2023, Vol. 44
2. 西华师范大学环境科学与工程学院, 南充 637002
2. College of Environmental Science and Engineering, China West Normal University, Nanchong 637002, China
酸雨和氮沉降作为全球性环境问题, 已严重阻碍我国生态环境的发展.目前我国约一半的国土面积受到影响, 是世界第三大酸雨区及氮沉降集中分布区[1, 2], 伴随着工农业的迅速发展, 预测于“碳达峰前”其危害范围与程度将持续扩大.以长三角洲为核心的中东部地区是我国酸雨及氮沉降量较高的地方, 且两者含量均呈上升趋势[3, 4]. 2019年浙江省81.2%的城市出现酸雨, 降水的pH均值为5.13, 酸雨频率为57.1%[5], 我国东部地区平均氮沉降量已达50 kg·(hm2·a)-1[2].
森林生态系统是陆地生态系统的主体, 也是酸雨及氮沉降的直接承受者.其中, 土壤微生物是森林生态系统植物多样性和生产力的关键驱动因素.作为生态系统中最活跃的分解者, 微生物参与土壤各种生态过程, 驱动森林生态系统中C、N、P等营养要素迁移转化, 其功能多样性能反映出环境胁迫下森林土壤微生物群落的生态特征[6].土壤细菌是土壤微生物的重要类群之一, 也是环境变化最敏感的土壤微生物类群, 环境条件改变能够使土壤微生物群落结构及功能发生相应的变化[7], 进一步影响森林土壤呼吸以及森林生态系统碳循环过程[8, 9].因此, 开展酸雨和氮沉降对森林生态系统土壤微生物的影响研究, 能够更好的理解地下微生物群落对全球变化的响应.
马尾松(Masson pine)为松属高大乔木, 是国内重要乡土造林树种, 分布广泛且速生丰产, 具有较强的适应性, 在造纸工业、林业资源化和生态发展方面起到重要作用, 也是保持水土、涵养水源和绿化造林的先锋树种, 有研究表明马尾松对酸雨和氮沉降较为敏感, 其分布区域酸雨和氮沉降危害较为严重[10, 11].大量H+伴随酸雨输入造成森林土壤酸化, 抑制植物根系生物量, 影响土壤养分的循环, 破坏了森林生态系统稳定性[11].现今, 全球性氮沉降的程度逐年增加[12], 氮沉降在土壤酸化中扮演着越来越重要的角色[13].NH4+作为氮沉降的主要形式, 在土壤径流中通过硝化作用大部分转化为NO3－[14], 形成大量酸输入于土壤.有研究表明当氮沉降大于36 kg·(hm2·a)-1时, 大气中NH4+输入量显著上升, 促进了氮转化过程中的酸输入, 加剧了土壤酸化效应[15].目前, 有研究已经探讨了单一类型的酸雨或氮沉降对森林生态系统的影响, 但是针对酸雨和氮沉降共同作用对森林土壤微生物群落(尤其是细菌)方面的研究还鲜见报道.因此为了揭示酸雨和氮沉降共同作用下马尾松林地下生态过程的影响机制, 本文通过野外酸雨和氮沉降模拟试验, 以浙江省天目山国家级自然保护区马尾松林为研究对象, 利用高通量测序技术和生物信息学分析方法, 探究不同酸雨和氮沉降处理对天目山国家森林保护区马尾松林的土壤细菌群落组成及结构的影响, 并进一步分析土壤细菌群落多样性与环境因子的相互作用关系, 以期为天目山国家自然保护区资源管理提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 研究地区概况研究地位于浙江省杭州临安天目山国家级自然保护区(30°18′30″~30°21′37″N, 119°24′11″~119°27′11″E), 总面积为4 300 hm2, 属于中型野生植物类型自然保护区.海拔一般在300~1 500 m之间, 中亚热带向北亚热带过渡型气候, 最冷月气温2.6~3.4℃, 极端最低气温-20.2℃, 最热月气温19.2~28.1℃, 极端最高气温29.1~38.2℃.多年平均降雨量为1 400 mm, 多年平均无霜期209~235 d.保护区内林冠层的主要树种有青冈(Cyclobalanopsis glance)、木荷(Schima superba)和毛竹(phyllostachys edulis)等; 灌木层有毛花连蕊茶(Camellia fraternal)、山矾(Symplocos caudate)和山胡椒(Linder glauce)等; 草本层有菊科(Compositae)、禾本科(Gramineae)和鳞毛蕨科(Dryopteridaceae)等植物[16].
1.2 样地的设计与土壤样品的采集本试验于2017年3月在浙江省杭州临安天目山国家级自然保护区选取典型的马尾松林地带, 海拔350~500 m, 坡度20°~23°.在马尾松林地带沿水平扩张区域设置3块试验样地, 在每块样地内, 用厚0.6 cm、高50 cm的PVC板隔成3个5 m×5 m的样方, 各样方间距大于5 m, 分别清除样方内地表凋落物和其他杂草.同一试验样地中的3个样方分别对应4种不同的处理, 共计12块模拟试验样方.根据临安地区酸雨和氮沉降的现状以及其未来可能持续增加发展趋势, 设置: CK [pH=5.5, 为当地天然湖水pH值; 0kg·(hm2·a)-1]、T1 [pH=4.5, 约为当地自然降水pH; 30kg·(hm2·a)-1, 接近临安区近年来大气N沉降平均水平]、T2 [pH=3.5; 60 kg·(hm2·a)-1]和T3 [pH=2.5; 120 kg·(hm2·a)-1].使用0.5 mol·L-1 H2SO4和去离子水调配相应pH的模拟硫酸型酸雨, 将临安地区月均降雨量的2/3设定为模拟酸雨总量, 约占全年降雨量的5.55%[17].按照临安地区月均降雨量比分配每月模拟酸雨量, 喷施于相应样方地表.2017年3月至2021年3月, 每月喷洒3次, 每个季度模拟酸雨总量(比例)分别为：15.89 mm(21.46%)、29.26 mm(39.52%)、17.15 mm(23.16%)和11.74 mm(15.86%).以相应质量的NH4NO3晶体, 溶于去离子水, 以NH4NO3溶液喷施样方模拟氮沉降[18], T1、T2和T3处理喷施NH4NO3总质量分别为300 g [3 g·(m2·a)-1×(5 m×5 m)×4a]、600 g [6 g·(m2·a)-1×(5 m×5 m)×4a]和1 200 g [12 g·(m2·a)-1×(5 m×5 m)×4a], 将每个处理NH4NO3晶体的总量大致分为144等份, 每次将1份NH4NO3晶体颗粒溶于10 L去离子水中, 分别在模拟酸雨喷施0.5 h后, 将NH4NO3溶液均匀喷施于相应样方地表, 无施氮样方CK处喷洒等量去离子水.
利用5点采样法采集经过4种不同处理的土壤表层土壤样品0.2 kg, 共计60份土壤样品.再将各土壤样品分为两份, 一份用于检测土壤理化性质, 将其装入无菌自封袋, 保存于4℃恒温箱.另一份用于提取土壤细菌DNA, 将相同样方的土样混合均匀且过2 mm筛网后装入无菌自封袋, 保存于-80℃的干冰保温箱.
1.3 土壤理化性质的测定测定土壤pH值通过电位法测定(土水比=1∶2.5); 土壤全氮(TN)使用碳氮自动分析仪(Vario MAX CN, Elementar, 德国)测定; 土壤总有机碳(TOC)使用总有机碳分析仪(TOC-VCPH, SHIMADZ, 日本)测定; 采用高纯度去离子水对土壤样品浸提的方法, 取上清液过0.45 μm滤膜后使用TOC-VCPH对水溶性有机碳(DOC)进行测定; 碱解氮(AN)通过碱性水解扩散测定; 微生物量碳(MBC)和微生物量氮(MBN)通过氯仿熏蒸-K2SO4浸提法测定.
1.4 土壤细菌DNA提取与测序12个土样各取0.5 g, 采用ALFA-SEQ Advanced Soil DNA Kit试剂盒进行土壤细菌基因组DNA抽提, 用1% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及完整性, 用NanoDropOne检测DNA浓度.PCR扩增及产物电泳检测以基因组DNA为模板, 根据测序区域的选择, 使用带barcode的引物及PremixTaq进行PCR扩增.用GeneTools Analysis Software对PCR产物进行浓度对比, 按照等质量原则计算各样品所需体积, 将各PCR产物进行混合.使用E.Z.N.A.® GelExtractionKit凝胶回收试剂盒回收PCR混合产物, TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段.按照标准流程进行建库操作, 利用Illumina MiSeq PE300二代高通量测序平台进行高通量测序, 得到原始图像数据文件, 经碱基识别分析将其转化为原始测序序列, 以FASTQ文件格式存储.其中, 扩增引物为16S V4区引物(338F和806R)鉴定细菌多样性.
1.5 生物信息统计与分析利用fastp分别对双端的Raw Reads数据进行滑窗质量剪裁; 同时, 根据序列首尾两端的引物信息, 利用cutadapt软件去除引物, 得到质控后的paired-end Clean Reads.对于双端测序数据, 需根据PE reads间的overlap的关系, 用usearch -fastq_mergepairs过滤不符合的Tags, 获得原始拼接序列.通过fastp(an ultra-fast all-in-one FASTQpreprocessor, version 0.14.1, https://github.com/OpenGene/fast)对Raw Tags数据进行滑窗质量剪裁(-W 4-M 20), 得到有效的拼接片段(Clean Tags).
在97%相似度水平下, 使用USEARCH对序列进行OTU主成分分析, 以最小的序列数为标准进行样品序列数取整抽平.利用USEARCH-SINTAX(10.0.240)将每个OTU的代表序列与SILVA(16S)、RDP(16S)、Greengenes(16S)、SILVA(16S)和Unite(ITS)数据库进行比对获得物种注释信息[置信度阈值默认0.8以上, 默认数据库SILVA(16S)、SILVA (18S)和Unite(ITS)], 从而达到了解所有序列物种来源的目的.通过USEARCH-ALPHA_DIV(V10, http://www.drive5.com/usearch/)进行Chao1、Shannon和Simpson等多样性指数的计算.用R软件进行α多样性指数组间差异分析, 包括有参数检验和非参数检验.基于OTU丰度表, 使用R软件的vegan软件包根据bray curtis距离算法进行PCoA分析.利用LEfSe软件进行组间物种的差异显著分析, 在通过non-parametric factorial Kruskal-Wallis(KW)sum-rank test检测出不同分组间丰度差异显著的物种的基础上, 利用成组的Wilcoxon秩和检验来进行两两组间差异性判别, 最后用LDA来实现降维和评估差异显著物种的影响大小.土壤细菌相对丰度和α多样性与土壤生物及化学性质之间的相关性, 分别采用Spearman法和Pearson检验法.
2 结果与分析 2.1 不同处理土壤理化性质及微生物量的差异由表 1可见, 酸雨及氮沉降处理显著降低了土壤pH(P < 0.05), 与CK相比, T1、T2和T3中土壤pH显著降低, 分别下降了4.43%、12.06%和16.24%; 土壤总氮、总有机碳、可溶性有机碳和碱解氮含量随着酸雨和氮沉降处理的加剧呈增加的趋势, 表现为：T3>T2>T1>CK, 且差异显著(P < 0.05); 与之相反的是, 土壤碳氮比、微生物量碳和微生物量氮随着酸雨和氮沉降处理的加剧呈下降的趋势, 且在不同处理间差异显著(P < 0.05).
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表 1 不同处理对土壤理化性质和微生物量的影响1) Table 1 Effect of different treatments on soil physicochemical properties and microbial biomass |
2.2 不同处理土壤细菌DNA测序分析
由表 2可见, 12个土壤样品共检测出286 743条高质量序列(与原始序列相同), 碱基的平均长度为372.2 bp, 碱基G和C的数量总和占总的碱基数量的百分比为56.7%.以OTU数与抽样序列数构建稀释性曲线, 12个土壤细菌样品的稀释性曲线均趋于平坦(图 1), 增加测序数据几乎不产生新的OTU, 说明样品份数足够.
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表 2 土壤细菌测序数据统计 Table 2 Soil bacteria sequencing data statistics |
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相似水平为97% 图 1 不同处理条件下土壤细菌OTU的稀释曲线 Fig. 1 Rarefaction curves showing the OTU detection bacteria under different treatment conditions |
全部样地检测到18 802个OTU(图 2), 其中4种处理共有585个OTU数, 约占3.1%.4种处理土壤细菌OUT分布数目为：CK>T1>T2>T3.其中, CK处理中独有的土壤细菌OTU分布数目多达6 639个, 占全部OTU分布的35.3%, T3处理中独有的土壤细菌OTU分布数目最少共2 258个, 仅占全部OTU分布的12.0%, T1和T2处理中独有的土壤细菌OTU分布数目分别占全部OTU分布的21.5%和16.2%.
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百分数表示4种处理下独有或共有细菌OUT数占总OUT数(18 802)的比例 图 2 不同处理条件下土壤样品中独有和共有细菌OTU数量的文氏图 Fig. 2 Venn diagram showing the number of shared and exclusive OTUs of soil bacteria identified under different treatment conditions |
由表 3可见, 在97%分类水平下, 不同处理间马尾松林土壤细菌的Chao1指数和Shannon指数均差异显著(P < 0.05).CK处理中Simpson指数最小, Shannon指数和Chao1指数均最大, 说明CK处理中细菌多样性最大, 菌群丰富度最高.各处理土壤样品测序覆盖度最低为0.990, 说明该测序结果能真实反映马尾松林土壤样品细菌的情况.
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表 3 模拟酸雨和氮沉降处理下的土壤细菌α多样性指数1) Table 3 Soil bacterial α-diversity indexes under simulated acid rain and nitrogen deposition treatments |
2.4 不同处理土壤细菌群落组成及指示物种差异
在菌门水平上对土壤细菌OTU代表序列作分类学分析[图 3(a)], 12个土壤样品的土壤细菌分属36个已知菌门.相对丰度>1%的已知的菌门有4个, 分别为酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi).其中, 变形菌门和绿弯菌门在CK处理中相对丰度最高, 酸杆菌门和放线菌门在T3处理中最高.
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图 3 模拟酸雨和氮沉降处理下土壤细菌群落的结构柱状图和主成分分析 Fig. 3 Structure histogram of bacterial community and principal coordinate analysis under simulated acid and nitrogen deposition treatments |
根据β多样性距离矩阵进行主坐标分析[图 3(b)], 结果显示, CK处理的土壤细菌群落结构与其它处理之间差异较大, T3处理与T1和T2处理的土壤细菌群落结构也存在一定差异.采用ANOSIM和ADONIS组间差异检验表明, 不同处理土壤细菌群落结构差异显著(P < 0.05).
不同处理土壤细菌差异特征在属分类水平上作LEfSe分析表明(图 4), Flavobacterium、Nitrospira和Haliangium在CK处理具有显著优势, Candidatus_Koribacter和Bryobacter在T1处理具有显著优势, Occallatibacter、Acidipla、Singulisphaera和Pajaroellobacter在T2处理具有显著优势, Acidothermus在T3处理具有显著优势.
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1:δ-Proteobacteria, 2:α-Proteobacteria, 3:Micropepsales, 4:Acetobacterales, 5:Isosphaerales, 6:Nitrospirales, 7:Nitrospira, 8:Gemmatimonadales, 9:Gemmatimonadetes, 10:Ktedonobacterales, 11:Ktedonobacteria, 12:Flavobacteriales, 13:Cytophagales, 14:Frankiales, 15:Actinobacteria, 16:Blastocatellia_Subgroup_4; LDA阈值>4.0 图 4 模拟酸雨和氮沉降处理下土壤细菌属水平LEfSe分析 Fig. 4 LEfSe analysis of genus level of soil bacteria under simulated acid and nitrogen deposition treatments |
土壤环境因子与土壤细菌α多样性相关性分析表明(表 4), Chao1指数与土壤pH显著正相关(P < 0.01), 与土壤总氮和碱解氮显著负相关(P < 0.05); Shannon指数与土壤pH和碳氮比显著正相关(P < 0.05), 与土壤总氮和碱解氮显著负相关(P < 0.05); Simpson指数与土壤pH和碳氮比显著负相关(P < 0.05), 与土壤总氮和碱解氮显著正相关(P < 0.05).
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表 4 土壤细菌群落α多样性指数与土壤环境因子的相关性分析1) Table 4 Correlation coefficients between soil bacterial community α-diversity indices and soil environmental factors |
为分析造成马尾松林土壤细菌群落变化的关键影响因子, 进一步对土壤细菌群落结构与土壤环境因子进行冗余分析(图 5), 第一轴的解释变异量为63.42%, 第二轴累积解释变异量为23.58%, 两轴累积解释变异量达87.00%.Mantel检验结果表明, 土壤pH(R2=0.73, P=0.032)和总氮(R2=0.78, P=0.025)是影响细菌群落变化的关键影响因子.
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红箭头线表示土壤环境因子, 绿线箭头表示细菌菌门 图 5 土壤细菌群落结构特征对环境因素响应的冗余分析 Fig. 5 RDA of both soil bacteria community and environmental factors |
土壤是酸雨和氮沉降的最终受体, 持续的酸雨和氮沉降的输入改变土壤环境因子, 进而影响土壤微生物活动[19, 20].本研究连续4 a的模拟试验发现, 土壤pH随着酸雨和氮输入量的增加而降低.与本研究的结果相类似, Koptsik等[21]在俄罗斯北部森林的酸沉降试验, 李宗明等[15]在温带草原的7 a施氮的试验中均发现土壤pH显著下降.分析原因可能是吸附在土粒表面的氢离子与矿物晶格表面的铝反应, 导致土壤pH下降[22]; 另外, NH4+的硝化和淋溶作用皆会降低土壤pH.全氮和碱解氮含量在酸雨和氮输入后明显增加, 其原因是酸雨淋溶后, 土壤中非水解性有机态氮水解为有效态氮, 从而使土壤氮含量增加, 这与张新明等[23]的研究结果一致; 另外, 本试验选择氮源为NH4NO3、NH4+和NO3－进入土壤, 增加了氮含量.土壤微生物量在酸雨和施氮后显著降低, 土壤酸化在一定程度上抑制细菌群落的生长, 使得可利用的土壤有机碳减少, 降低土壤微生物量.因此酸雨和氮沉降造成的土壤酸化很可能是调控土壤微生物量的主要因素, 这与已有的研究结果相同[24, 25].随着酸雨和外源氮输入量的增加, 马尾松林土壤有机碳和溶解性有机碳含量呈现逐渐增加趋势, 酸雨和氮沉降降低土壤微生物生物量, 进而降低对土壤有机碳的矿化作用[26, 27], 这与Frey等[28]的研究结果一致.
3.2 不同酸雨和氮输入处理下土壤细菌群落多样性分析土壤细菌α多样性指数是评价土壤细菌群落多样性的重要指标, 探究林地土壤细菌群落多样性可以反映生态系统对干扰的响应[29].酸雨和外源性氮输入后, 细菌群落的Chao1指数和Shannon指数均显著下降(P < 0.05), 这可能是因为土壤大部分细菌种群不能快速适应环境变化而死亡, 导致细菌群落的多样性和丰富度下降, 这与Wang等[30]的研究结果类似.曾清苹等[25]的研究也发现随着氮沉降的增加, 缙云山马尾松林土壤微生物均匀度指数与多样性指数降低, 说明氮沉降减低了细菌群落的丰富度.王晓彤等[31]的研究发现, 模拟酸雨改变了稻田土壤细菌的丰度, 原因可能是酸雨的胁迫抑制细菌种群的生长, 从而降低了细菌多样性.
土壤细菌群落结构是影响土壤细菌群落生态功能的关键因素之一, 模拟酸雨和氮沉降不仅影响了土壤细菌群落的多样性, 也使得土壤细菌群落结构产生差异.酸雨和氮输入4 a后, 不同处理土壤细菌优势门类为酸杆菌门、变形菌门、放线菌门和绿弯菌门.刘坤和等[32]在嘉陵江滨岸带分析自然林地、农业用地和湿地土壤细菌群落结构差异, 发现主要优势菌群为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门这4个门类, 与本研究的结果一致.有研究表明, 不同植被土壤中优势群落是酸杆菌门、变形菌门和放线菌门细菌[33, 34], 这主要是由于变形菌门、酸杆菌门和放线菌门细菌的生态幅较宽, 并且面对不同环境具有较强的适应性, 因此受环境影响较小[35].但4种优势菌门在丰度上有着一定的差异, 酸雨和外源性氮输入可直接或间接影响土壤理化性质, 而土壤理化性质的改变势必影响到微生物群落结构组成[36].Wang等[30]的研究发现, 随着氮有效性的增加, 共营养的类群, 变形菌门丰度会增加.在本研究中, 随着酸雨和外源性氮输入的增加, 土壤变形菌门丰度会下降, 这可能是由于土壤氮含量已经过饱和, 抑制土壤养分的供给, 导致变形菌门细菌丰度下降.有研究发现酸杆菌门细菌在不同pH土壤中相对丰度不同, 在酸性土壤中具有较高的丰度[37].这与本研究有相通之处, 酸杆菌门属于嗜酸性细菌, 随着土壤pH下降, 酸杆菌门的相对丰度逐渐增加[38], 酸性环境改变竞争结果, 对某些类群施加了显著选择压力, 这些类群可能比嗜酸菌耐受性差.
在属分类水平上, 酸雨和外源性氮输入导致土壤优势菌属发生变化, 其中土壤细菌优势属中Haliangium属丰度降低; Bryobacter和Candidatus_Solibacter属等有先增后减的趋势; Acidothermus属丰度增加. Haliangium属属于变形菌门, 是氮循环的参与者, 与土壤pH具有显著正相关性[39]. Bryobacter和Candidatus_Solibacter属属于酸杆菌门, 能够分解有机质, 促进碳循环[40]. Acidothermus属是利用碳源的细菌属, 与土壤有机碳含量呈正相关关系[35].据本研究分析表明, Acidothermus属在T3处理中相对丰度较高, 说明酸雨和氮输入增加了土壤有机碳含量, 为Acidothermus属创造了一个丰富的碳源环境.由此推断酸雨和外源性氮输入导致微生物碳氮循环功能改变.在门和属分类水平上, 4种不同处理土壤细菌组成具有相似性, 但其菌门和属的相对丰度有所不同, 这可能和土壤环境不同有关, 进而使细菌群落结构发生变化[41].
3.3 不同酸雨和氮输入处理下土壤环境因子与细菌的关系细菌群落的变化对地下环境条件变化十分敏感, 酸雨及氮输入通过改变土壤环境因子制约土壤细菌群落的多样性, 改变土壤生态系统物质循环和能量流动[42].Zeng等[43]研究黄土高原不同生态系统土壤性质对土壤微生物群落组成的影响, 发现变形菌门、酸杆菌门的相对丰度与土壤pH呈现显著相关.Tian等[44]的研究指出森林生态系统土壤pH是影响土壤微生物群落的关键因素.本研究中, Chao1指数和Shannon指数与土壤pH显著正相关(P < 0.01), 这表明土壤pH是马尾松林土壤细菌群落的关键限制因子, 酸雨和氮输入对土壤pH的影响, 导致细菌种群的丰富度和多样性发生了改变.Liu等[45]的研究表明, 卧龙保护区土壤全氮与土壤细菌群落密切相关.Shi等[46]的研究发现增加森林土壤中氮素含量会提高酸杆菌门的多样性.本研究可以看出土壤细菌群落多样性与土壤总氮的变化密切相关, 这与笔者以前研究的土壤细菌群落多样性的影响因素基本一致[38].此外, 不同处理土壤细菌多样性与碳氮比等土壤理化指标具有显著相关性, 这和费裕翀等[47]的研究认为碳氮比与土壤细菌群落结构具有一定的相关性的结果有相同之处, 表明土壤理化性质调控着微生物多样性.
4 结论模拟酸雨和氮沉降通过影响土壤理化性质和微生物量, 改变土壤微生物群落结构.酸雨和氮输入显著增加酸杆菌门和放线菌门的相对丰度, 降低了变形菌门和绿弯菌门的相对丰度, 同时显著增加Acidothermus属的相对丰度, 降低Haliangium属的相对丰度.土壤pH和全氮是驱动土壤微生物群落变化的主要因子.因此探讨酸雨和外源性氮输入下土壤微生物群落变化的影响机制, 对维持天目山土壤生态平衡和生态系统保护具有重要的研究价值.
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