2023, Vol. 44
2. 北京大学环境科学与工程学院, 北京 100871;
3. 中国南水北调集团中线有限公司, 北京 100038
2. College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871, China;
3. Middle Route of China South-to-North Water Diversion Group, Beijing 100038, China
随着城市化和工业化的快速发展, 大量含有毒重金属的工业废水排放到环境中, 对生态环境和人类健康构成了严重威胁[1].微生物是生态系统中多样性最丰富和分布最广泛的生命形式之一, 在物质循环和能量运输中发挥着关键作用, 是生态系统中生物化学循环的重要驱动力之一[2].外界环境干扰会显著影响微生物群落结构的变化, 甚至改变整个生态系统的物质循环和能量流动过程[3].不同生境中微生物的组成、多样性和对环境的响应始终是微生物生态学与环境学研究的重点.有研究表明, 长期累积的重金属污染, 由于其固有的毒性和生物累积性, 会严重危害微生物群落的组成结构和代谢功能[4].例如, Cu、Zn和Cd等重金属污染使鄱阳湖表层水体中的部分微生物生长受到抑制, 降低了微生物群落的多样性[5]; Cd、Cu和As等重金属污染会导致土壤微生物群落的整体丰度下降但重金属耐受菌的丰度增加, 过量重金属会抑制微生物的基质代谢和呼吸活动[6]; Cr、Pb和Zn污染的黄金峡沉积物中, 重金属含量与硝化菌、拟杆菌和疣微菌的丰度呈现出显著的负相关关系, 但绿弯菌的生长可能得到了促进[7].然而, 目前的研究主要集中在单一类型生境如污水[8, 9]、地下水[10, 11]、地表水[12]、土壤[13, 14]和沉积物[15]等, 鲜见研究同步调查重金属污染对不同生境中微生物群落结构的影响.
白洋淀是华北平原最大的以植物为主的淡水湿地, 在洪水储备和维持生态平衡等方面发挥重要作用[16].唐河污水库位于白洋淀上游, 用于储存和管理来自保定市和附近村庄的工业和城市废水, 是白洋淀淡水湿地的最后一道防线[17].有研究表明, 工业污染等外源输入导致污水库的沉积物环境已被Fe、As、Zn和Cu等多种重金属污染[18], 这些污染物可能会通过地表径流进入白洋淀, 从而严重影响白洋淀的生态安全[19].更重要的是, 长期的重金属污染对表层水和周边地下水的生态环境以及微生物结构的影响, 目前仍不清楚.鉴于此, 同步调查重金属污染对唐河污水库“地表水-沉积物-地下水”这3种栖息地中微生物的影响, 是深入揭示唐河污水库中重金属污染危害的关键.
本研究将基于16S rRNA高通量测序方法, 调查唐河污水库的“地表水-沉积物-地下水”这3种生境中的微生物群落结构特征, 进一步明确不同生境中微生物群落结构的驱动因素, 揭示污水库重金属污染对不同生境的影响, 以期为唐河污水库生态修复和白洋淀生态系统的可持续发展提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 样点布设及样品采集研究区域位于河北省保定市的唐河污水库(38°47′43″~38°47′52″N, 115°40′11″~115°42′22″E), 采样面积约0.75 km2, 该区域属温带大陆性季风气候, 多年平均气温约13℃, 年平均降雨量约为513.6 mm, 年平均蒸发量约为1 773.40 mm[20].本研究于2018年11月共设置5个采样点, 分别采集了沉积物、地表水和地下水样品(图 1).
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图 1 采样点位置分布示意 Fig. 1 Distribution of sampling sites |
每个站点使用无菌PET瓶收集10 L的水进行水样的采集; 同时, 在同一站点使用采泥器采集水体之下对应的表层沉积物样品, 用PE自封袋和50 mL无菌离心管进行密封保存; 此外, 在站点周边深度20 m左右的浅层含水层新建监测井同步采集了地下水样本.所有采集的样品分为两份, 一份用于微生物的分子生物学鉴定, 另一份用于环境指标分析.将用于分子生物学鉴定的样品保存在-80℃冷冻, 将用于环境指标分析的样品在4℃左右保存.
对所有样品均测定了其环境指标, 包括理化指标和重金属含量.具体地, 在采样现场, 使用YSI-85水质分析仪(YSI, USA)测定pH, 同时, 参照之前的研究方法和相关的标准[21], 在实验室测定总氮(total nitrogen, TN)(HJ 636-2012)、总磷(total phosphorous, TP)(HJ 632-2011)、氨氮(ammonia nitrogen, NH4+-N)(HJ 535-2009)和硝氮(nitrate nitrogen, NO3--N)(GB/T 7480-1987)等理化指标.此外, 参照相关的测定标准(HJ 677-2013, HJ 680-2013, HJ 766-2015), 测定样品中铁(Fe)、铬(Cr)、砷(As)、铜(Cu)、锌(Zn)和锂(Li)等重金属元素的含量[22].
1.2 DNA提取、PCR扩增和Illumina MiSeq测序对于所有环境样品, 使用FastDNA® SPIN土壤试剂盒(MP Biomedicals, USA)分别提取环境DNA, 具体过程根据说明书进行操作.采用细菌的通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增16S rRNA基因的V3-V4区[23].扩增产物使用AxyPrepDNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences, USA)从2%的琼脂糖凝胶中纯化, 并用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega, USA)进行定量检测, 纯化后的产物按等比例混合.同时, 本研究使用无菌水代替DNA开展了3个阴性对照实验, 以监测DNA提取和PCR扩增过程中可能出现的任何污染, 为后续Illumina MiSeq测序数据的真实性和准确性提供保证.最终, 质检合格的扩增产物采用Illumina MiSeq PE250平台进行测序, 测序结束后, 使用Trimmomatic和VSEARCH软件对原始FASTQ序列进行质控[24, 25], 高质量的序列使用VSEARCH软件按照97%的相似度阈值进行OTUs(operational taxonomic units)聚类, 并对OTU序列参考Silva 16S rRNA数据库进行物种注释[26].
1.3 统计学分析利用Mothur软件计算各样品中微生物的α多样性, 包括Chao1、Shannon-Wiener和Coverage指数.采用非度量多维尺度分析(NMDS), 基于Bray-Curtis距离, 对样本间的beta多样性差异进行可视化分析, 进一步使用相似性分析(ANOSIM)来检验分组间微生物群落的差异, NMDS和ANOSIM均使用R软件的vegan工具包完成.同时, 使用circlize工具包对门水平上的微生物群落组成进行可视化.使用线性判别分析效应(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)分析识别微生物群落在3种生境的生物标记物(biomarker), 以LDA判别阈值(LDA得分)大于4, 且P值小于0.05为标准进行筛选.
使用Excel 2021对环境变量进行整理, 为优化分析, 利用PRIMER & PERMANOVA+6.0软件对每个环境变量进行标准化, 使其平均值为0, 标准差为1[27].利用SPSS 26.0软件通过Kruskal-Wallis检验分析环境变量在不同生境的差异, 显著性水平的参数选取0.05.探究微生物群落与环境变量的关系时, 为避免共线性的问题, 首先通过VIF方差膨胀因子分析将自相关性较高(VIF>10)的环境变量(包括理化指标和重金属指标进行剔除), 随后利用vegan工具包进行典范对应分析(canonical correspondence analysis, CCA)进一步判断环境变量对微生物群落的影响.采用SPSS 26.0软件计算微生物属与环境变量之间的spearman相关性, 并使用R软件的pheatmap工具包绘制热图进行可视化.
2 结果与分析 2.1 微生物群落多样性在唐河污水库的5个站点, 同步研究了地表水、沉积物和地下水中的微生物群落.利用Illumina 16S rRNA高通量测序技术, 对15个微生物样本进行测序, 共产生了2 109 119条序列, 所有样本的覆盖率(coverage)为0.971±0.012, 表明在当前测序深度下可以很好地揭示细菌群落的绝大部分物种.对所有高质量的序列进行聚类后, 此次调查共得到5 108个OTUs.如图 2(a)所示, 地表水、沉积物和地下水分别含2 645、3 020和4 213个OTUs, 3组样本共有的OTUs有1 577, 而地下水有1 264个特有的OTUs, 远远超过地表水(170)和沉积物(451)中特有的OTUs数量.
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图 2 不同生境中微生物群落的OTUs数量和α多样性 Fig. 2 OTUs number and αdiversity of microbial communities in different habitats |
如图 2(b)所示, 不同样本中微生物群落的α多样性具有显著差异.地下水样本的微生物丰富度和多样性(Chao1：2 952.84±712.95, Shannon：8.37±1.59)远高于地表水中的微生物丰富度和多样性(Chao1：2 099.87±386.21, Shannon：5.37±1.01)和沉积物中的微生物丰富度和多样性(Chao1：2 410.78±155.61, Shannon：7.65±0.29).基于非度量多维尺度分析(NMDS)和相似性分析(ANOSIM), 发现3种生境中微生物群落组成存在显著差异(R=0.96, P=0.001, 图 3).
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图 3 不同生境中微生物群落OTU水平的β多样性和相似性分析检验 Fig. 3 The β diversity of microbial communities at the OTU level in different habitats and analysis of similarity statistics |
对所有OTUs进行注释, 共鉴定出微生物1 102属, 隶属于50门、105纲、173目和346科.如图 4所示, 在门水平上, 不同生境中微生物群落的优势菌组成存在一定差异.地表水微生物中优势门为变形菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)和放线菌(Actinobacteria), 分别占总丰度的38.88%、34.84%和10.71%; 沉积物样本微生物以绿弯菌(Chloroflexi)为主, 相对丰度占比高达41.02%, 变形菌和厚壁菌(Firmicutes)也占据一定优势, 占比分别为16.49%和9.04%; 地下水样本微生物群落中以变形菌(44.89%)、放线菌(15.54%)和厚壁菌(7.34%)为优势菌门.
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图 4 不同生境中微生物门水平的物种组成 Fig. 4 Composition of microbial communities at the phylum level in different habitats |
在属水平上, 3个生境中的微生物群落差异也很明显.LEfSe分析共鉴定出21个细菌生物标记物, 地表水、沉积物和地下水样本中分别识别出8、10和3个生物标记物(图 5).不同生境中的生物标记物有较明显的差异, 地表水中的标志性物种为Pedobacter(11.66%)、噬氢菌属(Hydrogenophaga, 10.3%)、黄杆菌属(Flavobacterium, 8.15%)和噬冷菌(Algoriphagus, 6.56%); 除Hydrogenophaga属于变形菌外, Pedobacter、Flavobacterium和Algoriphagus均为拟杆菌.沉积物中Ornatilinea、长绳菌属(Longilinea)、Thermomarinilinea和Bellilinea分别占10.61%、7.51%、7.42%和4.91%, 均隶属于绿弯菌.而地下水的3种指示物种为节杆菌属(Arthrobacter, 4.06%)、披毛菌属(Gallionella, 3.79%)和丝硫菌属(Thiothrix, 2.49%); Arthrobacter隶属于放线菌, Gallionella和Thiothrix均为变形菌.
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图 5 不同生境中微生物属水平的组成和丰度差异 Fig. 5 Differences in composition and abundance of microbial genera among different habitats |
不同生境中监测的理化指标和金属指标数值, 具体如表 1和表 2所示.进一步使用Kruskal-Wallis进行检验分析, 结果显示, 所有的环境变量, 包括pH、TP、TN、NH4+-N、NO3--N、Fe、Cr、As、Cu、Zn和Li, 在不同生境下均具有显著差异(P＜0.05).
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表 1 不同生境的理化指标1) Table 1 Physicochemical parameters of different habitats |
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表 2 不同生境的重金属含量1) Table 2 Metal contents in different habitats |
如图 6所示, 剔除共线性强的环境变量后, CCA分析揭示了理化指标和重金属指标对不同生境中OTU水平微生物群落结构的影响.环境变量对微生物群落的总解释量为54.91%, 显著影响3种微生物群落结构的环境变量依次为pH(R2=0.88, P=0.001)、Fe(R2=0.83, P=0.001)、TP(R2=0.77, P=0.001)、NO3--N(R2=0.58, P=0.002)和NH4+-N(R2=0.43, P=0.002).
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图 6 CCA分析揭示环境因子对OTU水平微生物群落结构的影响 Fig. 6 CCAanalysisrevealingthe effects ofenvironmental factorson microbialcommunitiesatthe OTU level |
此外, 基于Spearman分析的热图显示, 不同生境中的微生物标志物对理化因子和重金属含量的响应截然不同(图 7).地表水中绝大多数微生物标志属仅与pH、NO3--N和Li呈现显著正相关关系; 沉积物中的微生物标志属丰度与TP和NH4+-N等理化因子及Cr、Fe、Cu和Zn等重金属含量存在显著正相关性; 地下水中除pH和NO3--N外, 微生物标志属与其他理化因子和重金属含量均呈现负相关关系.具体地, 地表水中Flavobacterium和Algoriphagus等标志属对Li表现出一定的重金属耐受性, 可能偏好在较高的NO3--N浓度下生存; 沉积物微生物组成多以重金属耐受菌为主, 如Pelolinea、Leptolinea和Ornatilinea能在被多种重金属污染的环境中生存, 具有很强的适应性; 而地下水优势属与多种重金属含量呈现负相关, 可能多为重金属敏感菌.
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*表示P＜0.05; **表示P＜0.01 图 7 地表水、沉积物和地下水的微生物标记属与环境因子的相关性热图 Fig. 7 Heatmap displayingthe correlations between microbial indicator genera and environmental factors insurface water, sediment, and groundwater |
多样性是微生物群落稳定性的重要指标之一, 高多样性意味着生态系统的稳定性以及微生物群落功能的健全性[28].有研究表明[29], 地下水环境相比于其他生态环境微生物种群数量规模小、活性水平低且环境条件稳定, 但本研究中地下水微生物群落的丰富度和多样性显著高于沉积物和地表水环境.导致这一结果的原因可能是由于地下水环境与地表污染物质交换较少, 与此不同的是, 地表水和沉积物与外界交互作用强烈, 易受外源污染物干扰如重金属污染等因素的影响, 从而降低了沉积物微生物群落多样性[30, 31].过量重金属会对微生物降解和细胞代谢等功能产生严重影响, 从而迫使微生物多样性下降[32].其他研究也表明, 微生物多样性与重金属含量呈负相关, 低污染河流中的微生物群落具有更高的α多样性[33].此外, 沉积物比地表水拥有更丰富的微生物群落, 这可能由于沉积物中积累的丰富有机物可以为微生物提供充足的碳源并促进微生物在沉积环境中更好地生存[34, 35].
3.2 不同生境微生物群落组成差异由于地表水、沉积物和地下水三者的生态环境差异, 不同生境中的优势微生物和特有微生物也具有显著差异.在门水平, 变形菌是地表水和地下水中最主要的微生物.这是因为变形菌属于水体环境中常见的优势菌群[30, 36].但本研究中地表水和地下水在次级优势菌门上存在差异, 拟杆菌是地表水中的次级优势菌门, 其相对丰度接近变形菌门, 而地下水中放线菌门和厚壁菌门占据一定优势.有研究表明被Zn、Cu和Cd等重金属污染的河流水体中微生物群落组成会随水质恶化而转变, 污染严重的区域中拟杆菌门会呈现更高的相对丰度, 而变形菌门的生物降解和新陈代谢会被污染物抑制[37].地下水环境由于其氧气含量低、还原条件更显著, 因此厌氧的厚壁菌门和放线菌门相对丰度会普遍升高[38].有研究发现高As污染的沉积物和地下水中, 地下水始终呈现出较低的多样性[31], 而本研究中的地下水受到的人为污染较轻, 导致其表现出来较高的微生物多样性.在属水平上, 地表水中的标志属如Pedobacter、Flavobacterium和Hydrogenophaga等对重金属污染的水体具有一定的适应性, 可能是潜在的重金属耐受菌[39]; 而地下水仅有硝酸盐还原功能菌Gallionella[40]、硫氧化菌Thiothrix[41]和固氮菌Arthrobacter[42]这3种功能各不相同的微生物标志属, 表明地下水生态系统受重金属污染的影响较小.
而对于沉积物, 微生物群落以绿弯菌门为主, 丰度远高于第二优势菌——变形菌.这可能与沉积物中重金属污染物的积累有关, 早期研究也发现沉积物中重金属污染物的增加可能导致绿弯菌门丰度的升高[43].此外, Subsidy-Stress理论指出耐受性物种的丰度会随着敏感性物种的减少而增加[44, 45], 可以认为, 绿弯菌门对沉积物中的重金属有很强的抵抗力, 而变形菌门对重金属的抵抗力较差.兼性厌氧的绿弯菌有光能自养、光能异养和化能自养等多样的营养方式, 能够较好地适应重金属污染的环境[46].同时, 绿弯菌可以高度适应极端环境, 在受污染的沉积物环境中, 绿弯菌能够在维持微生物群落结构稳定方面发挥重要作用[47].属水平上, 沉积物中存在着丰度更高的重金属耐受菌如Leptolinea和Longilinea等[48], 这可能表明重金属污染导致沉积物微生物群落进化出适应机制以更好地生存.
3.3 环境因子对微生物群落结构的影响生态系统的环境条件如pH值、营养物浓度和重金属含量, 会显著影响微生物群落的组成结构和物种多样性[49, 50].生态系统中微生物会和重金属之间发生协同作用或拮抗作用, 因此不同物种可能以不同的方式来应对重金属污染, 表明了微生物群落对重金属污染的多样化响应策略[51, 52].在本研究中, 3种生境中的微生物群落对重金属污染表现出了不同的响应特征, 尽管理化因素和重金属变量共同驱动该区域的微生物生长, 但重金属污染主要影响了沉积物微生物群落结构, 其次为地表水和地下水.
地表水微生物与pH和NO3--N表现出显著的相关性, 与Li等重金属呈现弱正相关.环境pH值是影响微生物生长的主要控制因素[53], 同时, pH值能够介导重金属迁移率和生物利用度的理化性质, 溶液中的重金属离子随着pH的增加发生水解, 从而可以部分减轻重金属对微生物的毒性[53].地表水中的微生物标志属喜好碱性环境, 且多为硝化和反硝化功能菌, 如Flavobacterium在异养硝化和代谢难降解有机化合物中发挥作用[54], Arcobacter菌可将氨基酸和有机酸作为碳源, 可使硝酸盐还原为亚硝酸盐, Hydrogenophaga菌能利用硝酸盐厌氧呼吸, 起反硝化作用, 但较少利用碳水化合物[55].Li是生物体必需的微量元素, 过量Li的毒性并不明显, 有实验表明Pseudomonas菌具有一定的Li吸附能力[56], Flavobacterium能够在富Li的极端环境中生存[57].地表水微生物与其他重金属的负相关, 可能暗示了重金属污染对这些微生物活性的负面影响[58].因此, 地表水生物多样性的降低, 可能反映了被多种重金属污染的地表水中微生物群落具有较低的完整性, 甚至造成了一定程度的生态功能损失.
在沉积物生境中, TP、NH4+-N、Cr、Fe、Cu和Zn等是影响微生物群落结构的主要环境因子.氮磷等营养物质浓度变化会影响部分微生物生长进而改变其群落结构[59, 60].Zhang等[61]对博斯腾湖的沉积物微生物进行研究, 表明TP与微生物生长和繁殖相关, 是微生物多样性的重要贡献者.本研究中, Ornatilinea和Thermomarinilinea等微生物标志属是典型的有机物降解菌[55], 因此其丰度与营养物质呈显著的正相关关系.与地表水和地下水相比, 沉积物中的重金属耐受菌数量更高, 这可能是由于沉积物中重金属的长期积累过程.有研究表明, 长期的重金属污染胁迫会改变微生物群落结构组成, 导致重金属耐受性细菌相对数量和种类增加, 并逐渐成为重金属污染环境中的优势种群[62, 63].从图 7中, 可明显看出, 沉积物中的多种重金属污染与重金属耐受微生物显著正相关, 不同的优势属均表现出一定的重金属耐受性.例如, 沉积物中Leptolinea和Longilinea等指示菌属, 被报道可以适应重金属污染或有机污染, 并可能有助于重金属的去除[48], 表明这些重金属含量的增加可能有利于这些耐受菌群的生长, 从而促进了沉积物中微生物群落对重金属污染的适应性.
地下水微生物群落与大部分的重金属含量及TP、NH4+-N和TN呈负相关, 仅与pH和NO3--N呈现弱正相关.这可能是由于在厌氧环境中, 地下水微生物能利用NO3--N进行反硝化过程, 而NH4+-N和生物可利用磷通常是微生物在好氧条件下的能量储备[64].地下水标志微生物Gallionella能在低氧环境下生存, 并具有硝酸盐还原功能[40], Thiothrix是嗜甲烷菌, 也可以通过硫氧化能力生成硫化物来减弱重金属污染[41], 而Arthrobacter属于好氧细菌, 但能够利用硝酸盐氨化来适应地下水的厌氧环境[65].因此, 地下水微生物几乎不受重金属污染的影响, 群落较为稳定.此外, 本研究中所测定的环境因子对地下水微生物的解释度较低, 这可能是由于漫长的地质和进化时间促进了微生物对地下咸水条件的适应[66], 而本研究中未被量化的盐度可能是决定地下水微生物群落结构的关键因素.
本研究同步调查重金属污染对不同生境微生物群落的影响, 深入揭示了唐河污水库中重金属污染的危害.3个栖息地中微生物群落结构以及对环境条件的响应差异, 表明重金属污染对唐河污水库的沉积物其次是地表水微生物有较大影响.因此, 未来的重金属污染防控应重点加强沉积物重金属污染治理, 防止其进一步污染人们赖以生存的地下水环境.该结果对于评估和预测重金属污染等人为活动对微生物群落的影响具有重要意义, 并将为唐河污水库生态修复和白洋淀生态环境管理和污染防治提供重要参考.
4 结论(1) 唐河污水库区域地下水微生物α多样性显著高于地表水和沉积物样品, 3种生境中的微生物群落β多样性差异显著.
(2) 3种生境微生物群落结构显著不同.地表水微生物以变形菌和拟杆菌为主; 沉积物微生物以厌氧的绿弯菌为主, 变形菌丰度较低, 其中优势属均以重金属耐受菌组成; 地下水微生物优势菌为变形菌.
(3) 理化因素和重金属变量共同决定该区域的微生物群落结构, 不同生境中微生物群落的响应存在明显差异.pH、NO3--N和Li是影响地表水微生物群落结构的主要环境因素, TP、NH4+-N、Cr、Fe、Cu和Zn显著影响沉积物微生物的群落结构, 而重金属变量几乎不影响地下水微生物.
(4) 重金属污染对不同生境微生物群落结构的影响大小为：沉积物＞地表水＞地下水.未来应重点关注沉积物环境中的重金属污染, 防止其进一步扩散影响地下水生态安全.
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