2023, Vol. 44
2. 浙江大学环境与资源学院, 杭州 310058
2. College of Environment and Resources, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
近年来塑料制品的泛滥使用和低效处理为生态健康带来巨大压力[1]. 据报道, 2018年全球的塑料产量达到了3.59亿t, 到2050年这一数字将达到250亿t[2], 而海洋中塑料垃圾的数量将可能超过鱼类[3]. 微塑料(microplastics, MPs)是一类直径小于5 mm的塑料颗粒[4].作为全球关注的新兴污染物, 由于其体积小, 进入环境易被生物吞食积累, 穿过细胞膜、引起氧化应激、炎症或干扰脂质代谢[5~7]. 同时MPs常和环境中的重金属、有机污染物及致病菌共存, 改变其生物有效性及环境归趋, 进一步产生生物毒性效应[8~10]. 2015年, MPs被列为环境与生态科学领域亟待研究的第二大科学问题[11].
目前超过96%的MPs研究集中在海洋环境[12~14], 然而其中约80% MPs被认为是来源于陆域系统[15]. 河流尤其在入海口地区作为连接陆地和海洋的过渡地区, 是污染迁移转化及入海传输的重要渠道, 是受人类活动和物质运输影响的敏感区域[16]. 通过统计我国2010~2019年各地表水系的MPs研究, Zhang等[17]总结了我国河流湖泊的MPs丰度分别为3.9~7 900 n·m-3和340~8 900 n·m-3, 主要来源于城市活动、渔网渔具, 最终通过地表径流迁移至海洋.黄浦江西起淀山湖, 东至吴淞口, 是长江汇入东海前最后一条支流, 也是上海市内最大的河流[18].作为生活及工业用水的重要水源及具有航运、渔业、灌溉和旅游等综合功能, 黄浦江流域目前是MPs污染的“热点地区”[19, 20].目前调查显示长江入海口表层水中MPs丰度已达到4 137 n·m-3[21].此外近年来重金属在该流域的污染残留已被广泛报道. 李佳凡[22]发现7种重金属(Cu、Zn、Ni、Pb、Cr、As和Cd)在黄浦江表层水体中均有检出, 其中ρ(Zn)平均值最高, 达到92.69 μg·L-1, 而ρ(Cd)最低, 为0.048 μg·L-1.
值得关注的是, 微生物在金属污染的河道中具有适应和生存能力[23~26], 在重金属胁迫下导致金属抗性基因(metal resistance genes, MRGs)的出现, 揭示了微生物在环境条件下的生存策略[27], 并通过调控这些抗性基因来扩大其在金属污染环境下的生态位[28].含有MRGs污染的地表水在人类活动和水文气象等复合因素作用下发生一系列物化及生物过程, 并通过垂直及水平转移在细菌间扩散传播[29].然而, 黄浦江流域水环境中的MPs是否选择性富集MRGs从而改变抗性基因的结构及丰度并影响其传播依然是个未知数.另外, MPs所携带的可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs, 包括质粒、转座子、整合子、噬菌体和插入序列等)为抗性基因在微生物之间的水平基因转移提供基础[30, 31].MGEs作为传播MRGs的载体之一, 分析水体及MPs两种介质中MRGs和MGEs的综合分布, 考察二者的相关关系, 对了解抗性基因的演化和传播具有深远意义.
综上, 本文以上海市黄浦江为研究对象, 探索MPs及重金属在城市河流的污染分布特征并考察其与MRGs的相关关系, 以期为MPs的减排处理和金属及其抗性基因的污染管控提供科学依据, 并为城市地标水质的安全提供参考.
1 材料与方法 1.1 采样点布设及样品采集本研究于2021年10月共采集黄浦江10个站点的地表水及MPs样品(位置用编号S1~S10表示, 图 1).采样点从西向东依次为：浦江之首(S1)和鱼家村(S2)为人口较少的工业区及农业区; 韩湘水博园(S3)、北竹港(S4)和浦江第一湾公园(S5)为农业区及居民区; 龙耀滨江广场(S6)、外滩(S7)、金桥路渡口(S8)、共青森林公园(S9)和黄浦江入海口(S10)为人口密集的商业区及居民区.
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图 1 黄浦江采样点布设及MPs、ARGs和MGEs的丰度分布示意 Fig. 1 Distribution and abundance of MPs, ARGs, and MGEs in different sampling sites of Huangpu River |
在每个位点用不锈钢桶(10L, 连接5m长绳)采集20 L表层水样品(0~10 cm)转移到经超纯水清洗过的玻璃瓶中, 每个采样点处设置2组平行样, 完成采样后统一运回实验室, 并迅速置于冰箱中4℃保存, 用于分析水中的MRGs和MGEs以及其他理化指标.对于MPs样品, 在每个采样点使用不锈钢桶采集5 L水样, 使用50 μm孔径的筛网进行过滤, 用500 mL超纯水将筛网上截留的物质冲洗下来, 冲洗水转移至纯净的采样袋中保存, 每个点位采集两份冲洗水样品, 该水样用于确定MPs的材质并用于后续检测MPs表面的MRGs和MGEs.
1.2 水样理化性质与金属元素的测定水样的pH值使用便携式pH计(PHSJ-4F, 上海雷磁传感器科技有限公司)进行测定.溶解氧采用便携式溶解氧测定仪(OSDO-03, 北京欧仕科技有限公司)进行测定.总氮、总磷和COD均按照国标方法进行测定[(GB11894-89、(DB11893-89)和(GB11914-89)].TOC使用总有机碳-总氮分析仪(MultiN/C3100, 德国耶拿分析仪器股份公司)进行测定.水样经滤膜(Sartorius, 孔径0.22 μm, 直径φ 47 mm)过滤后使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS, Agilent 7500a, Agilent, Santa Clara, California)测定其中的Al、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Cd、Sn、Sb和Pb浓度, 校准曲线的范围(R=0.999 7)为0.05~10 mg·L-1.
1.3 微塑料的定性定量分析在冲洗液水样中加入30% H2O2溶液, 密封瓶口移入恒温振荡箱(TZH-82, 常州天瑞仪器有限公司), 设置条件60℃和120r·min-1, 振荡24 h进行消解. 后将水样抽滤到滤膜上(Sartorius, 孔径0.45 μm, 直径φ47 mm), 用体式显微镜(SC1400, 北京佳源科仪科技有限公司), 以40~200倍的放大率进行观察, 挑选出疑似MPs的颗粒, 粒径按照 < 0.05、0.05~0.1、0.1~0.5、0.5~1和1~5 mm分类; 形态按照纤维状、薄膜状、碎片状和颗粒状分类. 最后用傅里叶显微红外成像光谱仪(μ-FTIR, Nicolet iN 10 MX, Thermo Fisher, 美国)对挑选出可疑颗粒进行分析.在探测器光谱范围4 000~650 cm-1, 分辨率为8 cm-1的情况下, 对每个样品重复进行16次扫描, 获得的光谱图与标准谱图库进行相似度匹配(>70%以上被认定为MPs), 来确定聚合物类型.
1.4 基因组提取及生物信息学分析取5 L水样用于提取水中的DNA.水样经0.22μm滤膜(Sartorius, 孔径0.22 μm, 直径φ 47 mm)过滤后, 于-80℃保存后提取DNA.对于MPs表面的DNA检测, 直接从水中收集MPs颗粒, 使用50 μm目筛进行原位过滤.所有疑似的MPs颗粒, 在40~200倍放大的体视显微镜下观察, 使用消毒镊子取出, 放入50 mL离心管中进行后续DNA提取, 并对挑选使用的镊子进行冲洗, 冲洗水一并转移进离心管中, 于-80℃保存.
使用DNA快速提取试剂盒(E.Z.N.A.Ⓡ stoolDNA Kit, Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)从水样和MPs样品中提取微生物DNA.使用通用16S rRNA正向引物341F (CCTACGGG-NGGCWGCAG)和反向引物806R (GGACTACHVGGGTATCTAAT)进行扩增[32].在上海凌恩生物科技有限公司(上海, 中国)构建了宏基因组霰弹枪测序文库并对其进行了测序.对于每个样品, 用Covaris S220聚焦超声仪(Woburn, MA USA)将1 μg基因组DNA打碎, 并用长度约为450 bp的片段制备测序文库.所有样品均通过Illumina Novaseq 6000测序仪采用双端150bp(PE150)模式进行测序.原始测序数据使用Trimmomatic(http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic)进行质控[33].通过MegaHit[34](参数：-min-contig-len 500)软件对每个样本质控后的数据进行组装, 获得contigs.通过CD-HIT[35](参数：-n 9-c 0.95-G 0-M 0-d 0-aS 0.9-r 1)软件对组装的序列进行ORF预测, 获得特有基因集.每个簇的最长序列被认为是基因集中每个基因的代表性序列.为了计算总样本中的基因丰度, 使用了Salmon软件[36]来获得每个基因的reads数目.最后, 通过16S rRNA基因的数量来计算MRGs和MGEs的丰度并归一化, 每16S rRNA基因的拷贝数表示MRGs和MGEs的拷贝数[37], 使用以下公式计算基因丰度：
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(1) |
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(2) |
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(3) |
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(4) |
式中, Ab(S)为基因丰度; Ab(U)为单映射reads丰度; Ab(M)为多映射reads丰度; l为基因序列长度[38].
1.5 数据分析及可视化处理采用地理信息系统绘图软件(ArcGIS 10.6, ESRI, Redlands, California)绘制采样点及污染空间分布.采用SPSS 26.0描述统计分析水样理化性质、重金属含量及MPs丰度, 使用T检验和单因素方差分析(ANOVA)来比较不同介质(水样vs.MPs)和不同采样点之间MRGs和MGEs的丰度差异, 使用Spearman法进行相关性分析(P < 0.05表示显著相关).使用Gephi 9.1从MPs和水样中构建MRGs和MGEs的网络图(R>0.7, P < 0.01), 以分析MRGs和MGEs之间的潜在关系.
2 结果与讨论 2.1 水样理化性质和重金属赋存特征各采样点的水质参数及金属浓度见表 1, ANOVA检验显示各采样点之间的水质指标无显著差异.在所有分析的金属元素中, ρ(Sb)平均值最高, 为3.16 μg·L-1, 其次为ρ(Cu)(3.09 μg·L-1), 而ρ(Ni)和ρ(Cr)都较低, 分别为0.58 μg·L-1和0.16 μg·L-1, 其余元素的检出率都低于50%.Spearman相关性检验发现TN和TOC(P=-0.641, R=0.046)、铜和镍之间存在明显的负相关(P=-0.819, R=0.004), TP和TOC(P=0.698, R=0.025)、COD和Ni(P=0.634, R=0.049)、Cr和Ni(P=0.702, R=0.024)之间有显著的正相关.与先前研究相比, 2007年黄浦江上游饮用水源地水中ρ(Hg)和ρ(As)平均值为0.149 μg·L-1和2.74 μg·L-1, 其中工业区及入江口的水体中浓度较高[39].而更近的一次调查显示黄浦江水体中Pb污染最严重, 其次为Cu、Cr、As、Zn和Ni, 且呈现从上游到下游递增的趋势[40].
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表 1 各采样点的水质参数1) Table 1 Water quality parameters at each sampling stie |
2.2 微塑料的污染分布及形貌组成特征
如图 1所示, 在黄浦江10个采样点中均检出了MPs, 丰度范围为0.40~3.20n·L-1, 平均值为(1.78±0.84)n·L-1.MPs丰度与DO、TN、TP、COD和TOC等水质指标无显著相关性.采样点S7位于上海市中心, MPs丰度最高, 可能与附近密集的人类活动和较高的经济发展水平有关[41, 42].采样点S8~S10位于黄浦江的下游, MPs丰度明显高于上游, 这与韩国洛东江[43]、青藏高原河流[44]和中国广西漓江[45]的研究结果一致, 河流下游是MPs积累的“理想”场所.而采样点S1和S2也存在较高的MPs污染, 这与附近存在塑料制品工业园区有关.从形态特征上分析, 本研究检测到的MPs尺寸范围为43.5~5 765 μm, 其中100~500 μm的占比最大, 占总MPs的40.3%[图 2(a)].纤维是最常见的MPs形状, 平均占比达到93.2%, 其次为碎片(5.7%), 薄膜(0.70%)和球状(0.40%)[图 2(b)].而在颜色上, MPs颗粒中最常见的颜色是蓝色(41.1%)和透明(39.1%)[图 2(c)].根据μ-FTIR的结果, 共检测出11种聚合物, 其中聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene glycol terephthalate, PET)为主要贡献者, 占总丰度的62.5%, 其次为聚酰胺(polyamide, PA)(13.6%)(图 3).总体而言MPs的丰度和粒径与水体中重金属浓度间无显著相关性.
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图 2 MPs样品的形貌组成 Fig. 2 Morphology composition of MPs |
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(a)全部MPs的材质组成, (b)各采样点MPs的材质组成 图 3 MPs样品的聚合物材质组成 Fig. 3 Polymer composition of MPs |
与黄浦江及周边地区地表水研究相比, 苏州河、黄浦江和金泽水源地地表水中MPs丰度为(14.4±5.14), (26.2±9.63)和(28.3±4.09)n·L-1, 形态主要以纤维状、无色的小粒径(80~500 μm)的PET占比最高[46].上海崇明区的河道水样中, MPs的平均丰度分别为8.11n·L-1和5.17 n·L-1, 以纤维状为主, 尺寸集中在100~1 000 μm[47].淀山湖表层水调查中MPs丰度为(1.96±1.08)n·L-1, 其中纤维状、黑色的小粒径(＜500 μm)的PET占据主导地位[48].太浦河表层水MPs丰度(2.74±1.53)n·L-1显著高于底层水(1.65±1.02)n·L-1, 纺织工业区水域的MPs显著高于其他采样点, 表现出空间分布差异.同样的是, 纤维是最常见的MPs形态, 另外小粒径(100~500 μm)的透明PET是最主要的贡献者[49].
2.3 金属抗性基因在水体和MPs表面的丰度特征宏基因组结果显示在黄浦江的水样中共检出18类金属抗性基因(17类单金属抗性基因和1类多重金属抗性基因)以及268个亚型.如图 4(a)所示, 水中MRGs的相对丰度为1.68±0.21, 多重金属抗性基因(Multi_metals)是最主要的类型, 占总丰度的32.8%.在亚型层面, Hg抗性基因merR和多金属抗性基因ruvB(Cr-Te-Se)是主要贡献者, 分别占12.1%和8.3%.如图 5(a)所示, Cr与多金属抗性基因和MRG-Cr及对应亚型chrF和oscA之间均具有显著正相关.Cr通常以Cr6+和Cr3+价态在自然界存在, 细菌对Cr的抗性机制主要与Cr的还原反应及Cr的外排作用有关, 由质粒携带的chrA基因编码的膜转运体产生[50].对于多金属抗性基因, 其亚型czcA、czcB、cueA和arsB等与水中的Ni、Cr含量都存在显著正相关性.
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(a)MRGs总丰度, 黑点表示异常值, 计算数据时排除在外; (b)不同类型的MRGs的丰度, 红色圆点表示丰度在组间具有显著差异, P < 0.05; (c)基于Bray-Curtis距离矩阵的MRGs主坐标分析(PCoA) 图 4 水体和MPs表面MRGs的丰度及构成比较 Fig. 4 Comparison of the abundances and composition of MRGs between waters and MPs |
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(a)水样, (b)MPs表面; *表示P < 0.05, **表示P < 0.01; 色柱颜色深浅表示相关性强弱, 蓝色表示负相关, 红色表示正相关 图 5 MRGs及其亚型和水中重金属浓度的相关性热图 Fig. 5 Heat map of the correlations between types and subtypes of MRGs and heavy metal concentration |
在MPs表面共检测出18类MRGs和263个亚型, 有246种亚型与水样重合, 总体丰度为1.63±0.53.与水样相比, MPs选择性富集的MRG-Hg, 占总丰度的45.8%, 其次为多金属抗性基因(32.3%)[图 4(b)].在亚型层面, 与Hg抗性相关的merT-P是最大贡献者(40.1%), 其次为多重金属抗性基因copB(10.4%).通过比较水体与MPs表面相对丰度最高的20种MRGs亚型, 发现有10种为两种介质共有(ruvB、merR、sodB、pstB、copS、acn、copC、actP、arsH和copA).如图 5(b)显示, MRG-Ni的亚型nikR和hoxN与水中的Ni浓度呈现显著正相关.Ni具有中等毒性, 细菌对其的抗性主要基于RND家族的外排泵作用, 由cnr(Co、Ni)和ncc系统(Ni、Co、Cd)介导产生[51, 52].多金属抗性基因的亚型ctpC、cueA、czrA和kmtR等与水中的Ni、Cr、Sb含量都存在显著正相关性. 此外基于Bray-Curtis距离矩阵PCoA分析结果可知[图 4(c)], 水体和MPs表面的MRGs组成有明显区别.MPs选择性富集merT-P、copB、ziaA、sodA、dmeF, 相对丰度比水体中的高出7.1~132.6倍(图 6).海洋生态系统中也发现, 海水中的MPs可富集大部分MRGs, 是其潜在污染受纳体[53, 54].
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横坐标表示各个采样点水样和MPs的编号, 与采样点编号对应; 色柱颜色表示丰度高低, 由蓝色到红色表示丰度由低到高 图 6 各采样点水样中和MPs表面的MRGs主要亚型丰度 Fig. 6 Abundances of main subtypes of MRGs in waters and MPs |
水样及MPs表面的微生物群落存在较明显的差异.变形杆菌(Proteobacteria)和放线菌(Actinobacteria)是水体中的优势菌门, 占微生物总量的85.3%.在MPs表面, 拟杆菌(Bacteroidetes)占微生物总量的30.4%.其中Pseudomonas、Acidovorax和Limnohabitans是水中主要菌属, 而Bradyrhizobium、Mesorhizobium和Mycolicibacterium为MPs主要菌属.此外, Acidovorax和Limnohabitans是金属抗性基因merR的潜在宿主.基于北太平洋环流中MPs和海水微生物群落的宏基因组数据, Yang等[53]通过Procrustes分析抗性基因和细菌群落间的整体相关性发现, 微生物群落是ARGs组成谱的决定因素, 而MRGs不是.水平转移是抗性基因在环境介质和微生物中传播的重要渠道, MRGs通过可移动基因元件(MGEs)介导的水平基因转移(HGT)在环境介质及微生物间进行迁移传播[55].因此为了考察MRGs的迁移、传播和扩散, 进一步分析了MRGs与MGEs之间的关系.
水样中和MPs表面都检出5种MGEs, 水中MGEs的相对丰度为0.315~0.787[图 7(a)], 其中转座子(transpose)占比最大, 达到82.5%[图 7(b)].水样中检出101种亚型, 转座子tnpA和整合子intl1是主要贡献者, 占比74.8%和9.31%[图 7(c)].MPs表面MGEs的相对丰度为0.013 6~0.243[图 7(a)], 转座子仍是最主要的类型(55.7%), 但MPs表面选择性富集质粒(plasmid), 占比31.1%[图 7(b)].在MPs表面检出了82种亚型, 其中有73种与水样重合, 转座子tnpA和质粒rep7是主要贡献者, 分别占总丰度的53.7%和10.2%[图 7(c)].由图 8(a)和8(b)可知, MRGs和MGEs的亚型在数量间有显著正相关关系, 而相对丰度之间没有, 这表明MRGs可能是附着在特定的MGEs上而进行传播的, 与MGEs的丰度无关.普氏分析的结果显示[图 8(c)], 水体样品中MRGs和MGEs的组成相似, 但在MPs表面两者的结构差异较大, 且只有部分MRGs与MGEs之间存在较为紧密的联系.而不同采样点的MPs表面MRGs构成的较大差异, 更有可能导致以MPs为介质的MRGs的传播而带来的危害的更大不确定性.
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(a)MGEs总丰度, 黑点表示异常值, 计算时排除在外; (b)不同类型的MGEs的丰度, 红色圆点表示丰度在组间具有显著差异, P < 0.05; (c)各采样点水样中和MPs表面的MGEs主要亚型丰度, 横坐标表示各个采样点水样和MPs的编号, 与采样点编号对应; 色柱颜色表示丰度高低, 由蓝色到红色表示丰度由低到高 图 7 水体和MPs表面MGEs的丰度比较 Fig. 7 Comparison of the abundances of MGEs between waters and MPs |
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(a)亚型数量间的相关性分析, 直线表示相关性拟合曲线, 阴影区域表示置信区域; (b)总丰度间的相关性分析; (c)基于Bray-Curtis矩阵的普氏分析, 零线左侧的点表示水样中的MRGs和MGEs, 右侧的点表示MPs上的MRGs和MGEs, 相连的两点来自于同一采样点的样本 图 8 MRGs和MGEs间的相关性分析 Fig. 8 Correlation analysis between MRGs and MGEs |
进一步使用网络分析图对水中和MPs表面的MRGs与MGEs之间的关联性进行分析.在亚型水平上, 转座子tnpA_1和tnpA_2, 整合子qacEdelta及插入序列IS91分别关联了17、18、18和15种MRGs[图 9(a)].且上述的4种MGEs的亚型在水中的相对丰度都较高, 均与MRG-Multi_metals(actP、arsB、czcA、ruvB等)、MRG-Cr(chrF)、MRG-Cu(copC、copR、copS)、MRG-Fe(dpsA)、MRG-Hg(merE、merR、merP)和MRG-Pb(pbrA)显著正相关, 认为上述MRGs亚型在水环境中可以经由tnpA_1、tnpA_2、qacEdelta和 IS91实现水平基因转移, 使微生物产生对应金属的抗性.如图 9(b)所示, 在MPs表面, 插入序列的亚型IS91和ISRj1分别关联了14种MRGs的亚型, 主要都为Multi_metals和Cu的抗性基因亚型.但MPs表面选择性富集了质粒, 质粒的亚型IncFICFII、Rep7、rep7和rep13分别与9、9、8和8种MRGs的亚型显著相关, 且都与MRG-Multi_metals(copA、dmeF、golT)和MRG-Cu(copD、copR、copS、hmrR)显著相关, 可以推测, MPs的存在提供了有利于质粒介导的MRGs的水平基因转移的新生态位.
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(a)水样中; (b)MPs表面; 边缘表示相邻节点之间显著性的正相关关系(R>0.7, P < 0.01); 每个节点的大小与节点间显著相关性的数量成正比 图 9 亚型水平MRGs与MGEs之间的网络分析 Fig. 9 Network analysis between MRGs and MGEs at subtype level |
(1) 黄浦江表层水中锑的浓度平均值最高, 其次为铜、镍、铬, 其余元素检出率均低于50%.对照《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002), 均在正常浓度范围内, 并未发现重金属污染.
(2) 黄浦江流域中广泛存在MPs污染(100%被检出).MPs平均丰度为(1.78±0.84)n·L-1.PET是最主要的MPs聚合物类型, 占总丰度的62.5%.
(3) MPs选择性富集merT-P、copB、ziaA、sodA和dmeF等MRGs, 而MPs表面多种Multi_metals和铜的抗性基因亚型与质粒的亚型IncFICFII、Rep7、rep7和rep13之间均成正相关, 说明MPs的存在对由质粒介导的特定MRGs的水平基因转移有显著影响, 同时MGEs可能促进了MRGs在环境中的迁移、传播和扩散.
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