2023, Vol. 44
2. 西南山地生态循环农业国家级培育基地, 重庆 400715
2. State Cultivation Base of Eco-agriculture for Southwest Mountainous Land, Chongqing 400715, China
消落带作为水陆之间重要的过渡带, 是改善水质、控制洪水和缓解水土流失的关键区域[1].自三峡大坝建成以来, “冬蓄夏排”的水文调度方式使库区两岸形成了一段特殊的生态环境区域[2], 进而导致该区域原陆生生态系统发生了严重的退化, 水土流失、生境丧失、生物多样性下降和环境污染等问题十分突出[3].在此现状下, 植被重构被认为是恢复三峡库区消落带的重要措施[4, 5].
研究人员通过大量筛选, 选择了落羽杉(Taxodium distichum)[6]、池杉(Taxodium ascendens)[7]和旱柳(Salix matsudana)[8]等木本植物作为三峡库区消落带植被修复的优良适生树种.其中, 落羽杉具有根系发达, 耐水淹及抗旱能力强等特性, 对保持河岸带水土具有重要意义, 被广泛用于消落带的种植[6, 7].植被重建之后的植物经季节性水淹, 其叶片及枯落物等会输入河岸带土壤, 而河岸带可以通过过滤和反硝化等功能有效地去除污染物并保护水质.在此过程中, 土壤酶与土壤微生物发挥了重要作用, 土壤酶能催化叶片和植物凋落物分解、促进养分循环[9], 而土壤微生物是土壤酶的重要来源[10], 其能产生胞外酶, 进而从土壤环境中获取能量和资源[11].此外, 土壤细菌作为微生物中的最大类群, 在有机质分解、元素生物地球化学循环、温室气体排放和养分转化等生态过程中也发挥着重要作用[12, 13].
植被对土壤细菌群落结构的影响会进一步影响土壤细菌功能组成[14].PICRUSt方法使用标记基因(通常为微生物的16S rRNA基因)数据和参考基因组数据库[15], 预测宏基因组的功能组成, 现已广泛应用于森林土壤[16~18]、湿地[19~21]和水体[22~24]等不同生境的微生物功能研究之中.目前, 有关消落带植物土壤的研究主要集中在土壤营养元素含量[25]、土壤微生物生物量[26]和有机酸代谢[27]等方面, 对土壤微生物, 特别是根际土壤细菌群落结构及功能方面的研究较少.因此, 本文以消落带适生植物落羽杉土壤为研究对象, 探究其不同时期土壤细菌群落结构及功能特征的变化, 明确消落带木本植被重建对库区土壤环境的影响及意义, 以期为消落带生态修复提供一定的理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况研究地点位于重庆忠县石宝镇共和村汝溪河流域(107°32′~108°14′E, 30°03′~30°35′N), 属亚热带季风气候, 四季分明, 年积温为5 787℃, 年均气温为18.2℃, 无霜期为341 d, 日照时数为1 327.5 h, 日照率为29%, 太阳总辐射能为3.5×105 J·cm-2, 年降雨量为1 200 mm, 相对湿度为80%.区域为典型的丘陵地貌, 坡度为20°~25°, 土壤主要为石灰性紫色土, 土壤熟化程度较低, 水土流失且土层侵蚀现象严重.
本课题组于2012年3月在重庆忠县石宝镇共和村汝溪河流域构建了消落带植被修复示范基地, 面积为0.133 km2.示范基地内土壤质地、肥力状况基本一致, 在海拔165~175 m区间按1 m×1 m株行距种植落羽杉人工林(苗木由重庆市江北区机场附近的苗圃提供), 所选岸坡度、太阳辐射强度和土壤雨热条件基本一致.经过8 a的反复水淹, 落羽杉成活率为100%, 且生长状况良好.
1.2 采样方法根据汝溪河流域水位变动状况, 野外取样时间为2020年5月(T1)、2020年7月(T2)和2020年9月(T3), 采样时间分别对应消落带退水初期(同时也是落羽杉生长初期)、落羽杉生长旺盛期和消落带淹水前期(亦即落羽杉生长末期).冬季落羽杉根际处于水淹状态, 无法完成土壤取样.采样时首先清除落羽杉树木四周的石子与凋落物, 然后用平铲沿东、南、西、北这4个方向分别挖掘4个土芯剖面(20 cm×20 cm×20 cm), 接着分离土芯, 收集根际土与非根际土壤.根际土的收集方式为抖落法, 除去根系附近的石子及动植物残体, 抖落根系表面的粒土和杂质, 采集附着于根际表面4 mm以内的东、南、西和北这4个方向的土壤作为根际土样[28], 用四分法收集东、南、西和北这4个方向的土芯土壤作为非根际土壤, 3个时期共采集72个根际、非根际土壤样本, 为方便后续土壤理化、酶活性和细菌多样性的测定, 将同一植株东、南、西和北这4个方向的土壤样本混合, 最终获得土壤样本18个, 土壤收集混合后立即运回实验室进行后续指标的测定.
1.3 测定方法落羽杉根际与非根际土壤测定分为3个部分, 一部分自然风干, 研磨过筛(1 mm和0.25 mm), 用于土壤理化性质的测定; 一部分土样储存于4℃, 用于土壤酶活性的测定; 另一部分土样保存于-80℃, 用于土壤细菌DNA的提取.
1.3.1 土壤理化性质的测定土壤含水量(SWC)采用烘干法测定, 土壤容重(BD)采用环刀法测定; 土壤温度(T)和土壤氧化还原电位(ORP)采用氧化还原电位计测定, 土壤pH值采用电极电位法测定(1∶2.5土水比浸提液), 土壤全碳(TC)、全氮(TN)含量测定采用元素分析仪(Elementar Vario EL, Germany), 土壤有机质(OM)测定采用水合热重铬酸钾-硫酸-比色法[29]; 土壤全磷(TP)、全钾(TK)和速效钾(AK)含量测定采用电感耦合等离子体发射光谱法[30](ICP-OES, Thermo Fisher iCAP 6300, UK), 土壤速效磷(AP)、硝态氮(NO3--N)和铵态氮(NH4+-N)采用全自动间断化学分析仪(CleverChem, Germany)测定.
1.3.2 土壤酶活性测定土壤蔗糖酶的测定采用3, 5-二硝基水杨酸比色法, 其活性以24 h后1 g土壤产生葡萄糖的mg数表示; 土壤脲酶采用苯酚钠比色法测定, 其活性以24 h后1 g土壤产生NO3--N的mg数表示; 磷酸酶活性的测定采用磷酸苯二钠比色法, 其活性以24 h后1g土壤中释出的酚的mg数表示[31].
1.3.3 土壤细菌群落多样性测定本实验中土壤细菌总DNA的提取采用DNeasy® PowerSoil® Kit(QIAGEN)试剂盒, 其操作步骤按照说明书进行, 提取后的DNA经1.2%琼脂糖凝胶电泳及微量紫外分光光度计测定其浓度, 然后保存于-20℃.采用细菌16S V4-V5区通用引物进行PCR扩增, 引物序列为515F(5′-GTGCCAGCMG CCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRA GTTT-3′), 每个样品进行3次重复扩增, 然后混合同一样品扩增产物; 对PCR产物切胶纯化, Qubit定量之后, 等量(n)混合, 建立测序文库, 采用Ilumina HiSeq进行测序.
采用QIIME(quantitative insights into microbial ecology)进行进一步的生物信息学分析[32], 采用FLASH算法拼接双端序列, 同时, 为获得高质量序列, 根据质量分数Q20对序列进行质控, 使用UPARSE算法[33]将得到的高质量序列进行聚类OTU, 在聚类过程中严格去除嵌合体序列, 使用RDP数据库对OTU代表序列进行物种注释.
土壤细菌α多样性由Chao1(SChao1)、Simpson(D)和Shannon-Wiener(H)指数表征, 其计算公式为:
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式中, SChao1表示估计的OTU数, Sobs表示实际观测到的OTU数, n1表示只含有一条序列的OTU数, n2表示只含有两条序列的OTU数目.
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式中, ni表示第i个OTU所含的序列数, N表示所有的序列数, S1表示实际观测到的OTUs.
1.4 数据处理采用单因素方差分析(Oneway-ANOVA)比较不同时期落羽杉土壤理化性质、土壤酶活性和细菌群落功能丰度的差异, 多重比较采用Duncan法; 采用配对样本t检验分析根际、非根际土壤理化性质及酶活性的差异; 下游数据分析在QIIME、R软件和SPSS 18.0中进行, 采用R 4.0.3、Origin 2019和Canoco 5作图.
利用PICRUSt2(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states2)[34]对土壤细菌16S rRNA高通量测序数据进行分析.参考KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库, 得到各代谢途径在样本中的丰度[35], 其具体分析过程见https://github.com/picrust/picrust2[34].加权最近排序分类单元指数(weighted nearest sequenced taxon index, NSTI)被用来评估评估PICRUSt分析的准确性[15].
2 结果与分析 2.1 落羽杉土壤理化及酶活性特征不同时期落羽杉土壤物理性质如表 1所示, 土壤含水量在15.3%~21.47%之间, 但3个时期不存在显著差异; 土壤容重为1.23~1.43 g·cm-3, 3个时期不存在显著差异; 土壤温度和土壤氧化还原电位在不同时期存在显著差异(P < 0.05), 土壤温度在T2最高, 且显著大于T1和T3两个时期(P < 0.05), 土壤氧化还原电位则表现为T1显著高于T3时期(P < 0.05).
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表 1 不同时期落羽杉土壤物理特征1) Table 1 Soil physical properties of bald cypress under different sampling times |
表 2展示了不同时期落羽杉土壤化学性质特征, 土壤pH值范围为6.75~7.11, 为中性偏微酸性土壤, 3个时期根际土壤pH值不存在显著差异, 非根际土壤的pH值在T3显著大于T2(P < 0.05); 土壤TP、TK、OM和NO3--N含量在根际土壤中保持较为一致的趋势, 即T3>T1>T2, 但3个时期值不存在显著差异; 根际土壤中AP、AK的值在T1到T3逐渐升高, 但不存在显著差异; 根际土壤中NH4+-N含量在T2显著高于T3(P < 0.05).不同土壤分区中, T1时期根际土壤TK含量显著高于非根际, T2时期的土壤NH4+-N和NO3--N含量在根际显著高于非根际(P < 0.05); 土壤OM、NO3--N和AP在3个时期均表现出正向根际效应(R/S>1).
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表 2 不同时期落羽杉土壤化学性质特征1) Table 2 Soil chemical properties of bald cypress measured in different sampling times |
3个时期土壤酶活性结果表明, 蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性均在T2时期最低(图 1), 且蔗糖酶、磷酸酶根际土壤及脲酶非根际土壤中T2时期酶活性显著小于T1时期(P < 0.05).除T1时期的脲酶外, 其余各土壤酶在3个时期均表现出根际正效应(R/S>1), 其中T1时期磷酸酶活性在根际土壤中显著高于非根际土壤(P < 0.05).
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TR：落羽杉根际土壤; TS：落羽杉非根际土壤; 不同小写字母表示不同时期之间差异显著(P < 0.05); **表示根际与非根际之间差异极显著(P < 0.01) 图 1 不同时期落羽杉土壤酶活特征 Fig. 1 Soil enzyme activities measured in different sampling times |
Chao1指数反映了种群的丰富度, Shannon指数和Simpson指数反映了物种多样性, Observed_Otus表示注释的OTU数, PD_whole_tree是基于系统发育树计算的多样性指数, 其值越大, 群落多样性越高. α多样性分析表明(图 2), 除Chao1指数以外, 根际土壤细菌的丰富度均表现为：T1>T2>T3, 且Observed_Otus指数和PD_whole_tree指数在T1显著大于T3(P < 0.05), 非根际土壤细菌多样性则表现为：T3>T1>T2, 但不同时期间不存在显著差异.
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* 表示不同时期α多样性指数之间差异显著(P < 0.05); TR-T1:T1时期落羽杉土壤, TR-T2:T1时期落羽杉土壤, TR-T3:T3时期落羽杉土壤, TS-T1:T1时期落羽杉土壤, TS-T2:T2时期落羽杉土壤, TS-T3:T3时期落羽杉土壤, 下同 图 2 不同时期落羽杉根际和非根际土壤细菌群落α多样性特征 Fig. 2 The α-diversity index of bacterial communities in soils of bald cypress under different sampling times |
高通量测序结果表明, 所有土壤样品细菌由60门、201纲、402目、624科和1 022属组成, 门水平上变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)为优势菌门[图 3(a)], 占全部土壤样品丰度的83.76%~89.71%, 其中变形菌门丰度最大, 为37.72%~45.81%.酸杆菌门为所有土壤样品中第二大细菌门, 占比为16.03%~19.06%.纲水平上α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、酸杆菌纲(Acidobacteria)、δ-变形菌纲(δ-proteobacteria)和γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)为优势菌纲, 占所有土壤样本的46.84%~54.09%[图 3(b)].
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图 3 不同时期落羽杉土壤样品中优势细菌门和优势细菌纲的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of dominant phylum and dominant class in soil samples of bald cypress under different sampling times |
根际土壤中各细菌门在不同时期的相对丰度未表现出显著差异; 非根际土壤中, 酸杆菌门细菌丰度在T1时期显著大于T3, 拟杆菌门的相对丰度在T1显著大于T2(P < 0.05).各纲水平细菌在根际土壤中不同时期并未表现出显著差异, 非根际土壤中, 仅β-变形菌纲和浮霉菌纲相对丰度在T2显著大于T3(P < 0.05).
2.4 落羽杉土壤理化性质与细菌群落的相关关系采用冗余分析(redundancy analysis, RDA)对不同时期细菌群落构差异及影响细菌群落的理化因子进行分析.结果表明(图 4), 不同时期各样点聚集在一起, 土壤细菌群落结构未表现出明显差异.各理化性质对细菌群落结构的影响不同, 第一轴解释了64.45%的物种-环境变化, 第二轴解释了19.07%的物种-环境变化, 累计解释了83.52%的物种-环境变化.土壤pH值、URE、NH4+-N和NO3--N等是影响落羽杉细菌群落组成的关键因子.
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红色箭头表示环境因子, 蓝色十字表示在门分类水平上优势细菌种群; INV:蔗糖酶; Ure:脲酶; Pho:磷酸酶 图 4 不同时期优势细菌门与土壤理化因子的冗余分析 Fig. 4 RDA of dominant bacterial phylum and soil physicochemical factor in different sampling times |
加权最近排序分类单元指数(NSTI)是预测PICRUSt准确性的一个指标, 其值越低表示准确度越高.本研究中所有土壤样本的NSTI得分在0.08~0.13之间, 平均值为0.10, 低于土壤样品的NSTI平均得分0.17, 表明这些数据与参考微生物基因组数据库的数据吻合较好, 预测的各土壤细菌群落的代谢功能具有较高的可信度.
基于16S rRNA测序数据, 利用PICRUSt2预测落羽杉土壤细菌群落的代谢功能, KEGG 1水平的主要功能类别为代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、有机系统和人类疾病.其中, 代谢、遗传信息处理和环境信息处理途径最为普遍, 分别占36.1%、19.92%和16.81%.
在分布于6个代谢途径的细菌群落中, 共鉴定了45个二级KEGG Orthology(KO)组.对预测基因二级功能层丰度进行分析, 发现落羽杉土壤细菌群落主要涉及膜运输(10.82%)、翻译(9.61%)、氨基酸代谢(8.82%)、碳水化合物代谢(7.1%)、辅助因子和维生素的代谢(5.74%)、能量代谢(5.32%)等45个二级功能.在二级功能层中, 与C、N和P代谢相关的途径主要包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂类代谢及能量代谢等.除碳水化合物代谢外, 其余3种代谢途径在根际和非根际土壤细菌中各丰度均在T2时期最低.落羽杉根际土壤中氨基酸代谢和脂类代谢途径丰度均在T3时期值最高, 而碳水化合物途径丰度则在T2时期更高(图 5).
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TR：落羽杉根际土壤; TS：落羽杉非根际土壤; 不同小写字母表示不同时期之间差异显著(P < 0.05) 图 5 不同时期土壤氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢和脂类代谢的KOs丰度 Fig. 5 Predicted abundance of KEGG orthologs (KOs) assigned to the metabolism of amino acids, carbohydrate, energy, and lipids under different sampling times |
季节变化可能通过凋落物和根际分泌物等影响土壤环境, 从而改变土壤细菌群落结构及多样性[36].T2时期正值夏季, 土壤温度高, 有研究表明高温会抑制微生物的活动[37], 进而影响其酶活性的释放, 这与本研究中3种土壤酶在T2时期活性最低的结果相一致.同时, 土壤TP、TK、OM和NO3--N等养分也在T2时期最低, 这可能与T2时期降水频繁, 河岸带土壤受到的冲刷加剧有关.同时, 土壤NH4+-N、NO3--N、OM、TP含量和3种土壤酶活性在根际总体高于非根际, 这与已有的研究结果相一致, 即土壤养分在根际产生了正效应, 根际分泌物有利于土壤养分的积累[38, 39].
3.2 落羽杉土壤细菌群落结构特征落羽杉土壤样本中共发现细菌60门, 其中以变形菌门和酸杆菌门为优势菌门, 这与前人在湿地[40]、沙地[41]和世界各地土壤中[42]的研究发现相似, 表明土壤细菌具有较强的生态适应性[43].变形菌门主要以α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲等为优势菌, 且变形菌纲多为硝化和碳化微生物, 对土壤氮碳循环具有重要的意义[44, 45].酸杆菌门为寡营养细菌, 适合生存在pH较低及贫瘠的营养环境下[46], T1时期落羽杉非根际土壤中较高的该细菌丰度说明了其土壤营养条件较差.此外, 本研究中土壤pH值在7附近, 这与Xiong等[47]的研究结果一致, 即酸杆菌在中性土壤中也能存在.拟杆菌门中的一些种类与DNA、蛋白质和脂类等土壤中有机物质的转换有关, 对土壤中碳循环起着重要作用[48], 而T1时期落羽杉非根际土壤中其相对较高的丰度说明了该时期落羽杉土壤中与碳代谢相关的活动较强.根际土壤细菌组成在不同时期不存在显著差异, 这可能与根系分泌物有关, 有研究表明植物可通过根系分泌物塑造一个较为稳定的根系微环境[49].
土壤细菌多样性的变化可能与植物生长和温度的变化有关[37], 结果表明, 本研究中落羽杉土壤根际和非根际细菌群落多样性表现出不同变化趋势.根际细菌群落除Chao1以外, 所有根际土壤细菌群落α多样性随时间变化逐渐下降, 这是因为在T1时期, 土壤温度逐渐升高, 落羽杉开始恢复生长, 微生物活动频繁, 故其细菌多样性较高; T2时期正值盛夏, 高温对微生物的生长具有一定的抑制作用[37], 同时, T2时期取样当年雨水较多, 水位保持在一个较高的水平, 长时期的水淹会造成缺氧环境[50], 故α多样性较T1时期有所下降; T3时期根际细菌丰富度继续下降至最低值, 而非根际细菌多样性则升高, 造成这种现象的原因可能与T3时期落羽杉根系分泌物有关.有研究表明, 植物根系分泌物中含有对自身生长产生抑制作用的生物活性物质, 如酚类化合物等[51], 进而影响细菌群落的丰富度, 而非根际土壤细菌群落在T3时期升高则与其较低的温度和降水减少有关.以上结果表明, 落羽杉根际土壤细菌群落多样性对季节性环境波动有明显响应, 且根际、非根际土壤细菌变化趋势并不一致.
3.3 落羽杉土壤细菌群落的影响因素微生物群落结构和组成受土壤理化性质的影响[52].本研究中, 土壤ORP与放线菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门和酸杆菌门等优势细菌群落存在正相关关系, 这与前人的研究结果相似, 其原因可能与三峡库区消落带特殊的环境条件有关, 消落带为水陆交错地带, 干湿交替的土壤环境使土壤氧化还原电位处于一个不断变化的状态[53], 而土壤细菌也对此种环境有着一定的适应性.RDA分析表明, 土壤URE、pH值、NH4+-N和NO3--N等是影响落羽杉土壤细菌群落组成的关键因子, 其中土壤脲酶对细菌群落影响最大.脲酶与土壤氮素有效性密切相关, 其活性常用于表征土壤有机氮的矿化强度[54].土壤pH值在生物地球化学循环中起着重要作用, 是影响细菌分布的重要因子[55], 而土壤NH4+-N和NO3--N是土壤中主要的氮源[56], 其含量也会影响细菌组成.
3.4 落羽杉土壤细菌功能特征本研究基于KEGG数据库, 利用PICRUSt2预测16S rRNA基因序列的群落功能[15], 并进一步比较了不同时期落羽杉土壤样本在OTU水平上的功能及代谢途径的差异.落羽杉土壤细菌在一级功能分为6类, 其中, 代谢是落羽杉土壤细菌群落中普遍存在的基本功能, 这与前人在根际和非根际土壤[57]微生物群落的研究中相对应.代谢途径中所包括的氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢和能量代谢等途经与土壤C、N和P等元素循环有关.落羽杉根际土壤中氨基酸代谢相关丰度在T3时期最高, 表明该时期落羽杉土壤中N的降解更为活跃, T3时期正值秋季, 温度和水分等外界条件适宜, 这也与落羽杉在T1时期α多样性表现出最大值相符合, 进一步证明了土壤细菌的高丰富度会促进氨基酸代谢等活动的进行.此外, 土壤微生物通过一系列反应提高了磷对植物的有效性[58], 木本植物在T3时期表现出较高的脂类化合物代谢过程, 也证明了其在磷素转化与利用方面的重要作用.而能量代谢则包括了与碳固定、氮和硫代谢有关的途径, 落羽杉土壤在T1时期较高的能量代谢丰度证明了其土壤在某种程度上参了与矿物元素的生物地球化学循环.
尽管PICRUSt2功能预测能够对细菌功能进行分析, 但其预测范围基于数据库的大小, 存在一定局限性[59], 后续将结合宏基因组技术, 对土壤细菌与适生植物的相互作用机制进行进一步的研究.
4 结论(1) 土壤理化性质、酶活性在不同时期存在一定差异性, 土壤pH值、URE、NO3--N和NH4+-N对细菌群落组成有较大影响.时间变化引起的土壤理化、酶活性的变化对细菌群落组成有一定的驱动作用, 而不同时期土壤细菌的群落组成也能在一定程度上反映该时期的土壤理化性质.
(2) 变形菌门和酸杆菌门是落羽杉土壤中的优势细菌门类, 在消落带适生植物的土壤改良、养分循环及逆境适应等过程中发挥着重要作用.落羽杉根际土壤细菌α多样性均表现为：T1>T2>T3, 而非根际细菌α多样性指数表现为：T3>T1>T2, 表明根际、非根际土壤细菌对时间变化的响应不同.
(3) 落羽杉土壤细菌中共发现来自6个代谢通路的45个子功能类群, 一级功能层中代谢居主导地位.在二级功能层中, 与C、N和P相关的代谢途径主要包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂类化合物代谢和能量代谢等过程, 各代谢途径存在一定的时间差异, 说明了土壤微生物群落通过改变其代谢活动来响应植物的生长.
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