2023, Vol. 44
抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作为一种新型污染物广泛存在于各种水环境中[1, 2].已有研究表明, 无论采用常规处理工艺还是深度处理工艺, 自来水厂和输配系统水中均能检出多种抗性基因和可移动遗传元件[3, 4].饮用水输配管网中的生物膜是由微生物、有机物(如多糖、蛋白质、核酸和脂质)和一些无机固体组成的复杂体系[5], 可以保护细菌免受某些环境胁迫[6], 如消毒剂[7, 8]和抗菌剂[9]的影响.管网生物膜中生物质的量可占饮用水输配系统中生物质总量的95%以上[10], 且不同材质管道上生物膜的微生物群落组成不同[11, 12].由于生物膜中的微生物分布密集, 在群体感应作用下可能更加频繁地发生水平基因转移事件[13].Angles等[14]研究发现, 质粒作为一种可移动遗传元件, 其在玻璃珠表面生物膜细胞间的转移频率高于水相细胞间的转移频率.生物膜被认为是水生环境中抗性基因和抗性细菌扩散的重要途径[15].生物膜的形成和其微生物群落结构组成受到管材的显著影响[16], 但对于不同输水管材内壁生物膜中微生物所携带的抗生素抗性基因和可移动遗传元件的分布特征却知之甚少.
对饮用水输配管网生物膜中抗生素抗性基因的研究多采用PCR和qPCR方法, 这些方法可对目标抗性基因进行定性或定量检测, 但针对每个基因需要对应的特异引物, 检测效率低、覆盖的抗生素抗性基因少, 无法获得研究对象中全部抗生素抗性基因的赋存信息, 且难以同时获得样品的物种组成信息, 不利于全面分析样品中抗生素抗性基因的赋存特征.宏基因组测序是一种基于样品DNA的简单高效的测序方法, 可同时获得样品的物种组成信息和多种功能基因信息, 是研究环境样品抗生素抗性基因和可移动遗传元件赋存特征的高效方法.
本文采用宏基因组测序对不同材质供水管道内壁生物膜的物种组成、抗生素抗性基因和可移动遗传元件进行分析, 通过探究不同管材管壁生物膜中抗生素抗性基因赋存的特征, 以期为供水末端水质改善和管网更新维护提供有益参考.
1 材料与方法 1.1 样品采集生物膜样品来自实验室小试系统(图 1), 包括两种不锈钢材质管道和两种塑料材质管道.不锈钢材质管道分别为304不锈钢管和316 L不锈钢管, 塑料材质管道分别为PPR管和PE管.管道中通入相同的实验室自来水, 在运行150 d后采集不同管材内壁生物膜.采集生物膜时, 首先使用无菌PBS缓冲液对管道内壁进行冲洗, 然后使用无菌刷刷取管道内壁生物膜, 将收集的生物膜过滤于无菌0.22 μm混合纤维素滤膜上, 最后进行样品DNA提取.样本采集于2021年10月.
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图 1 实验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of experimental device |
管道内壁生物膜采集后, 使用MPBio Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Bio, 美国)试剂盒提取样品总DNA, 利用One Drop OD-1000+(WINS, 中国)检测DNA纯度, 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性.通过Covaris M220将DNA片段化, 筛选约400 bp的片段, 使用NEXTflex Rapid DNA-Seq构建PE文库：首先进行接头链接, 使用磁珠筛选去除接头自连片段, 然后利用PCR扩增进行文库模板的富集, 磁珠回收PCR产物得到最终的文库.使用Illumina NovaSeq PE250测序平台(上海美吉生物医药科技有限公司)进行宏基因组测序.
1.3 宏基因组数据分析数据质控采用fastp[17](v0.20.0)进行, 保留高质量的序列.使用MEGAHIT[18](v1.1.2)对优化序列进行拼接组装, 在拼接结果中筛选≥300 bp的重叠群作为最终的组装结果.使用MetaGene[19]对拼接结果中的重叠群进行开放阅读框架预测.选择核酸长度≥100 bp的基因, 并将其翻译为氨基酸序列.使用CD-HIT[20](v4.6.1)对所有样品预测出来的基因序列进行聚类(相似度90%, 覆盖度90%), 每类取最长的基因作为代表序列, 构建非冗余基因集.使用SOAPaligner[21](v2.21)分别将每个样品的高质量序列和非冗余基因集进行比对(一致性95%), 统计基因在对应样品中的丰度信息.使用Diamond[22](v0.8.35)将非冗余基因集的氨基酸序列和NR数据库(nr_20200604)进行比对(期望值1e-5)获得物种注释信息.使用ARGs-OAP[23](v2.3)对抗生素抗性基因和可移动遗传元件进行注释(期望值1e-5, 一致性80%), 在注释可移动遗传元件时, 将该软件数据库修改为一个已发表的可移动遗传元件数据库[24].
1.4 数据处理使用SPSS Statistics 26对数据进行显著性分析; 使用R中的VennDiagram包绘制韦恩图; 使用Origin 2022绘制柱形图; 使用R中的psych包进行数据统计, 利用Gephi(v0.9.4)绘制网络图; 使用R中的vegan包进行方差分解分析.
2 结果与讨论 2.1 不同管材生物膜上抗生素抗性基因的分布特征4种管材生物膜样本共检出17类146种抗生素抗性基因(图 2).304不锈钢管生物膜和PPR管生物膜检出17类抗生素抗性基因, 316 L不锈钢管生物膜和PE管生物膜检出16类抗生素抗性基因, 二者分别缺少春日霉素和磷霉素两类抗性基因.有51种(34.93%)抗性基因在4种管材生物膜中均有检出, PE管生物膜中独有的抗性基因种类最多(20种), 316 L不锈钢管生物膜中独有的抗性基因种类最少(4种).316 L不锈钢管因生物膜中检出抗生素抗性基因种类最少而优于其他3种管材.
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图 2 抗生素抗性基因类和种数量韦恩图 Fig. 2 Venn diagram of the number of type and subtype of antibiotic resistance genes |
对抗生素抗性基因的丰度分别以各样本对应细胞数进行标准化, 抗生素抗性基因丰度在4种管材生物膜中介于0.17(316 L)~0.30(PE)copies·cell-1(图 3).PPR管生物膜中抗性基因丰度低于PE管和304不锈钢管生物膜, 仅稍高于316 L不锈钢管生物膜中的丰度.
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图 3 不同管材生物膜中抗生素抗性基因丰度 Fig. 3 Abundance of antibiotic resistance genes in different pipe biofilms |
4种管材中, 多药类抗性基因在所有检出的抗性基因中丰度最高(0.06~0.15 copies·cell-1), 其比例介于29.8%(PPR)~49.7%(PE).将多药类抗性基因排除后和原始总丰度进行检验, 结果表明两组数据间存在显著差异(配对样本T检验, P < 0.05), 且二者方差相差较大(去除多药类抗性基因后丰度方差：SNM2=0.000 59, 抗性基因丰度总方差：ST2=0.003 06), 说明多药类抗性基因在不同管材生物膜中的丰度差别大, 是不同管材生物膜抗生素抗性基因赋存水平差异的主要原因.
综上可知, 316 L不锈钢管在抗生素抗性基因检出丰度和检出数量上均最低或最少, PPR管次之, 二者在多药类抗性基因的检出上也有同样表现.
2.2 不同管材生物膜上可移动遗传元件的赋存特点可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)是驱动水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)介导细菌进化和适应性的核心, 被称为高度复杂的“自然基因工程”工具[25].如图 4(a)所示, 不同管材生物膜中可移动遗传元件丰度介于1.02(PE)~3.85(304)copies·cell-1之间.尽管不同管材间可移动遗传元件检出丰度相差较大, 但4类可移动遗传元件丰度在不同管材中均为转座酶基因>插入序列>整合酶基因>质粒.此外, 不同管材可移动遗传元件的检出丰度显著高于抗生素抗性基因(独立样本T检验, P < 0.05), 这表明管壁生物膜中除了抗生素抗性基因, 还存在大量的可移动遗传元件, 但二者丰度并没有显示出一致性.对不同管材中检出的抗生素抗性基因序列进行可移动遗传元件注释[图 4(b)], 注释到的可移动遗传元件可被视为和抗性基因“共存”的部分, 该部分可移动遗传元件的丰度相较其总丰度显著降低(独立样本T检验, P < 0.05), 其中316L不锈钢管最低.整合酶基因在共存序列中所占比例大幅升高, 比较明显的是304和PPR两种管材, 其总可移动遗传元件中的优势部分为插入序列和转座酶基因, 但在共存序列中其优势部分变为整合酶基因.分别比较三者的共存丰度和其在各样本中总丰度之比的平均值, 即“共存比”, 发现整合酶基因的共存比(2.76%)远远高于插入序列的共存比(0.02%)和转座酶基因的共存比(0.04%), 显示整合酶基因和抗生素抗性基因关系密切, 其可能在抗生素抗性基因的水平转移上发挥着重要作用.
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图 4 不同管材生物膜中可移动遗传元件丰度 Fig. 4 Abundance of mobile genetic elements in different pipe biofilms |
图 5为4种管材生物膜中抗生素抗性基因和属水平物种的共现网络, 抗性基因和其潜在宿主之间存在较强的共现关系.多药类抗性基因在样本中丰度最高, 其在属水平的潜在宿主为水杆菌属(Aquabacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和Asinibacterium等, 其中水杆菌属、慢生根瘤菌属在4种管材生物膜中的相对丰度分别为3.7%~57.5%和2.7%~10.5%, 高丰度的潜在宿主是多药类抗性基因大量存在的基础.不同的抗生素抗性基因的潜在宿主数量不同, 利福霉素类和甲氧苄啶类抗性基因仅有1个属的潜在宿主, 而膦胺霉素类抗性基因则拥有多达11个属的潜在宿主, 这说明抗生素抗性基因在宿主中的分布是有选择性的.
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红色点表示抗性基因, 绿色点表示其潜在宿主 图 5 抗生素抗性基因和属水平物种的共现网络 Fig. 5 Co-occurrence network of antibiotic resistance genes with bacteria at genus level |
图 6是抗生素抗性基因和可移动遗传元件的共现网络.转座酶基因、插入序列和质粒分别与81种、59种和51种抗性基因呈共现关系, 可移动遗传元件是抗性基因水平转移的重要影响因素.使用方差分解分析量化可移动遗传元件和细菌群落对生物膜中抗生素抗性的解释度, 发现细菌群落对抗生素抗性的解释度为27.3%, 高于可移动遗传元件对抗性的解释度(19.5%).管壁生物膜中抗生素抗性的首要影响因素是细菌群落组成, 其次是可移动遗传元件介导的基因水平转移.
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不同颜色为基因所属抗性基因大类, 括号中数字为该类抗生素抗性基因种水平数量 图 6 抗生素抗性基因和可移动遗传元件的共现网络 Fig. 6 Co-occurrence network of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements |
(1) 抗生素抗性基因在不同管材内壁生物膜中的赋存状态存在差异, 多药类抗性基因在不同管材生物膜中的丰度差别较大, 是不同管材生物膜抗生素抗性基因差异的主要原因.
(2) 不同管材生物膜中可移动遗传元件的总丰度显著高于抗生素抗性基因, 和抗生素抗性基因共存的可移动遗传元件的丰度相较其总丰度显著降低; 整合酶基因和抗生素抗性基因关系密切, 可能在抗生素抗性基因的水平转移上发挥着重要作用.
(3) 不同管材管壁微生物附着具有选择性, 管壁生物膜中抗生素抗性的首要影响因素是细菌群落组成, 其次是可移动遗传元件介导的基因水平转移; 物种组成和可移动遗传元件共同塑造了抗性基因的分布特征.
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