH value, and nutrients during the growth period 生育期 处理 MC/% pH ω(OM)/mg·kg-1 ω(AN)/mg·kg-1 ω(AP)/mg·kg-1 开花期 CK 19.48±0.78c 7.85±0.020a 7.34±0.55c 57.57±0.47c 51.00±4.32b F1 20.47±0.21c 7.74±0.017b 10.91±0.82b 79.32±0.72b 60.00±4.28b F2 22.08±0.21b 7.56±0.044c 12.49±0.70b 89.55±0.28b 72.50±3.48b F3 25.59±0.14a 7.55±0.061c 16.83±1.28a 152.98±16.35a 130.00±18.04a 果实膨大期 CK 18.62±0.11c 7.57±0.052a 7.53±0.59c 44.78±2.54c 42.25±5.00b F1 18.72±0.13c 7.50±0.068a 11.73±1.07b 57.57±1.44c 47.00±5.31b F2 19.56±0.36b 7.45±0.102a 14.21±0.70b 83.71±5.42b 53.75±7.65b F3 20.74±0.20a 7.43±0.046a 17.98±1.33a 137.42±11.86a 81.67±4.23a 盛果期 CK 19.98±0.21d 7.65±0.042a 9.21±0.27c 32.41±3.98c 35.50±4.60c F1 20.46±0.13c 7.61±0.021bc 12.17±1.07b 44.78±2.33c 37.25±6.30bc F2 21.04±0.07b 7.50±0.074bc 15.31±0.24a 70.36±8.17b 51.00±4.82b F3 24.38±0.10a 7.45±0.044c 16.85±0.54a 96.59±7.72a 74.50±5.53a 落叶期 CK 21.59±0.05d 7.72±0.059a 7.18±0.27d 39.66±2.33d 10.40±1.55c F1 24.91±0.07c 7.63±0.051ab 11.50±0.57c 71.17±3.12c 11.90±1.40c F2 26.18±0.09b 7.53±0.059bc 12.93±0.33b 84.44±2.13b 26.50±3.75b F3 27.11±0.19a 7.44±0.035c 14.21±0.33a 115.14±8.55a 37.25±4.48a 1)同一生育期同列不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)

表 2 生育期内不同微生物菌肥施加量对土壤水、pH值和养分的影响1) Table 2 Effects of different microbial fertilizer application rates on soil moisture content, pH value, and nutrients during the growth period

为了解盐渍化土壤细菌群落组成, 通过对97%相似水平下的序列进行聚类, 绘制出Venn图(图 2).微咸水灌溉下, 不同生育期的OTUs总数在5 392~6 655之间.在开花期, CK、F1、F2和F3的OTUs总数分别为3 007、3 877、4 109和4 830, 特有OTUs数为211、646、375和761, 相较CK, 施肥处理均增加了OTUs总数和特有OTUs数, 且OTUs总数随施肥量的增加而增加, 说明施肥处理的物种种类增加.在果实膨大期, F3特有OTUs数最多, 高于CK的32.09%.在盛果期, CK、F1、F2和F3的OTUs总数分别为3 869、3 697、3 593和3 636, CK的OTUs总数略高于其他施肥处理.在落叶期, F3特有OTUs数最多, 为593.说明较高的微生物菌肥施用量对细菌群落影响较大.

图 2

Fig. 2

图 2 不同处理OTUs的韦恩图 Fig. 2 Venn diagram of OTUs with different treatments

4个处理中变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)是共有OTUs中的优势菌门, Synergistetes是F1和F2所特有的菌门, Diapherotrites是F1和F3所特有的菌门, Woesearchaeota是F2和F3所特有的菌门.

表 3为不同生育期微咸水灌溉下施肥处理的丰富度指数和多样性指数.在开花期, 随菌肥量增加, Chao1指数和Shannon指数呈增加趋势, 其中F3的Chao1指数和Shannon指数较CK提高了31.42%和9.27%.在果实膨大期至落叶期, 相较CK, 仅有落叶期F2的Chao1指数高于CK的0.50%, 其他生育期其他处理的Chao1指数均低于CK.尽管施肥处理不再增加丰富度指数(即Chao1指数), 但在果实膨大期, F2和F3处理的Shannon指数分别高于CK的0.64%和2.86%, 在盛果期, F1和F3处理的Shannon指数分别高于CK的0.94%和1.10%, 多样性指数是物种丰富度和均匀度的综合指标, 施肥处理增加了多样性指数, 说明施肥可能增加了某些菌属的数量.

表 3 (Table 3)

表 3 枸杞不同生育期土壤细菌丰富度指数和多样性指数 Table 3 Richness index and diversity index of soil bacteria in different growth stages of Lycium barbarum 枸杞生育期 施肥处理 丰富度指数 (Chao1) 多样性指数 (Shannon) 开花期 CK 2 960.99 6.26 F1 3 273.43 6.35 F2 3 810.27 6.63 F3 3 891.40 6.84 果实膨大期 CK 2 509.67 6.29 F1 1 841.02 4.94 F2 2 392.56 6.33 F3 2 444.67 6.47 盛果期 CK 3 151.52 6.39 F1 2 941.57 6.45 F2 3 009.24 6.08 F3 2 968.00 6.46 落叶期 CK 3 100.81 6.70 F1 2 768.35 6.24 F2 3 116.37 6.36 F3 2 984.17 6.67

表 3 枸杞不同生育期土壤细菌丰富度指数和多样性指数 Table 3 Richness index and diversity index of soil bacteria in different growth stages of Lycium barbarum

对不同生育期微咸水灌溉下施肥处理的土壤微生物群落进行主坐标分析(PCoA).结果表明, 在细菌β多样性中(图 3), PC1轴和PC2轴的贡献率分别为29.74%和12.57%, 累计贡献率为42.31%.生育期内不同微生物菌肥施加量下细菌群落组成存在显著差异(ANOSIM, R=0.181 4, P < 0.05).

图 3

Fig. 3

图 3 不同生育期施加微生物菌肥的土壤细菌PCoA分析 Fig. 3 PCoA analysis of soil bacteria in improvement treatments at different growth stages

枸杞生育期内的土壤样品中共检测到39个门类的细菌, 微咸水灌溉下不同微生物菌肥施用量的土壤门水平细菌群落组成结构如图 4.平均相对丰度超过10%的细菌门类为优势门类, 全生育期优势菌门种类未发生变化, 本研究中优势菌群为变形菌门(33.21% ~48.35%)、拟杆菌门(6.16% ~19.45%)和放线菌门(4.88% ~12.57%).开花期施肥处理的放线菌门相对丰度较CK增加了11.89% ~42.02%, 果实膨大期至落叶期, 施肥处理的变形菌门相对丰度较CK增加了1.75% ~16.27%, 除盛果期, 施肥处理的拟杆菌门相对丰度较CK降低了3.34% ~61.28%.

图 4

Fig. 4

(a)开花期, (b)果实膨大期, (c)盛果期, (d)落叶期 图 4 不同处理在门水平的微生物相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of microorganisms at the phylum level for different treatments

土壤属水平细菌群落组成结构如图 5.全生育期内所有处理均含有较高丰度的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)(1.43% ~4.93%)和假单胞菌属(Pseudomonas)(0.80% ~6.10%).在开花期, F1、F2和F3增加了新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium)的相对丰度, 相较CK分别增加了68.91%、429.15%和391.92%; 在果实膨大期, F1处理含有较高丰度的莱茵海默氏菌属(Rheinheimera, 13.32%)、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium, 5.94%)、赤杆菌属(Erythrobacter, 4.45%)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas, 3.54%), 而CK、F2和F3处理含有以上菌属的相对丰度不到0.2%; 在盛果期, F2处理栖砂杆菌属(Arenibacter)的相对丰度为5.71%, 高于CK(0.01%)、F1(0.19%)和F2(0.17%).此外, 相较CK, F3在4个生育期内均增加了Gp6的相对丰度, 平均增加102.73%; 在果实膨大期和盛果期, 相较CK, F1增加49.85% ~429.36%的庞蒂杆菌属(Pontibacter)相对丰度; 在开花期和盛果期, 相较CK, F2增加39.91% ~41.87%的溶杆菌属(Lysobacter)相对丰度.

图 5

Fig. 5

(a)开花期, (b)果实膨大期, (c)盛果期, (d)落叶期 图 5 不同处理在属水平的微生物相对丰度 Fig. 5 Relative abundance of microorganisms at the genus level for different treatments

本研究采用FAPROTAX对土壤细菌群落进行功能预测和注释, 共获得49种功能分组, 选择相对丰度大于0.1%的功能作为主要功能类群^[18], 共得到27个(图 6).微咸水灌溉下施加微生物菌肥后盐渍土细菌的功能主要包括化能异养(15.07%, 相对丰度, 下同)和需氧化能异养(13.16%).此外, 本研究还观测到含量较高的N循环相关功能, 有硝酸还原作用(1.03%)、硝化作用(0.84%)、氮呼吸(0.78%)和硝酸盐呼吸(0.77%)等.施肥处理降低了需氧化能异养功能的相对丰度, 且随施肥量增多, 该功能的相对丰度降低越多; F2和F3降低了化能异养的相对丰度, 分别降低了CK的2.83%和20.99%.施肥处理增加了几丁质分解功能和叶绿体功能的相对丰度, 其中F2的增加程度最高, 分别增加了CK的89.11%和301.30%.

图 6

Fig. 6

图 6 盐渍化土壤施加微生物菌肥后FAPROTAX功能预测(相对丰度＞0.1%) Fig. 6 Prediction of FAPROTAX function after application of microbial fertilizer in salinized soil (relative abundance>0.1%)

对OTUs数据进行去趋势分析(DCA), 结果显示排序轴的最大梯度长度为4.14, 选择线性模型中的典型相关分析(CCA)用于后续分析.土壤环境因子与OTUs水平细菌的CCA结果如图 7, 第一主轴对门水平细菌群落方差变化的解释量为17.41%, 第二主轴的解释量为14.87%, 两轴共解释总变异的32.28%.从图 7可以看出, 与第1排序轴相关性高的环境因子为MC(r2=0.557 4, P＜0.01)、Na⁺(r2=0.422 1, P＜0.05)和OM(r2=0.378 4, P＜0.05), 说明以上环境因子与细菌群落组成具有显著的相关性, 是影响细菌群落组成的重要因素.

图 7

Fig. 7

图 7 土壤细菌群落在OTUs水平与土壤环境因子的CCA分析 Fig. 7 CCA analysis of soil bacterial at the OTUs level with soil environmental factors

通过Spearman相关性热图分析土壤理化性质对不同处理土壤细菌门水平群落组成的影响, 如图 8(a).MC与酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)呈显著正相关(P＜0.05), 与浮霉菌门呈显著正相关(P＜0.01); AN与酸杆菌门呈显著正相关(P＜0.05).Ca²⁺与酸杆菌门和绿弯菌门呈显著负相关(P＜0.05), SO₄^2-离子与酸杆菌门呈显著负相关(P＜0.05), Mg²⁺与放线菌门和疣微菌门(Verrucomicrobia)呈显著正相关(P＜0.05).

图 8

Fig. 8

(a)门水平, (b)属水平; 1.Na+, 2.Mg2+, 3.Ca2+, 4.SO42-, 5.Cl-, 6.HCO3-, 7.全盐量, 8.MC, 9.pH, 10.OM, 11.AN, 12.AP; X轴和Y轴分别为环境因子和细菌菌群, 通过计算获得相关性R值和P值; *表示0.01＜P < 0.05, **表示0.001＜P < 0.01, ***表示P＜0.001 图 8 环境因子与细菌群落组成Spearman相关性热图 Fig. 8 Spearman correlation heatmap between environmental factors and bacterial community composition

通过Spearman相关性热图分析土壤理化性质对不同处理土壤细菌属水平群落组成的影响, 如图 8(b).鞘氨醇单胞菌与HCO₃^-呈显著正相关(P＜0.01), 亚硝化单胞菌(Streptophyta)与HCO₃^-呈显著负相关(P＜0.05), 与Mg²⁺呈显著正相关(P＜0.05). Gp6与Ca²⁺呈极显著负相关(P＜0.001), 与SO₄^2-呈显著负相关(P＜0.01), 与Cl^-和土壤全盐量呈显著负相关(P＜0.01); Gp6与AN呈显著正相关(P＜0.01), 与AP和OM呈显著正相关(P＜0.05).

本研究发现土壤全盐量在生育期内波动较大, 灌溉水质的不同导致了土壤全盐量的差异.开花期至果实膨大期进行了一次淡水灌溉, 土壤全盐量明显下降; 而在果实膨大期至盛果期进行了两次微咸水灌溉, 此时微咸水中盐分被带入土壤, 增加了土壤盐分; 而盛果期至落叶期无灌溉, 土壤水分蒸发较大, 落叶期深层土壤盐分返回表层, 因此土壤全盐量有所增加.

不同微生物菌肥由于制作工艺和成分等不同而有所差异, 本文所使用的微生物菌肥除微生物菌种外, 还有大量的腐植酸.腐植酸是一种带有负电的胶体, 能够吸附一价阳离子, 促进土壤团粒结构的形成, 增加土壤的通透性, 从而加快了土壤表层盐碱的淋溶和灌洗^[19], 故土壤全盐量随施肥量的增加而减少.本研究发现, 施肥后土壤Na⁺含量显著降低, 开花期和盛果期的Ca²⁺含量显著降低, 这是因为微生物菌肥中的腐植酸有促进土壤中Ca²⁺溶解的作用, 从而利于Na⁺置换及盐分淋洗^[20], 因此, Na⁺含量随施肥量的增加而减少.另外, 微生物菌肥施入土壤后, 其中的腐殖酸可与土壤中Ca²⁺结合, 生成Ca-P沉淀^[21], 降低了Ca²⁺含量, 并可能与Cl^-形成络合物, 改变其形态, 降低土壤中Cl^-含量^[22].微生物菌肥中腐植酸可促进团聚体形成, 增加土壤孔隙度, 吸收了如SO₄^2-等大量离子^[23], 也大量吸收了Mg²⁺.

本研究发现, 微咸水灌溉下施加微生物菌肥可提高MC、OM、AN和AP, 降低pH值.微生物菌肥所含的腐植酸具有疏松多孔的特性, 可提高土壤渗透性, 使更多的水被吸持在土壤孔隙里, 减少蒸发.腐植酸由酸性有机物胡敏酸和富里酸组成, 含有羧基、羟基等含H官能团, 可降低pH值, 但其降低pH效果在果实膨大期并不显著, 可能是因为降盐过程中, 土壤中Na⁺与土壤胶体中Ca²⁺和Mg²⁺相交换, 使土壤胶体吸附较多的交换性钠, 土壤呈强碱反应^[20].腐殖酸可有效提升土壤有机质和速效养分的含量^[24], 因为腐植酸本身是一种有机改良剂, 施入土壤后一方面增加了土壤有机质含量, 另一方面为微生物提供了更多碳源, 对土壤有机质的分解产生了激发效应^[25].腐植酸分子中丰富的活性官能团可与尿素有机结合, 对氮素起缓释增效作用^[26].腐植酸吸附土壤中游离的磷离子后形成络合物, 避免了养分流失, 提高了AP含量^[27].此外, 腐植酸可活化土壤磷素, 改良盐碱土磷素供应, 促进作物对磷的吸收利用^[28].说明在微咸水灌溉下, 增施含有腐植酸的微生物菌肥对土壤保持肥力有积极意义.

土壤理化性质的改变势必会影响微生物群落结构.本研究发现, 在枸杞生育期内所有处理的优势菌门均为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门, 但3种优势菌门在丰度上有着一定的差异.施加微生物菌肥提高了变形菌门和放线菌门的相对丰度, 降低了拟杆菌门的相对丰度.本试验中施加菌肥显著提高了土壤有机质含量, 变形菌门是富营养细菌^[29], 因而变形菌门的相对丰度增加, 与王国丽等^[12]研究的结果一致.尽管李金花等^[13]研究认为施用球毛壳ND35微生物菌剂使变形菌门的相对丰度下降, 但α-变形菌纲和δ-变形菌纲的相对丰度显著上升, 其认为两类变形菌纲的增加与土壤养分含量较高有关.微生物菌肥降低了土壤盐分, 拟杆菌门与盐分呈正相关^{[12, 27]}, 因而施肥降低了拟杆菌门相对丰度.土壤放线菌在有机质的分解中占主导地位, 参与有机质分解和腐殖质形成分解过程^[30], 本试验中施加的微生物菌肥以腐植酸为底物, 故放线菌门增加, 这与李金花等^[13]研究的结果相似.

本研究发现, 全生育期内不同处理均含有较高丰度的鞘氨醇单胞菌和假单胞菌属, 两者都是盐碱地常见的优势菌属^{[31, 32]}.试验田常年在作物生育期前施有机肥做为底肥, 有机肥补充了土壤的碳库和氮库, 从而刺激了变形菌门中鞘脂单胞菌属相对丰度的增加^[6], 此外, 鞘脂单胞菌属于变形菌, 其适应性强且能分解复杂的有机物, 在含盐量较高的土壤中有较强的适应能力^[33].假单胞菌属具有促生、固氮和生物防治等功能特性^[34], 可迅速分解土壤中腐殖质^[35].本研究施用的微生物菌肥中含有大量腐植酸, 因而有较多的假单胞菌属.除鞘氨醇单胞菌和假单胞菌属, 不同生育期的优势菌属有所差异, 体现了微生物生态的复杂变化.施肥处理增加了开花期新鞘氨醇杆菌的相对丰度, 其中F2处理相较CK增加最多, 新鞘氨醇杆菌属普遍具有降解芳烃化合物的特性, 改善土壤质量的同时促进植物生长, 对生物修复有重要价值^[36].在果实膨大期, F1处理含有较高丰度的寡养单胞菌, 有利于分解土壤有机质、促进碳循环和养分转化吸收^[37]; F1还增加了的莱茵海默氏菌属、赤杆菌属丰度, 寡养单胞菌、莱茵海默氏菌属和赤杆菌属同属于变形菌门, 其变化与变形菌门的相对丰度变化对应一致.施加微生物菌肥会增加多个生育期Gp6、庞蒂杆菌属和溶杆菌属的相对丰度.相较CK, F3在4个生育期内均增加Gp6的相对丰度, 平均增加102.73%. Gp6属于酸杆菌门, 其相对丰度和pH呈负相关(图 8), 因此施肥会增加Gp6, 但王慧颖等^[38]研究结果表明Gp6和pH值呈极显著正相关.分析原因为二者研究区土壤性质不同, 王慧颖等^[38]的研究区为东北黑土, 呈酸性(pH＜7), 本研究区土壤为河套灌区盐渍土, 土壤呈碱性(pH＞7); 相较CK, F1增加了果实膨大期和盛果期的庞蒂杆菌属, F2增加了开花期和盛果期的溶杆菌属.庞蒂杆菌属具有耐盐特性^[39], 溶杆菌属具有拮抗多种植物病原菌功能, 同时溶杆菌属具有固氮功能^[40], 施加微生物菌肥使其丰度提高, 说明微生物菌肥改善了土壤结构, 增加了有益菌属(图 2).以上结果说明, 不同微生物菌肥施用量会增加不同土壤优势菌属.

土壤细菌群落的变化必然导致菌群功能的改变, 了解土壤菌群功能有助于土壤改良与修复^[41].FAPROTAX数据库是基于可培养菌的文献证据整理的原核生物功能注释数据库, 可较好地预测环境样本中的原核生物的生物化学循环过程^[42].本研究发现, 研究区细菌群落最丰富的功能是化学异养和需氧化学异养, 这是因为研究区含有较高丰度的变形菌和酸杆菌, 这些菌群具有化学异养的功能^[43].变形菌门的许多细菌为共营养细菌^[18], 既是优势菌门也是关键类群.胡愈炘等^[44]认为异养是大多数细菌的主要营养方式, 与本研究观点类似.本研究发现多种与氮循环相关的功能, 说明研究区土壤氮循环较为重要.硝酸盐还原功能较强, 可将土壤中硝酸盐还原为铵态氮, 减少土壤氮的流失^[41].本研究得出, 随微生物菌肥量增加需氧化能异养功能的相对丰度降低, 同时F2和F3处理降低了化能异养功能的相对丰度.施肥降低两种相对丰度较高的细菌功能可能是因为其增加了其他功能(如几丁质分解功能和叶绿体功能).施加微生物菌肥能够促进团聚体形成, 大团聚体含有较多的不稳定的碳, 这部分碳能够刺激多为共营养型的几丁质分解菌的生长^[18].此外, 施肥增加了叶绿体功能, 说明利于植物光合作用.

土壤细菌是土壤中活性很强的微生物, 其生长活动易受到外界因素影响.环境因子对土壤微生物的丰度、多样性和功能有显著影响, 是土壤微生物群落组成的重要影响因素^[45].He等^[46]研究指出, 影响黄河三角洲土壤微生物的主要因素有MC, 有研究表明OM等是影响细菌群落结构的主要环境因子^{[45, 47]}, 张广帅等^[48]研究表明, Na⁺、K⁺和Ca²⁺等盐基离子是影响小凌河口湿地微生物群落的主要因子, 以上研究的结果与本研究并不完全一致.本研究CCA结果表明, 驱动盐渍土细菌群落结构变化的主要因素有MC、Na⁺和OM.土壤细菌群落结构显著受MC影响^[49], 对MC的变化敏感, 通常认为增加水分含量会降低微生物丰度和生物活性, 影响微生物群落组成和多样性^[50].

张仲富等^[50]和魏艳晨等^[51]研究认为酸杆菌门和MC呈负相关, 这与本研究的结果存在差异, 本研究和闫海冰等^[52]研究认为, 酸杆菌门和MC呈正相关.这可能是因为研究区土壤条件不同, 张仲富等^[50]和魏艳晨等^[51]的研究区为湿地和荒漠草原, 而闫海冰等的研究区土壤含有10 cm厚的腐殖质层, 本研究施加了含有腐植酸的微生物肥料, 土壤中都含有较多腐植酸, 因而得出同样的结论.此外, MC增加利于土壤盐分随水分流动, 进而将盐分排出土壤, 利于盐碱地改良, 表现为酸杆菌门增加^[53].同样地, 施加含腐植酸的微生物菌肥提高浮霉菌门和绿弯菌门的相对丰度^[27], 同时提高MC(表 2), 使得浮霉菌门和绿弯菌门均与MC呈显著正相关.此外, 浮霉菌可以净化和改善土壤水环境^[54], 王树梅等^[55]同样得出浮霉菌门与MC呈显著正相关.本研究认为酸杆菌门与AN呈显著正相关, 而Zhou等^[56]研究认为酸杆菌门和氮含量呈负相关, 可以是由于不同的酸杆菌亚群对氮素的响应不同, 进而影响酸杆菌门细菌在土壤中的整体相对丰度^[57], 在本研究中酸杆菌门的亚群Gp6与AN呈显著正相关, 这与贾远航等^[58]研究的结果一致.

本研究得出Ca²⁺与酸杆菌门和绿弯菌门呈显著负相关, 酸杆菌门和绿弯菌门均为利于盐渍土改良的有益菌门, 绿弯菌门是重要的根际微生物, 可以专门降解根际古老土壤有机质^[59], 具有耐贫瘠和抗寒性的特点^[60], 酸杆菌门细菌可分解植物残体, 改善土壤碳循环系统^[61].Ca²⁺与有益菌门呈显著负相关, 说明增加盐渍土有益菌门的同时利于降低土壤盐离子.类似地, 本研究得出SO₄^2-离子与酸杆菌门呈显著负相关, 这与何玉实等^[62]基于土壤盐分较高的干旱半干旱地区研究的结果相似.

相较仅微咸水灌溉(CK), 生育期内微生物菌肥施用量为10 500 kg ·km^-2时(F3处理)显著降低了全生育期土壤Na⁺含量(P＜0.05), 同时显著提高全生育期土壤MC、OM、AN和AP含量.不同微生物菌肥施用量均会增加不同土壤优势菌属, 如新鞘氨醇杆菌等; 施加微生物菌肥会增加土壤细菌的几丁质分解和叶绿体等功能.细菌群落与土壤理化性质相关性分析揭示了土壤MC、Na⁺和OM是影响细菌群落组成的重要因素, 相关性热图显示Gp6和AN呈显著正相关(P＜0.01).相较CK, F3处理在生育期内增加了Gp6的相对丰度, 施加微生物菌肥优化了群落结构.因此, 微咸水灌溉条件下施用微生物菌肥是一种适宜河套灌区盐渍土的微咸水安全利用方式, 本研究推荐微生物菌肥用量为10 500 kg ·km^-2.