环境科学  2023, Vol. 44 Issue (3): 1768-1779   PDF    
引用本文
王蓥燕, 熊子怡, 罗东海, 王子芳, 高明. 化肥减量配施有机肥对土壤功能微生物和柠檬产量及品质的影响[J]. 环境科学, 2023, 44(3): 1768-1779.
WANG Ying-yan, XIONG Zi-yi, LUO Dong-hai, WANG Zi-fang, GAO Ming. Effects of Chemical Fertilizer Reduction Substitute with Organic Fertilizer on Soil Functional Microbes and Lemon Yield and Quality[J]. Environmental Science, 2023, 44(3): 1768-1779.
化肥减量配施有机肥对土壤功能微生物和柠檬产量及品质的影响
王蓥燕1,2, 熊子怡1, 罗东海1, 王子芳1, 高明1     
1. 西南大学资源环境学院, 重庆 400715;
2. 绵阳师范学院资源环境工程学院, 绵阳 621000
收稿日期: 2022-02-09; 修订日期: 2022-06-15
基金项目: 国家自然科学基金项目（42177019）
作者简介: 王蓥燕(1991~), 女, 博士研究生, 主要研究方向为土壤微生物生态, E-mail: 398766403@qq.com
通信作者: 高明, E-mail: gaoming@swu.edu.cn
摘要: 为明确化肥减量配施有机肥处理非根际/根际土壤功能微生物（硝化、反硝化和溶磷微生物）对柠檬产量和品质的影响，以柠檬果实和非根际/根际土壤为研究对象，将传统果实品质测定与分子生物学技术相结合，探究化肥减量配施有机肥处理非根际/根际土壤功能微生物与柠檬产量和品质之间的相互关系.结果表明：①70%化肥+30%腐熟猪粪处理显著增加硝化强度和磷酸酶活性，但有效控制反硝化酶活性.②化肥减量配施有机肥显著降低硝化微生物和nirS和nirK基因反硝化微生物的丰度.同时，增加nosZ基因反硝化微生物和phoD基因溶磷微生物的丰度.但是，功能微生物群落结构多样性在化肥减量配施有机肥处理没有明确的规律性.③相较于化肥和有机肥，70%化肥+30%腐熟猪粪处理柠檬产量最高，果实品质最佳.④氮素及其转化的相关微生物通过柠檬内在和外观品质显著影响柠檬产量；而磷素及其转化微生物主要通过柠檬内在品质影响柠檬产量.此外，非根际土和根际土对柠檬内在品质的影响因子存在明显的分异现象.由上可知，70%化肥+30%腐熟猪粪处理显著影响土壤氮、磷功能微生物进而提升柠檬产量和品质.
关键词: 化肥减量      根际土      氮、磷功能微生物      柠檬产量和品质     
Effects of Chemical Fertilizer Reduction Substitute with Organic Fertilizer on Soil Functional Microbes and Lemon Yield and Quality
WANG Ying-yan1,2 , XIONG Zi-yi1 , LUO Dong-hai1 , WANG Zi-fang1 , GAO Ming1     
1. College of Resource and Environment, Southwest University, Chongqing 400715, China;
2. College of Resource, Environment and Engineering, Mianyang Teachers' College, Mianyang 621000, China
Abstract: To clarify the effects of non-rhizosphere/rhizosphere soil functional microbes (nitrifiers, denitrifiers, and phosphorus-solubilizing microorganisms) on lemon yield and quality, the lemon fruit and non-rhizosphere/rhizosphere soil were selected as subjects. To explore the correlation between non-rhizosphere/rhizosphere soil functional microbes and lemon yield and quality under a chemical fertilizer reduction substitute with organic fertilizer, traditional fruit quality determination and multiple molecular techniques were used. The results showed that: ① 30% chemical fertilizer reduction substitute with organic fertilizer increased the nitrification intensity and phosphatase activity but effectively controlled the denitrifying enzyme activity. ② The chemical fertilizer reduction substitute with organic fertilizer significantly decreased the abundances of nitrifiers and nirS/nirK-harboring denitrifiers and significantly increased the abundances of nosZ-harboring denitrifier and phoD-harboring microorganisms. However, the diversities of functional microbial community structure did not have clear regularity under chemical fertilizer reduction substitute with organic fertilizer. ③ Compared with that under the application of chemical fertilizer and organic fertilizer alone, lemon yield and quality were the highest under the 30% reduction of chemical fertilizer substitute with organic fertilizer. ④ Nitrogen and its related microbes significantly affected lemon yield through internal and external quality. Phosphorus and its related microbes affected lemon yield mainly through internal quality. In addition, the influence factors of non-rhizosphere soil and rhizosphere soil on lemon intrinsic quality were obviously different. Altogether, these results showed that the 30% reduction of chemical fertilizer substitute with organic fertilizer significantly affected soil nitrogen and phosphorus functional microorganisms and further improved lemon yield and quality.
Key words: chemical fertilizer reduction      rhizosphere soil      nitrogen and phosphorus functional microbes      lemon yield and quality     

化肥投入与农业生产力的提升密切相关, 但是化肥长期和不合理施用会导致土壤养分失衡且造成一系列的生态环境问题, 更对农业可持续发展、生物多样性保护与人类健康产生了不利影响[1].联合国粮食及农业组织(FAO)最新资料显示, 2018年全球化肥单位面积施用量为120.7 kg·hm-2 [2].虽然, 2019年我国单位面积施用量已降至325.65 kg·hm-2[3], 但远高于全球单位施用量.面对国内依然严峻的化肥减量问题, 2021年全国农技中心提出了“十四五化肥减量增效发展方向和五大行动”.在“五大行动”中明确提出有机肥替代化肥的行动.其中, 养分丰富且数量巨大的畜禽粪便成为替代化肥的主流趋势.

随着分子生物学技术及生物信息分析的快速发展, 功能微生物的研究也进一步发展.如含有amoA基因的氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)[4]、含有nirK、nirS和nosZ基因的反硝化菌[5], 它们调控氮素循环的硝化过程和反硝化过程并显著影响土壤中氮素形态的转化[6].此外, 含有phoD基因的溶磷菌会释放碱性磷酸酶水解磷酸单酯和二酯为植物可利用的无机磷[7, 8].已有研究显示, 在不影响蔬菜产量的情况下, 有机物料与化肥减量配施处理显著降低土壤AOA丰度, 而提高AOB的丰度, 同时提高氮肥的利用率[9].Luo等[10]设置的长期定位肥料试验的结果表明, 与化肥相比, 有机肥配施使土壤中碱性磷酸酶活性提高了232%~815%.不稳定有机磷、中度不稳定有机磷和富里酸有机磷含量与phoD基因溶磷菌丰度显著相关.同时, 土壤有机碳含量与phoD基因溶磷菌的群落组成和丰度显著相关.此外, 根系在植物生长发育的过程中扮演重要的角色, 它从土壤中吸收植物所需的养分和水分, 又向土壤分泌各种化合物.因此, 将它对土壤发生影响的区域称为根际.在根际区域的微生物在获得充足的碳源后, 会提高根际养分有效性, 如溶磷菌在根际更易将难溶态磷酸盐有效化.近几年, 有机肥替代对草本植物根际微生物的研究逐渐增多.如蔡秋华等[11]研究了有机肥配施减量化肥对烤烟青枯病及其根际微生物的影响.但与须根系草本植物不同, 目前仅少部分研究者将有机肥替代运用到果树的研究[12, 13], 更鲜见从调节土壤养分循环的功能微生物群落角度, 分析化肥减量如何从非根际和根际影响果树产量和品质.但事实上, 根际微生物是果树根系微生态系统中土壤物质循环和能量流动的主要承担者, 使土壤氮、磷素参与到果树生长发育的各新陈代谢过程中[14].因此, 研究化肥减量配施有机肥下土壤功能微生物对果实生长发育的影响对果园肥料管理意义重大.

近几年, 四川、重庆大力发展柠檬(尤力克)产业, 种植面积约达1 050 km2, 产量超过80万t, 产值近百亿元, 为农民脱贫致富增收起到了巨大的作用.但果农不合理的施肥管理, 导致柠檬园生态系统中土壤酸化、土壤结构退化和土壤养分失衡, 也间接影响柠檬品质安全.因此, 本试验设计不同化肥减量配施有机肥处理并结合分子生物学技术, 研究化肥减量配施有机肥下非根际和根际功能微生物群落和酶活性的变化, 及其对柠檬的产量和品质的影响.本文对柠檬园的节本增效、绿色发展以及柠檬产量和品质安全有重要意义.

1 材料与方法 1.1 研究区及材料概况

试验地位于重庆市潼南国家农业科技园区柠檬种质资源圃内(E105°45′09″, N30°04′29″), 海拔为300~450 m, 年平均气温为17.9℃.最高气温(7月)平均值为34.0℃, 最低气温(1月)平均值为5.0℃, ≥10℃积温为5 433℃, 年降雨量为990 mm, 年日照时数为1 228.4 h, 为亚热带湿润季风气候.

供试柠檬品种为尤力克, 来自潼南柏梓镇小岭村的智能化柠檬脱毒育苗中心.供试验土壤为紫色潮土, 是在紫色土区琼江河台地冲积物(Q4)上经早耕熟化而成, 广泛分布于重庆紫色土区.基本理化性质: pH为5.19、ω(有机碳)为8.68 g·kg-1、ω(全氮)为0.679 g·kg-1、ω(全磷)为0.221 g·kg-1、ω(碱解氮)为57.31 mg·kg-1、ω(速效钾)为244.12 mg·kg-1和ω(有效磷)9.14 mg·kg-1.供试肥料：氮、磷、钾肥品种分别为尿素(N 46%)、过磷酸钙(P2O5 12%)、氯化钾(K2O 60%).新鲜猪粪和腐熟猪粪均取自潼南温氏种猪场, 腐熟猪粪其含氮量(N) 2.291%, 含磷量(P2O5)为2.21%, 含钾量(K2O)为0.88%, pH为8.89; 新鲜猪粪其含氮量(N) 2.146%, 含磷量(P2O5)为1.53%, 含钾量(K2O)为0.79%, pH为8.61.猪粪当季(120 d)碱解氮、速效磷和速效钾的缓释效率为35.3%、34.8%和41.5%[15].微肥来自北美农大集团生产的硼锌锰铁镁钙硅复合微量元素水溶肥料, 各元素总含量(包括：B、Zn、Mg、Si、Ca、Mn和Fe)≥12%, pH为6.0.

1.2 试验处理

选取随机排列为18个能独立排灌的样区, 每个样区用PVC板间隔开(深度：60 cm).每个样区6株柠檬, 株行距3 m×3 m.单株年施氮90 g、磷50 g、钾40 g(逐年增加10 g), 每年施肥5次[16].共设5个等氮处理：传统施肥(FM)、腐熟猪粪(P)、新鲜猪粪(NP)、70%化肥+30%腐熟猪粪(70FP)、50%化肥+50%腐熟猪粪(50FP)和一个对照处理(CK), 每个处理3个重复(表 1).施肥和采样的时间安排：第1次夏肥, 2019年6月2日; 第2次秋肥, 2019年9月4日; 第3次冬肥2019年12月1日; 第4次春肥, 2020年3月5日; 第5次夏肥, 2020年9月20日.5次施肥量相同, 每次围绕树冠滴水线, 挖深、宽各15~20 cm的环状浅沟, 撒入肥料后将土壤回填铺平.

表 1 各施肥处理单株柠檬总施肥量1) Table 1 Total fertilizer volume of each lemon tree in different fertilizations

1.3 测定项目和方法

土壤样本的采集和测定：根据柠檬植株的叶片滴水线向地面开环沟(0~20 cm土层), 然后直接采集须根集中的根系团, 用无菌自封袋封装, 每棵柠檬树收集不少于2 kg的土样.根据抖土法[17], 将根系团剧烈抖动且抖落于1 m×1 m的牛皮纸上的土定义为非根际土; 然后用细毛刷轻轻刷下黏附在须根上的土定义为根际土, 分别将非根际土和根际土混匀, 用3个无菌自封袋收集.土壤样品根据测定的需求量分为不等量的3份, 1份土样于-4℃冰箱保存, 用于测定土壤铵态氮(NH4+)和硝态氮(NO3-)[18], 硝化强度[19]、反硝化酶活性[20]和根据试剂盒测定碱性和酸性磷酸酶活性(科铭科生物有限公司, 苏州).1份土样在经过自然风干后测定土壤pH、土壤有机碳(SOC)、总氮(TN)、总磷(TP)、总钾(TK)、碱解氮(AN)、有效磷(AP)和速效钾(AK)的含量[21].1份土样于-20℃冰箱保存, 使用FastDNA® SPIN Kit for soil(MP Biomedicals, LLC)试剂盒提取土壤总DNA.

功能微生物群落和丰度的测定：利用荧光定量PCR技术定量分析氮、磷功能基因丰度[22], 选用荧光定量PCR引物扩增amoA细菌/古菌(F/R, Arch-amoAF、Arch-amoAR)[23, 24]、nirS/nirK(nirSCd3aF/R3cd、nirK876/nirK1040)[25~27]、nosZ(nosZF、nosZ1622)[23, 27]和phoD(phoD-F733/phoD-R1083)[28]基因片段具体步骤见文献[29].

末端限制性片段长度多态性分析(terminal restriction fragment length polymorphism analysis, T-RFLP)用于分析氮、磷功能微生物群落结构[30].基因片段的扩增, 选用正向引物5′端带荧光物质FAM标记的引物扩增amoA细菌/古菌、nirS/nirK、nosZ和phoD基因片段, 所用引物与荧光定量PCR分析一致, 具体步骤见文献[29].

果实产量和品质指标：果实商品成熟期后对各处理进行采摘取样, 以全树套袋的冬果重量作为柠檬的产量数据.为了避免着生方位给对柠檬品质带来的差异, 采摘均从每棵树的向阳面采果4~5个, 将一棵树上的果实作为一个样本, 则一个处理18个样本.单果重用电子天平测量, 果实横、纵径和果皮厚度用游标卡尺测量.果汁的可溶性固形物(TSS)含量由手持折光仪测定, 采用酸碱滴定法测定果汁可滴定酸(TA)含量, 采用2, 6-二氯靛酚法测定果汁维生素C含量, 采用斐林氏容量法测定果实的总糖含量.具体测定详细步骤见文献[31].

1.4 数据分析

通过SPSS 21.0软件, 对土壤理化性质、微生物拷贝数和土壤酶活的原始数据进行正态性检验和方差齐性检验后, 进行one-way ANOVA单因素方差分析(LSD和Duncan分析).基于T-RFLP数据, 群落结构α-多样性指数分析, 即丰富度指数(richness, S)、均匀度指数(evenness, J′)、香农-威纳指数(shannon-weiner index, H′)利用Excel 2016完成; 利用CANOCO软件和皮尔逊相关分析研究果实产量和品质与土壤环境因子进行基于距离尺度的冗余分析(distance-based redundancy Analysis, db-RDA), 并运用蒙特卡罗置换检验(Monte Carlo permutation test)去检验约束排序模型的显著性(用F值作为统计量).

2 结果与分析 2.1 不同施肥处理土壤理化性质的变化情况

不同施肥处理土壤理化性质的差异见表 2.除FM处理, 其他施肥处理均显著增加土壤pH值.无论是非根际或根际土, NP和P处理中土壤pH值最高, 其次是70FP和50FP处理, 最后是FM处理.此外, 非根际土中pH值明显高于根际土.无论是非根际土或是根际土, 各施肥处理中SOC的含量由小到大的排序为：NP和P处理>70FP和50FP处理>FM处理>CK处理.此外, 根际土中SOC含量均高于非根际土.与CK处理相比较, 施肥处理均显著增加土壤全量养分的含量.其中, 70FP处理显著增加TN的含量; 50FP处理显著增加TK的含量; NP处理显著促进TP含量.相反地, FM处理对土壤全量养分的促进效果最弱.70FP处理显著增加非根际土中速效养分的含量, 分别增加22%AN、245%AP和9%AK的含量; 而P处理显著促进根际土中速效养分的含量, 分别增加20%AN、433%AP和8%AK的含量.FM处理显著增加土壤中铵态氮的含量.在非根际土中FM处理硝态氮含量最高; 而根际土中70FP处理其含量最高.NP处理显著增加土壤WC, 其次是70FP处理.由上可知, NP和P处理显著增加土壤pH、SOC和总量养分的含量; 而70FP和50FP处理显著增加速效养分的含量.

表 2 不同施肥处理的土壤理化性质1) Table 2 Physicochemical properties of soil under different fertilization treatments

2.2 不同施肥处理土壤酶活的变化特征

由图 1可知, 不同施肥处理土壤酶活的变化特征.在24 h内硝化强度变化趋势基本相同, 即在2 h土壤的硝化强度最高, 随后在2~22 h时段硝化强度快速降低, 在22 h后硝化强度趋于稳定.50FP处理非根际土硝化强度最高, P处理最低; 而FM处理根际土硝化强度最高, P处理最低.对于土壤反硝化酶活性, P和NP处理显著增加非根际土反硝化酶活性, 约是CK处理的3.7倍; 而P、NP和50FP处理显著增加根际土反硝化酶活性.

不同小写字母表示不同施肥处理间酶活的差异性(P < 0.05) 图 1 不同施肥处理土壤酶活的差异 Fig. 1 Differences in soil enzyme activity under different fertilization treatments

土壤中碱性磷酸酶活性范围为13.23~20.43 μmol·(d·g)-1; 而酸性磷酸酶活性范围为22.25~31.84 μmol·(d·g)-1.酸性磷酸酶酶活性高于碱性磷酸酶活性.施肥处理均显著增加非根际土碱性磷酸酶活性, 其中50FP处理增加50%碱性磷酸酶活性; 而NP处理和70FP处理显著增加根际土碱性磷酸酶活性.与CK处理相比较, 化肥添加的处理(FM、70FP和50FP处理)显著增加非根际土酸性磷酸酶活性, 而P处理和NP处理显著减少酸性磷酸酶活性.70FP处理和50FP处理显著增加根际土酸性磷酸酶活性.

2.3 不同施肥处理功能微生物群落的变化

不同施肥处理功能微生物丰度的差异, 如图 2.对于具有硝化作用的功能微生物, AOB的丰度范围(以干土计)为4.74×107~5.22×108 copies·g-1; AOA的丰度范围(以干土计)为2.14×106~2.70×107 copies·g-1, AOB的丰度高于AOA.NP处理显著增加AOA丰度; 而50FP处理显著减少根际土中AOA的丰度.FM处理显著增加AOB丰度; 有机肥添加的处理显著减少非根际土AOB的丰度.具有反硝化作用的反硝化微生物的丰度排序为：nosZ>nirS>nirK.施肥处理对nirK基因丰度的影响不显著.50FP处理显著减少nirS基因微生物丰度.50FP处理显著增加nosZ基因微生物丰度.对于phoD基因溶磷微生物的丰度, 50FP处理显著增加phoD基因微生物的丰度, 其次是FM处理.相反地, P处理显著减少phoD基因溶磷微生物的丰度.由上可知, 化肥减量配施有机肥处理显著降低硝化微生物的丰度和nirS、nirK基因反硝化微生物的丰度.同时, 显著增加nosZ基因反硝化微生物和phoD基因溶磷微生物的丰度.

不同小写字母表示不同施肥处理间基因丰度的差异性(P < 0.05) 图 2 不同施肥处理功能微生物基因丰度的差异 Fig. 2 Differences in the abundance of functional microbes under different fertilization treatments

由表 3可知, 不同施肥处理功能微生物群落结构的α-多样性.对于硝化微生物, 70FP处理显著增加非根际土AOA群落的多样性.50FP处理显著增加非根际土AOB群落的多样性; 而P处理与之相反.除70FP处理, 其他施肥处理均显著降低根际土AOA和AOB群落的多样性.对于nirS和nirK基因反硝化微生物群落的多样性, 施肥处理对非根际土nirS基因反硝化微生物群落的影响不显著; 非根际nirK基因反硝化微生物群落与之相反.P处理和NP处理分别显著增加根际土nirK和nirS基因反硝化微生物群落的多样性.对于nosZ基因反硝化微生物群落的多样性, 施肥处理未显著影响非根际土群落的多样性; 而施肥处理显著降低根际土群落的多样性, 尤其是P处理.对于phoD基因微生物群落的多样性, 施肥处理均显著增加非根际土群落的多样性, 各施肥处理增加效果排序：NP处理>70FP和P处理>50FP处理>FM处理.FM、70FP和50FP处理显著增加根际土群落的多样性.

表 3 不同施肥处理功能微生物群落结构的α-多样性1) Table 3 The α-diversity of functional microbes' community structure under different fertilization treatments

2.4 不同施肥处理柠檬产量和品质的变化情况

由表 4可知, 不同施肥处理柠檬每hm2的产量和品质的差异.柠檬产量范围为27 156~35 947 kg·hm-2.与CK处理相比, 各施肥处理柠檬产量的排序为：NP处理 < P处理 < FM处理 < 50FP处理 < 70FP处理.此外, 与FM处理相比较, 70FP处理增长了11.2%, 50FP处理增长了3%; 而NP处理降低了4.9%.由上可知, 化肥肥减量配施有机肥处理能显著增加柠檬的产量.

表 4 不同施肥处理柠檬产量和品质1) Table 4 Yield and quality of lemon under different fertilization treatments

施肥处理均提升柠檬果实的外观品质.70FP处理显著增加柠檬的单果重, 其次是NP处理, 最后是FM处理.与CK处理柠檬单果重相比, 分别是其的1.5、1.4和1.2倍.柠檬果皮厚度的范围为0.53~0.83 cm, 其中, 70FP处理柠檬果皮最厚, 其次是P处理和NP处理, 最薄是FM处理和CK处理.70FP处理柠檬的纵横径均最大, 分别可达9.03 cm和7.93 cm, 约是FM处理的1.27倍.其次是50FP处理分别可达8.67 cm和7.56 cm, 是FM处理的1.23倍.就果形指数而言, P处理和50FP处理柠檬的果形指数最高, 其次是70FP处理, 最后是FM处理和P处理.

柠檬可溶性固形物的质量分数范围为5.1%~5.67%, 其中化肥减量配施有机肥处理质量分数最高, 其次是P处理, NP处理最低.与CK处理相比较, NP处理和50FP处理显著增加柠檬酸的质量分数, 而FM处理和70FP处理显著降低柠檬酸的质量分数.化肥减量配施有机肥处理柠檬总糖的质量分数最高, 其次是有机肥处理, 最后是FM处理, 分别是CK处理的2.6、2和1.4倍.柠檬维生素C质量分数范围为17.58~24.32 mg·(100 g)-1. 70FP处理维生素C质量分数最高, 是CK处理的1.6倍; P处理维生素C质量分数最低, 是CK处理的85.32%.柠檬出汁率的范围为36.18%~42.07%, 在70FP和P处理柠檬的出汁率最高, 其次是50FP处理, 再次是NP处理和FM处理, 最后是CK处理.

2.5 柠檬产量和品质与土壤理化性质和功能微生物之间的相互关系

柠檬产量和品质与土壤环境和功能微生物间的相互关系见图 3.与功能微生物相比, 土壤理化性质对柠檬产量的影响更显著.无论是非根际或根际土, 土壤TN是影响柠檬产量最显著的土壤理化性质, 其次是磷素(AP、ACP和ALP)及phoD基因微生物群落的多样性, 最后是AOB的多样性.

B1.pH, B2.产量, A1.含水量, A2.有机碳, A3.总氮, A4.总磷, A5.总钾, A6.硝态氮, A7.铵态氮, A8.碱解氮, A9.有效磷, A10.速效钾, A11.碱性磷酸酶, A12.酸性磷酸酶, A13.反硝化酶活性, A14.硝化强度, A15.氨氧化细菌群落多样性, A16.nirS基因细菌群落多样性, A17.nirK基因细菌群落多样性, A18.nosZ基因细菌群落多样性, A19.phoD基因细菌群落多样性, A20.氨氧化古菌丰度, A21.氨氧化细菌丰度, A22.nirS基因细菌丰度, A23.nirK基因细菌丰度, A24.nosZ基因细菌丰度, A25.phoD基因细菌丰度 图 3 柠檬产量和品质与土壤环境和功能微生物之间的相关性 Fig. 3 Correlation of lemon yield and quality and soil environment and functional microbes

柠檬外观品质受非根际土TN(F=28.7, P=0.002, 解释度：64.2%)和phoD基因微生物群落多样性(F=19.2, P=0.002, 解释度：54.6%)的影响最显著, 其次是含水量(F=7.5, P=0.006, 解释度：10.7%)、ACP(F=7.7, P=0.004, 解释度：15.4%)和硝化强度(F=7.6, P=0.006, 解释度：10.5%), 最后是AK(F=3.4, P=0.036, 解释度：4.2%)、nirK基因微生物的丰度(F=3.5, P=0.048, 解释度：4.2%)、AOB群落的多样性(F=4.8, P=0.014, 解释度：4.3%)和nirS基因微生物的丰度(F=2.9, P=0.048, 解释度：2.3%)受根际土TN(F=20.7, P=0.002, 解释度：56.4%)、nosZ基因微生物群落的多样性(F=16.8, P=0.002, 解释度：51.2%)、AOA的丰度(F=11.2, P=0.002, 解释度：20.8%)和ACP(F=7.9, P=0.002, 解释度：10.1%)的影响最显著, 此外还受硝态氮(F=5.3, P=0.02, 解释度：11.4%)、AK(F=6.6, P=0.016, 解释度：10.3%)、铵态氮(F=3.5, P=0.042, 解释度：4.7%)和TP(F=3.5, P=0.018, 解释度：3.9%)的显著影响.

柠檬内在品质受非根际土AP(F=36.0, P=0.002, 解释度：69.2%)、TP(F=12.6, P=0.002, 解释度：2.5%)、ACP(F=18.5, P=0.002, 解释度：29.1%)、ALP(F=10.3, P=0.002, 解释度：5.9%)和phoD基因微生物群落多样性(F=14.3, P=0.002, 解释度：47.2)的影响最显著, 其次是土壤pH(F=16.7, P=0.002, 解释度：16.2%)、硝化强度(F=11.0, P=0.002, 解释度：10.1%)和AOB的丰度(F=17.7, P=0.002, 解释度：4.4%), 最后是铵态氮(F=3.9, P=0.032, 解释度：0.5%)、SOC(F=11.4, P=0.002, 解释度：4.3%)和反硝化酶活性(F=5.7, P=0.008, 解释度：1.0%).受根际土TN(F=17.9, P=0.002, 解释度：52.7%)、AN(F=12.4, P=0.002, 解释度：16.3%)、AP(F=13.1, P=0.002, 解释度：9.2%)、nosZ基因微生物群落多样性(F=10.7, P=0.002, 解释度：40.0%)和nirS基因微生物丰度(F=9.7, P=0.002, 解释度：10.8%)的影响最显著, 其次为SOC(F=2.5, P=0.004, 解释度：4.1%)和AOB群落的多样性(F=9.7, P=0.004, 解释度：23.6%), 最后为铵态氮(F=5.5, P=0.016, 解释度：12.6%)、酸性及碱性磷酸酶活性(F=6.0; 5.5, P=0.024; 0.016, 解释度：10.9%; 3.7%)和nirS基因微生物群落多样性(F=4, P=0.026, 解释度：3.6%).由上可知, 柠檬外观品质主要受氮素及其转化的微生物的影响; 影响柠檬内在品质的环境因子在非根际土和根际土之间存在差异.

3 讨论 3.1 化肥减量配施有机肥对功能微生物及酶活性的影响

土壤氮循环与农业生产和生态环境安全有密切的关系[32], 其关键步骤为硝化作用和反硝化作用[33].本文中P处理显著减少硝化强度, 而FM处理显著增加根际土硝化强度[34](图 1).这可能与AOB的丰度有关, 因为已有研究显示, AOB的丰度与硝化强度显著正相关, 本文中FM处理根际土AOB丰度都显著高于其他施肥处理[35, 36](图 2).而P处理显著减少硝化强度是因为外源有机质的添加会促进有机酸的产生, 进而抑制AOB的丰度[37].P处理和NP处理显著增加反硝化酶活性, 而FM处理对反硝化酶活性的增加效果不显著[38, 39] (图 1).因为介导反硝化酶活性的微生物多为异养微生物且受碳源限制[40], P处理和NP处理为它们提供了充足的碳源.70FP和50FP处理均属于化肥减量配施有机肥处理, 但化肥和有机肥的配比差异也显著影响反硝化酶活性(图 1).杨杰[39]在中性和微碱性土壤中发现, 根际土中1∶1的化肥与有机肥处理反硝化酶活性显著低于3∶1的化肥与有机肥处理.虽然该结果与本文的结果相反, 但侧面证明不同土壤类型根际效应对反硝化酶活性的影响不同[41, 42].化肥减量配施有机肥处理显著增加nosZ基因微生物丰度[43, 44](图 2), 则该处理更多地进行完全反硝化作用, 即离子态氮更多地被转化为N2释放到空气中, 而不是N2O[44, 45].因为nosZ基因反硝化微生物调控反硝化作用的最后一步是将N2O转化为N2的过程[46], 且其丰度一定程度上能反映该过程的程度[47].虽然与70FP处理相同, FM处理反硝化酶活性增加也并不显著, 但同时降低nosZ基因微生物的丰度[48], 则离子态氮大部分转化为N2O释放到空气中[49].本文中, 化肥减量配施有机肥处理硝化微生物群落多样性最高, 这与硝化微生物的营养生长有关[50].在非根际土中施肥处理对反硝化微生物群落多样性的影响不显著, 已有的研究中也得到类似结果[51, 52].但是根际土中它们却展现出了显著的差异, P处理nirS和nirK基因微生物多样性显著增加, nosZ基因微生物群落结构显著减少, 这侧面证明根际效应对反硝化微生物群落的影响不容忽视.本文中的试验土为酸性土, 酸性磷酸酶含量明显高于碱性磷酸酶(图 1), 与已有研究的结果一致[53].化肥减量配施有机肥处理显著增加碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性, 因为该处理显著增加phoD基因微生物的丰度和群落多样性, 而已有研究证明磷酸酶活性与溶磷菌的丰富和多样性显著正相关[54~56].同时也有研究证实, 微生物的溶磷作用可能只是碳循环的副产品, 氮源和碳源供应充足促进了溶磷微生物的功能表达[54, 57].由上可知, 化肥减量配施有机肥处理有效调控氮、磷功能微生物.

3.2 化肥减量配施有机肥对柠檬产量和品质的影响

本研究发现, 70FP处理显著增加柠檬产量[13, 58], P处理和NP处理少量增加柠檬产量(表 4).但刘红明等[13]的研究显示, 有机肥不能促进柠檬的产量, 与本文的结果相异(表 4).这可能与有机肥的肥源有关, 因为本文用的猪粪肥比牛粪肥所含的养分更高[59].同时, 已有研究也显示, 猪粪肥处理柠檬产量高于化肥[58].以上结果一定程度上证明有机肥处理对柠檬产量的促进效果取决于有机肥的肥源.单果重、柠檬的横径和出汁率在化肥减量配施有机肥处理最高(表 4), 与已有研究的结果一致[11, 58].但是, 柠檬果皮厚度对化肥减量配施处理的响应并不一致, 刘红明等[13]发现化肥减量配施处理果皮厚度最小; 而杜玉霞等[58]则发现了相反的结果, 与本文的结果一致.这可能与柠檬的品种有关, 因为不同柠檬品种对肥料的响应存在一定差异[60].除了柠檬酸含量, 化肥减量配施有机肥处理显著增加VC、总糖和可溶性固形物, 特别是70FP处理[11](表 4).这与张国显等[61]研究番茄果实对化肥减量配施有机肥处理的响应基本一致, 即降低了果实的酸度, 同时增加VC和总糖的含量.这与土壤pH有关, 因为已有研究发现当土壤酸化加剧会显著增加可滴定酸含量[62], 而本文中70FP处理土壤pH有显著的增加.除了土壤pH, 土壤中铁、镁和钾等矿质元素也起着不可忽视的作用.因为, 在土壤酸化加剧接近pH=4时, 果肉汁细胞质和线粒体镁含量下降, 柠檬酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性降低, 此时柠檬酸合成就会受到抑制[62], 这可能是FM处理pH降低, 柠檬酸含量也同时降低的原因.

3.3 土壤环境和功能微生物对柠檬产量和品质的影响

氮、磷养分作为果树生长发育不可缺少的大量养分其对果实产量的影响毋庸置疑[59].本研究显示, 无论是非根际或根际土TN是影响柠檬产量最显著的土壤环境因子, 其次是磷素(AP、ACP和ALP)及其转化相关phoD基因微生物群落多样性, 最后是AOB多样性(图 3).通过进一步的相关分析可知, 氮素和磷素通过外观和内在两个方面影响柠檬产量.其中, 氮素主要通过改善柠檬外观品质提高柠檬产量, 因为已有研究表明, 氮素会显著影响果实激素含量, 在果实的膨大期, 充足的氮素会促进ZRs、ABA和IAA等激素的释放, 进而间接影响果实成熟[63].果实的外观品质会受到氮素形态的显著影响, 因为果实的单果重和果皮厚度在充足硝态氮情况下更佳[64].此时, 介导硝化作用的AOB和AOA将土壤铵态氮转化为硝态氮就间接增加了果实单果重和果皮厚度.化肥减量配施有机肥处理硝化强度和单果重均显著增加, 也进一步证实硝化微生物通过改变氮素形态影响柠檬的外观品质, 从而影响柠檬的产量.与氮素通过影响柠檬外观品质影响柠檬产量不同, 土壤的磷素主要通过影响柠檬的内在品质影响柠檬产量.首先, 在缺磷情况下根系会向周围土壤中分泌酸性磷酸酶将有机磷水解为正磷酸盐, 提高根际土中有效磷含量[65]; 同时, 微生物会分泌碱性磷酸酶的胞外酶将有机磷转化为正磷酸盐被果树吸收利用[66].而phoD基因微生物调控着土壤中碱性磷酸酶的释放[66].总糖作为柠檬的主要内在品质之一, 而植物体内多糖形成都要通过含磷的中间化合物介导.同时, 可溶性固形物和柠檬酸的合成都少不了磷素的参与[67].以上内在品质也都会直接影响柠檬产量.因此, 直接转化土壤有机磷为植物可利用无机磷的phoD基因微生物就间接通过影响柠檬的内在品质, 影响柠檬产量.对于柠檬的外观品质的影响, 非根际土和根际土中氮素都基本起着主导地位; 而对于柠檬内在品质的影响, 受根际土中氮素的影响和非根际土中磷素的限制.目前为止对于以上现象还没有合理的解释.但从以往的研究显示, 根际土环境更易实现磷素的有效性, 因为除了本文提及的磷酸酶以外, 根系分泌的有机酸也能很好地实现磷酸有效性[68].因此, 这也是柠檬内在品质不受根际土磷素影响, 而受非根际土磷素影响的可能原因.

4 结论

化肥减量配施有机肥处理不仅明显改善土壤养分环境, 更有效地调控土壤功能微生物群落, 间接促进柠檬产量和品质的提升.70FP处理硝化强度虽有显著的提升, 但有效控制反硝化酶活性, 同时促进N2O向N2转化减少温室气体的排放.此外, 该处理显著增加磷酸酶活性.对于功能微生物群落, 化肥减量配施有机肥显著降低了硝化微生物和nirS和nirK基因反硝化微生物的丰度.同时, 促进nosZ基因反硝化微生物和phoD基因溶磷微生物的丰度.但是, 化肥减量配施有机肥处理功能微生物群落结构多样性没有明确的规律.在70FP处理, 柠檬产量有显著增加, 品质也有显著的提升.其中, 氮素及其转化相关微生物群落通过柠檬内在和外观品质显著影响柠檬产量; 而磷素及其转化微生物群落主要通过柠檬内在品质影响柠檬产量.此外, 非根际土和根际土对柠檬内在品质的影响因子存在明显的分异现象.

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