2023, Vol. 44
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 中国科学院华南植物园退化生态系统植被恢复与管理重点实验室, 广州 510650
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Key Laboratory of Vegetation Restoration and Management of Degraded Ecosystems, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China
抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)是一种环境新污染物, 广泛存在于环境微生物及环境介质上[1, 2].与常规化学污染物不同, 环境中抗生素抗性基因能够随着微生物的增殖而复制增加(污染倍增); 并且微生物之间存在结合、转化和转导等机制使得ARGs能够在不同微生物之间迁移传播(污染扩散), 因此抗生素抗性基因具有独特的生物学特征[3, 4], 抗性基因的类型和抗性机制也因具体环境而有所不同, 能够直接或间接影响生态安全和人类健康.当前, 针对农田土壤、森林土壤和河口湖泊沉积物等土壤环境, 关于微生物抗生素抗性基因的分布特征和迁移传播机制已经有不少研究报道[3, 5, 6], 世界卫生组织和全球公众也非常关注环境抗生素抗性问题.近年来, 抗生素抗性基因和耐药微生物污染态势越来越严重, 使得自然环境和人类健康面临着复杂严峻的挑战.
涵盖全球40%土地和30%以上人口的干旱区总体生态环境比较脆弱.过去几十年, 全球旱区经历了快速的城市扩张过程, 对自然生境和土地利用产生了强烈的影响[7].在人类的改造下, 荒漠绿洲土壤肥沃, 灌溉条件便利, 通常是干旱区农业发达的区域, 一般分布在河流、地下水储藏丰富的地方, 以及有冰雪覆盖的山麓地区.农田土壤微生物抗性基因受到植物种植类型、耕作模式和地理环境条件的影响[8, 9].有研究认为农田土壤与人类病原体能够交换抗生素抗性基因, 增加了土壤环境微生物耐药性对生态和人类的风险[10].化肥或有机肥中存在一些金属元素, 农田土壤微生物在重(类)金属元素协同选择压力下, 产生了更多种类和更高丰度的抗生素抗性基因[3, 11].此外, 可移动基因元件(mobile genetic elements, MGEs)对于加快抗性基因在微生物群落中的横向转移和扩散也扮演着重要角色[12, 13].抗生素抗性基因和耐药菌还可以在土壤-植物-微生物系统中迁移传播, 并可能经由食物链对人类健康造成危害[14].
基于地球关键带(earth critical zone)概念和全健康(one health)视角下, 目前针对干旱区, 特别是人类活动影响和生态足迹比较大的荒漠绿洲地区的微生物抗生素抗性研究比较少, 抗生素抗性基因及耐药微生物的分布特征、影响因素和生态环境健康风险不甚明确.本文采用高通量PCR技术和高通量测序方法, 对新疆天山北麓的荒漠绿洲5种不同土地利用类型土壤的微生物多样性和抗性基因的污染特征开展了研究, 全面阐释了抗性基因的分布格局及其变化的驱动机制.基于本研究, 能够对荒漠绿洲地区的农田土壤生态健康评估、土壤微生物潜在风险防控和土地合理利用等提供科学理论支持, 对可持续农业实践也有重要启示.
1 材料与方法 1.1 研究区域地理环境和样品采集本研究中的样本采集于新疆石河子市及周边地区, 位于天山北麓, 古尔班通古特沙漠南缘.该地区农业发达, 属于典型的绿洲农业, 主要种植有棉花、玉米、小麦和番茄等农作物.如图 1所示, 2021年9月2日, 从沙漠边缘往石河子市(绿洲中心)方向依次采集了荒漠沙生植物土壤(Dest)、棉花地土壤(Cotn)、玉米地土壤(Maiz)、湖边芦苇地土壤(Reed)和湖泊沉积物(Sedt), 其中Dest为研究对照点(人类活动干扰最小).每个采样点收集附近5处的土壤或沉积物, 混合并去除小碎石、植物枯枝、根际残体等, 然后取3份(每份约2 kg)为该点的3个平行样本.所采集的土壤及沉积物样本保存在低温采样箱并在36 h内运回实验, 一部分常温晾干, 用于重金属等理化性质分析; 另一部分于－20℃冰箱保存, 用于微生物组总DNA的提取.
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图 1 荒漠绿洲的典型土地利用类型 Fig. 1 Land use pattern in desert-oasis continuum |
取出低温冰箱的样品, 在室温解冻后, 每个样本称取约0.5 g, 放入FastDNA spin kit for soil(MP Biomedcals, 美国)土壤DNA提取专用试剂盒中配套的裂解管中.后续微生物DNA提取步骤, 按照试剂盒中的说明书的流程方法进行, 最后所提取获得的DNA溶解在80 μL的DES溶液中.采用超微量分光光度计NanoDrop 1000(Thermo Scientific, 美国)测定DNA样本的浓度和纯度.提取的DNA样本置于－80℃超低温冰箱保存.
1.3 样品的含水率和金属元素分析每个样品称取约50 g, 根据称重法, 测定含水率.样品在实验室自然通风条件下晾干并在冷冻干燥机(FreeZone Freeze Dryers, LABCONCO, 美国)冻干24 h后, 用玛瑙研钵进行充分研磨, 后用100目尼龙网筛过滤得到土壤粉末样品约50 g, 装入自封袋并干燥保存.每个土壤粉末样品称重约4g, 添加硼酸粉末进行压片制作成为上机测试的土壤样品, 采用X射线荧光光谱仪(XRF, PANalytical, 荷兰)测定土壤和沉积物中的As、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb和Zn等重(类)金属元素的含量.
1.4 普通16S rDNA定量PCR和抗性基因高通量定量PCR微生物16S rDNA定量PCR分析是基于16S rRNA基因短片段PCR扩增过程中SYBR荧光信号的变化进行[15].定量PCR型号是LightCycler 480 Ⅱ(Roche, 瑞士).对应的标准质粒浓度范围是1.63×103~1.63×109 copies·μL, 扩增效率范围为1.9~2.1, PCR效率良好.具体的定量PCR反应体积及组成为：总体积20 μL, SYBR Master Mix试剂10 μL, 无菌超纯水7 μL, 正反向引物各1 μL, DNA样本为1 μL.
抗生素抗性基因的种类及丰度的分析测试基于WaferGen SmartChip系统平台(TaKaRa, WaferGen, 美国).具体选择的功能基因(抗性基因)、高通量PCR扩增条件和数据筛选分析依据参考文献[16, 17].WaferGen SmartChip高通量PCR系统平台具有分析通量高、加样自动化和节约试剂样品的优势, 适用于环境微生物功能基因谱集的定性和定量的高通量分析.
1.5 细菌16S rDNA扩增与测序分析细菌的核糖体16S rDNA为特征编码序列, 常用于物种分类以及进化关系研究.基于可变区V4-V5片段进行PCR扩增, 并对获得的扩增子进行高通量测序[18].测序所获得的数据用QIIME进一步处理, 细菌分类操作单元(operational taxonomic unit, OTU)的获得和基于OTU的不同分类水平归类按照相关研究中的方法进行分析[19].
1.6 数据统计分析本研究所涉及的统计分析, 如平均值和标准方差等均采用Excel 2016版本(Microsft, 美国)进行分析.样品的显著性分析和相关性均采用软件SPSS V18.0(IBM, 美国).微生物测序数据的分析主要基于R(version 3.6.3)软件的各种特定的软件包工具进行绘制作图, 比如pheatmap包进行抗性基因的热图分析等.各种柱状图等的数据绘图由Origin 9(OriginLab, 美国)完成.抗性基因与微生物共发生网络关系的数据计算也是基于上述R软件, 并采用Gephi V0.9.2软件进行绘图.
2 结果与分析 2.1 抗生素抗性基因的种类土壤和沉积物总共检测到127种抗生素抗性基因.图 2(a)结果显示, Dest、Cotn、Maiz、Reed和Sedt分别检测到了59、64、73、75和81种, 可以看出随着土地利用形式的变化, ARGs的种类总体上呈现增加的趋势.这些检测出的ARGs根据对应的抗生素的具体类型, 可以归并成8大类：氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素类、MLSB类、多重耐药类、磺胺类、四环素类和万古霉素类抗性基因.可移动基因遗传元件(MGEs)包含了转座子(transposon)和整合子(integron), 在荒漠绿洲5种环境样品中分别检测出2、3、7、5和7种.此外, 检测到的ARGs涵盖了3种主要的抗生素抗性机制：抗生素失活、细胞保护和主动外排机制[图 2(b)], 所占的相对比例平均分别为37.27%、15.50%和40.20%.
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图 2 检测出的基因种类及其抗性机制类型 Fig. 2 Number of ARGs/MGEs and the resistance mechanisms |
荒漠绿洲中的土壤和湖泊沉积物中总抗性基因的丰度变化范围为3.84×108~3.77×109 copies·g-1, 随着人类农业活动的增强, 抗性基因丰度在Dest、Cotn、Maiz、Reed和Sedt呈现增高趋势(图 3).具体来说, 多重耐药类抗性基因呈现出最高丰度(3.38×108~3.29×109 copies·g-1), 是总抗性基因中最重要的组成部分. β-内酰胺类和MLSB类抗性基因的丰度水平也比较高(1.56×107~1.40×108 copies·g-1), MGEs的基因丰度水平与这二者相近(1.75×107~1.23×108 copies·g-1).其余种类抗性基因丰度比上述抗性基因低, 其中磺胺类抗性基因在荒漠沙生植物土壤中未检出(图 2和图 3).
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图 3 检测出的抗性基因丰度 Fig. 3 Abundance of ARGs and MGEs |
微生物的Chao1指数主要关注物种丰富度信息, 数值越大, 表明环境微生物的物种丰富度和多样性越高.图 4(a)显示, 随着荒漠绿洲土地利用类型的变化(Dest、Cotn、Maiz、Reed和Sedt)和含水率的提高(0.41%~36.32%), 5种不同土壤样本的细菌Chao1指数呈现总体增加的趋势, 证明土壤环境微生物的物种组成和多样性显著增加.荒漠绿洲环境中土壤和湖泊沉积物中细菌相对丰度前5的组成是：放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和酸杆菌门(Acidobacteria), 占据总体丰度的80.62%, 是细菌微生物群落最主要的组成结构[图 4(b)].此外, 湖泊沉积物中芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和厚壁菌门(Firmicutes)丰度相对较低, 而在其余4种相对干燥的土壤中则丰度较高, 可能与这两类微生物在干旱区环境的生存策略和适应性有关.另外, 湖泊沉积物中硝化螺旋菌门(Nitrospirae)也是显著高于其它环境土壤[图 4(b)], 表明沉积物环境可能存在氮素微生物循环的特异性生境.
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图 4 微生物Chao1指数、细菌组成和相对丰度 Fig. 4 Chao1 index, bacterial composition, and relative abundance |
基于X射线荧光光谱仪(XRF), 笔者着重研究了Cr、Ni、Cu、Zn、As、Pb和Mn这7种元素的含量.其中ω(Mn)范围为571.75~920.82 mg·kg-1, 平均值为782.03 mg·kg-1, 农田土壤中Mn的主要来源是岩石风化输入和化肥输入, 而且背景值含量比较高.图 5可以看出, 相较于荒漠背景土壤, 受人类互动影响剧烈的农田土壤锰元素显著增加(P < 0.05). ω(Cr)范围为36.92~60.11 mg·kg-1, 平均值为52.03 mg·kg-1; ω(Ni)范围为13.41~44.15 mg·kg-1, 平均值为30.74 mg·kg-1; ω(As)范围为5.85~17.99 mg·kg-1, 平均值为52.03mg·kg-1.其余金属元素含量见图 5.总体上, 相较于荒漠土壤, 农田土壤重(类)金属元素含量都增加了.根据《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》(GB 15618-2018), 本研究重点关注的7种重(类)金属元素的含量都没有超过对应的土壤污染风险筛选值, 土壤污染风险小, 但是也不能忽略人类活动(化肥施用和地下水灌溉等引入)对于污染累积导致的潜在长期影响.
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图 5 重(类)金属元素含量 Fig. 5 Concentrations of seven heavy(loid) metal |
环境微生物是各类抗生素抗性基因的重要存续和演化载体.基于普氏分析(procrustes analysis)结果表明, 抗生素抗性基因(ARGs)与细菌分类操作单元(OTU)组成具有良好的一致性(P=0.001, 偏差平方和M2=0.49, r=071), 两者之间具有很强的正向关联度[图 6(a)], 表明荒漠绿洲土壤微生物与抗生素抗性基因关系非常密切.共现性网络分析(co-occurrence network analysis)结果进一步证明[图 6(b)], 在细菌属水平(genus)上, 细菌与不同功能的抗生素抗性基因具有广泛而紧密的联结共存关系(Spearman's ρ>0.7, P < 0.001).其中硫杆菌属(Thiobacillus)与氨基糖苷类(aadA、aadA5)、β-内酰胺类(ampC、fox5、blaSFO)和多重耐药类(oprD)等11种抗生素抗性基因显著相关(P < 0.001), 并且与一类整合子(intI1)基因也呈现极显著的相关关系(P < 0.001).沙漠细菌属(Pontibacter)具有耐旱、耐盐碱和抗辐射等特点, 与多重耐药类(acrF、acrA、emrD和qacEdelta1)等7种抗性基因极显著相关(P < 0.001).诺卡氏菌属(Nocardioides)属于放线菌门, 与多重耐药类(qacEdelta1)和四环素类(tetG、tetM)等5种抗性基因显著共现性相关.此外, 耐盐微杆菌属(Salinimicrobium)、土壤红杆菌属(Solirubrobacter)和链霉菌属(Streptomyces)也与较多抗性基因相互关联且关系密切[图 6(b)].因此, 在不同土地利用类型模式下, 微生物组与抗生素抗性基因组紧密关联, 细菌(属水平)具有携带多种不同类型抗性基因的潜力, 绿洲荒漠土壤是抗生素抗性基因和抗性菌的重要存储库.
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图 6 微生物和抗生素抗性基因的普氏分析和共现性网络分析 Fig. 6 Procrustes analysis between ARGs and OTU and co-occurrence network analysis among bacterial genus and antibiotic resistome |
荒漠绿洲中Dest、Cotn、Maiz、Reed和Sedt这5种不同土地利用类型中抗生素抗性基因的种类组成和丰度水平有显著差异, 并随着土壤含水率的增加而呈现了增加的趋势(图 2和图 3).进一步用抗生素抗性基因的聚类热图来探究抗性基因分布组成差异和相互之间的关系(图 7).结果显示, 抗生素抗性基因总体上聚类成3组：c组为抗性基因存在于所有样品当中, 并且总体丰度水平较高; b组总体丰度水平低于c组, 并在这5种不同土地利用类型依次呈现增加趋势(相较于荒漠土壤各类背景基因富集增加); a组抗性基因的特征是, 相对于Dest对照组, 在Cotn、Maiz、Reed和Sedt这4种土地利用类型中有新出现的抗生素抗性基因(化肥施用和地下水灌溉等农业活动引入的外源基因).有研究表明, 不管是相对原始状态还是人类活动影响下的生态环境, 抗性基因都是广泛存在的, 但是人类活动促进了环境抗生素抗性基因的迁移和扩散[13, 20].总体上看, 基于土地利用类型变化的农业种植活动, 一些抗性基因维持在较高水平[图 7(c)], 还出现了一些未曾出现过的抗性基因(vanRA、aadA2、ermT、tetQ、blaPAO、tolC和qacH等)和可移动遗传元件(tnpA), 表明人类活动是荒漠绿洲土壤抗生素抗性基因赋存和变化的重要影响因素.Xiang等[21]研究认为人类活动与城-郊系统不同土地利用类型的土壤抗性基因变化显著相关, 这与本研究的结果一致.Wall等[22]认为可持续的土地利用模式, 能够平衡病原菌和有益微生物之间的关系, 进而基于土壤生物资源来应对环境变化, 促进土地资源可持续利用[23].因此在干旱区的绿洲农业模式下, 土壤环境微生物及其抗性基因的变化格局对于人类健康和生态平衡影响还值得进一步深入研究.
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每个样品3个重复, 色柱表示lg(丰度) 图 7 基于ARGs和MGEs丰度的聚类热图分析 Fig. 7 Clustering heatmap showing the profiles of ARGs and MGEs |
基于影响因子的冗余分析(redundancy analysis, RDA)和方差分解分析(variance partitioning analysis, VPA)来共同阐释抗生素抗性基因变化的影响因素和驱动机制(图 8).从图 8(a)可以看出, 湖泊沉积物(Sedt)的抗性基因与重金属关系密切, 其余4种土壤的抗性基因与沙漠细菌属(Pontibacter)、土壤红杆菌属(Solirubrobacter)和链霉菌属(Streptomyces)等紧密相关, 暗示着不同生境的微生物抗性基因赋存特征和驱动机制不尽相同.荒漠绿洲土壤抗生素抗性基因变化趋势(图 2、图 3和图 7)与微生物的多样性Chao1指数[图 4(a)]和土壤及沉积物含水率相同, 这与土壤干旱造成了土壤微生物多样性和关联性下降的结果相一致[24~27], 因此在干旱区的地理环境特征下, 微生物群落结构特征对土壤抗生素抗性基因的分布态势有重要影响[28].进一步的, 有研究认为微生物是土壤微生物抗性基因赋存的最重要因素[5, 18], 并且MGEs基因水平转移机制[29, 30]对于抗性基因在土壤中的增殖扩散也有促进作用, 这与本研究的结果一致[微生物群落和MGEs的解释率分别为40%和6%, 图 8(b)].此外, 重(类)金属元素对于土壤微生物压力选择作用[31, 32]也显著改变了抗生素抗性基因的变化和分布格局, 本研究中的荒漠绿洲农田土壤/沉积物中重(类)金属对抗性基因的变化的解释率达到了22%, 表明重(类)金属的压力选择对微生物抗生素抗性赋存和适应性进化有着重要的作用.同时, 重(类)金属元素的含量在这5种不同生境中也是显著增加(图 5), 需要继续深入研究干旱区农田土壤重(类)金属的来源、长期影响和潜在生态环境风险.
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图 8 抗性基因的影响因子RDA分析和抗性基因变化的解释率VPA分析 Fig. 8 Redundancy analysis and variance partitioning analysis for alterations of ARGs |
(1) 沙漠边缘往绿洲中心方向的荒漠沙生植物土壤(Dest)、棉花地土壤(Cotn)、玉米地土壤(Maiz)、芦苇地土壤(Reed)和湖泊沉积物(Sedt)中抗生素抗性基因的种类组成和丰度水平整体呈现了增加的趋势特征, 土壤是抗性基因重要的存储库; 基于土地利用类型变化的人类活动对荒漠绿洲土壤抗性基因造成了显著影响.
(2) 荒漠绿洲土壤微生物群落与抗生素抗性基因具有显著正相关的关系, 硫杆菌属(Thiobacillus)、沙漠细菌属(Pontibacter)、诺卡氏菌属(Nocardioides)、耐盐微杆菌属(Salinimicrobium)、土壤红杆菌属(Solirubrobacter)和链霉菌属(Streptomyces)等微生物是各类抗性基因重要的潜在携带者.
(3) 干旱区土壤中重(类)金属元素和MGEs, 与微生物群落共同影响和塑造了抗生素抗性基因的赋存分布特征, 基于这些影响因素单独或者共同的作用, 对抗性基因变化解释率达到了70%; 微生物群落是荒漠绿洲土壤抗性基因赋存变化的最主要驱动力.
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