2023, Vol. 44
干旱区淡水资源短缺是限制农业可持续发展的关键问题[1, 2].新疆属于典型的干旱区, 农业用水主要依赖于日益减少的地表水和储量丰富但具有一定含盐量的浅层地下水.因此, 使用咸水灌溉已成为缓解该地区淡水短缺的重要措施[3].干旱区石灰性土壤母质普遍含盐, 在节水滴灌条件下, 盐分并不能被淋洗出土体, 若长期应用咸水灌溉势必造成土壤盐分累积, 增加土壤盐渍化的风险[4].此外, 咸水中的盐分离子Na+和Cl-等进入土壤后会破坏土壤结构, 增加土壤盐分, 降低土壤团聚体稳定性, 导致土壤通气透水性变差, 影响养分转化, 降低土壤肥力[5~8].土壤微生物群落在维持土壤肥力和土壤生态平衡中发挥着重要作用[9].土壤环境的变化势必会造成土壤微生物活性改变[10, 11].诸多学者均一致认为盐分对土壤微生物活性、多样性和群落结构有不利影响[12~14], 但也有研究发现盐分能够促进土壤微生物量增加、提高细菌的丰富度及多样性[15, 16].盐分虽被普遍认为是抑制微生物活性的主要非生物因素之一, 但是部分耐受极端环境的微生物在盐胁迫环境下反而被底物诱导, 表现出较高活性[17].因此咸水灌溉对干旱区农田的土壤理化性质、土壤微生物群落等产生的影响值得引起高度关注, 如何调控咸水灌溉给土壤带来的不良影响成为目前的研究热点.
氮肥一般是作物生长的限制性因素, 在盐渍化土壤中合理施用氮肥可有效降低盐分对作物生长的危害.长期施用氮肥造成土壤养分差异明显, 不仅能显著增加土壤肥力、改善土壤容重、水分含量和团聚体含量等物理化学性质, 同时对土壤微生物多样性、活性和群落组成与结构等也会产生显著影响[18~20].有研究表明, 增加氮肥施用量, 会导致土壤pH值下降, 显著降低土壤微生物生物量[21].适宜的氮肥用量能够有效调控作物根际土壤菌群数量和结构, 保障作物根际土壤微生态的稳定性, 显著提高作物根际土壤细菌和放线菌的数量, 抑制真菌数量[22].也有研究表明长期施肥与不施肥土壤的微生物群落结构差异主要表现在真菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌[23].施入土壤中的氮肥会被微生物进行分解和转化, 其中一部分作为自身营养物质, 大部分会留在土壤中供作物吸收利用, 但是长期咸水灌溉和氮肥施用对土壤微环境的影响尚未明晰.近年来, 随着分子生物学技术的发展, 宏基因组是在微生物群落研究中应用最为广泛的组学, 能够深入剖析微生物群落结构, 对微生物群落结构的研究更为全面.
因此, 本研究针对干旱区咸水灌溉的现实问题, 通过多年田间定位试验, 采用宏基因组学的研究方法, 探究和阐明长期咸水灌溉和氮肥施用对土壤微生物群落结构的影响, 揭示咸水灌溉条件下影响土壤微生物群落的内在机制, 以期为干旱区咸水资源的合理利用和农业的可持续发展提供一定的理论依据.
1 材料与方法 1.1 试验点试验点位于石河子大学农学院试验站(44°18′N, 86°02′E), 供试土壤为石灰性冲积土(即冲积的灰色沙漠土壤), 该地区为温带干旱地区, 属大陆性气候, 年平均降水量为180~270 mm, 年平均蒸发量为1 000~1 600 mm, 年平均气温为6.5~7.2℃.土壤表层(0~20 cm)基础理化性状为：容重1.33 g·cm-3、pH值(1∶2.5) 7.48、电导率(EC1∶5) 0.13 dS·m-1、ω(有机质) 16.8 g·kg-1、ω(全氮) 1.08 g·kg-1、ω(速效磷) 25.9 mg·kg-1和ω(速效钾) 253 mg·kg-1.
1.2 试验设计本试验于2009年开始, 采用两因素随机区组设计, 其中灌溉水盐度(ECw)设2个处理：0.35 dS·m-1和8.04 dS·m-1(分别用FW和SW表示), 在每个灌溉水盐度下, 施氮量设2个水平：0 kg·hm-2和360 kg·hm-2(分别用N0和N360表示).其中淡水来源于当地深层地下水, 咸水通过在淡水中加入NaCl和CaCl2(质量比1∶1)获得.每个处理重复3次, 共12个试验小区, 每个小区面积为25 m2.
1.3 农艺措施棉花于每年4月中旬播种, 9月中旬采收.棉花种植采用覆膜栽培, 每膜3管6行, 行距配置为(60+10)cm, 播种密度22.2万株·hm-2.采用干播湿出法, 2020年于4月15日播种, 为保证棉花出苗, 播种后每个处理滴出苗水30 mm.整个棉花生长期间共灌水9次, 于6月中旬开始至8月下旬结束, 灌水周期7~10 d, 灌溉定额450 mm.试验中氮肥使用尿素, 在棉花生长期间分6次随水滴施.磷肥(P2O5)和钾肥(K2O)为基肥, 用量分别为105 kg·hm-2和75 kg·hm-2, 在播种前期一次性施用, 其他管理措施参照当地大田生产.
1.4 土壤样品的采集与测定 1.4.1 样品采集土壤样品于2020年7月25日采集, 每个处理随机选取3个采样点, 采集深度为0~20 cm.将采集的土样混合均匀并去除其中的杂质、细根等.一部分土样风干粉碎后用于土壤养分的测定, 另一部分土样储存在-80℃下用于宏基因组测序分析.
1.4.2 样品测定理化性质测定：土壤容重采用环刀法测定; 土壤含水量采用烘干法测定; 土壤盐度采用电导率仪(DDS-308A)测定; 土壤pH值采用pH计(pHS-3C)测定; 土壤有机碳采用TOC仪(multi N/C 2100S, Analytic jena)测定; 土壤全氮采用凯式定氮仪测定; 土壤速效磷采用碳酸氢钠浸提法测定; 土壤速效钾采用火焰光度计法测定.
DNA提取和宏基因组测序：使用DNeasyⓇ PowerSoilⓇ Pro Kit试剂盒(美国)按照操作说明称取5.0 g新鲜土壤提取总微生物基因组DNA样本, 并储存在-20℃为进一步评估使用.分别使用NanoDrop ND2000分光光度计(美国)和biowest agArose琼脂糖凝胶电泳(西班牙)测量提取DNA的数量和质量.使用NanoDrop2000检测DNA纯度, 使用TBS-380检测DNA浓度.使用超声波破碎仪Covaris M220将DNA打断为约400 bp的片段, 建库试剂盒使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit(美国).通过美吉生物技术有限公司(中国上海)的PE150策略, 使用Illumina HiSeq X-ten平台(美国Illumina)对每个文库进行测序.
原始序列读取经过质量控制, 获得质量过滤后的读数, 以便进一步分析.使用软件fastp(https://github.com/OpenGene/fastp, version 0.20.0)对reads 3′端和5′端的adapter序列进行质量剪切; 使用软件fastp去除剪切后长度小于50 bp、平均碱基质量值低于20以及含N碱基的reads, 保留高质量的pair-end reads和single-end reads; 使用基于succinct de Bruijn graphs原理的拼接软件MEGAHIT(https://github.com/voutcn/megahit, version 1.1.2)对优化序列进行拼接组装.在拼接结果中筛选≥300 bp的contigs作为最终的组装结果.使用MetaGene (http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)对拼接结果中的contigs进行ORF预测.选择核酸长度≥100 bp的基因, 并将其翻译为氨基酸序列.构建非冗余基因集用CD-HIT(http://www.bioinformatics.org/cd-hit/, version 4.6.1)对所有样品预测出来的基因序列进行聚类(参数为: 90% identity, 90% coverage), 每类取最长的基因作为代表序列.
1.5 数据分析采用SPSS统计软件包(version SPSS.21.0)对土壤理化性质进行单因素方差分析, Tukey法用于不同处理间显著性的多重比较(P < 0.05).利用MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/)软件制作热图, 对不同样本进行聚类, 并确定微生物群落组成和氮转化功能关键基因.利用软件(https://cloudtutu.com/)绘制相关性热图, 通过计算两种因子之间的相关性(Spearman系数), 将获得的数值矩阵通过热图直观展示, 通过颜色变化反映二维矩阵或表格中的数据信息, 颜色深浅表示数据值的大小.利用分析软件LEfSe (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_upload) 根据分类学组成对样本按照不同的分组条件进行线性判别分析(LDA), 找出对样本划分产生显著性差异影响的物种/功能.利用软件Python中的Networkx, 绘制物种分布网络分析图, 用来展示样本与物种之间的分布情况, 通过对不同样本间的物种/功能丰度信息进行相关性分析, 可以获得物种/功能在环境样本中的共存在关系, 突显出样本之间的相似性和差异性.采用R语言进行RDA统计分析和作图.
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质灌溉水盐度、施氮量及两者交互作用均显著影响土壤理化性质(表 1).总体上, 咸水灌溉增加土壤SWC、EC1∶5、SOC和TN, 降低土壤pH和AK; 氮肥施用增加土壤SOC、EC1∶5和TN, 降低土壤SWC、pH和AK.交互作用的影响表现为：在淡水处理下, 施氮显著增加EC1∶5, 而在咸水处理下, 施氮显著降低EC1∶5; 在淡水处理下, 施氮显著降低pH, 而在咸水处理下, 施氮无显著影响; 无论是淡水处理还是咸水处理, 氮肥施用均降低土壤SWC、AP和AK, 但是降低的幅度不同, 在淡水处理下, FWN360处理的土壤SWC、AP和AK分别较FWN0处理降低12.63%、33.61%和8.81%, 在咸水处理下, SWN360处理的土壤SWC、AP和AK分别较SWN0处理降低2.55%, 24.67%和22.22%; SOC和TN的趋势与其相反, 氮肥施用均增加土壤SOC和TN, 但增加的幅度不同, 在淡水处理下, FWN360处理的土壤SOC和TN分别较FWN0处理增加22.73%和35.50%, 在咸水处理下, SWN360处理的土壤SOC和TN分别较SWN0处理增加7.46%和11.39%.
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表 1 不同处理对土壤理化性质的影响1) Table 1 Soil physicochemical properties under different treatments |
2.2 土壤微生物群落结构
对NCBI数据库中每个样本的Scaftigs序列进行BLASTN比较, 获得物种分类的注释度(表 2).各处理微生物以细菌为主, 占96.06%~97.01%, 其次为古细菌和真核生物, 分别占2.55%~3.44%和0.20%~0.23%.咸水灌溉降低细菌、真核生物和未分类生物的丰度, 增加古菌和病毒的丰度; 氮肥施用降低细菌、真核生物和未分类生物的丰度, 增加古菌和病毒的丰度.
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表 2 不同处理下的土壤微生物注释度1)/% Table 2 Annotation of soil microbial community under different treatments/% |
2.3 土壤微生物群落多样性
土壤微生物门和属水平的维恩图如图 1所示.在门水平上, FWN0、FWN360、SWN0和SWN360处理总OTUs个数为132, 共有OTUs数为129, 占总OTUs的97.72%, 4个处理均无特异的OTUs[图 1(a)].4个处理中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)是共有OTUs中的优势菌门.FWN0和SWN0处理特有OTUs数为2个, 为壶菌门(Chytridiomycota)和Candidatus_Atribacteria, FWN0和FWN360特有OTUs数为2个, 为Candidatus_Daviesbacteria和Candidatus_Woesebacteria, FWN0和SWN360特有OTUs数1个, 为球囊菌门(Glomeromycota), FWN360和SWN0处理特有OTUs数2个, 为纤维杆菌门(Fibrobacteres)和硅藻门(Bacillariophyta), SWN0、SWN360和FWN360处理特有OTUs数2个, 为Candidatus_Nomurabacteria和Candidatus_Parcubacteria.
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图 1 不同处理土壤微生物群落维恩图 Fig. 1 Venn diagram for soil microbial community under different treatments |
在属水平上, FWN0、FWN360、SWN0和SWN36处理总OTUs个数为3 172, 共有OTUs数为2 831, 占总OTUs的89.25%[图 1(b)].FWN0处理具有特异OTUs个数为34, 占总OTUs的1.07%, FWN360处理具有特异OTUs个数为20, 占0.63%, SWN0处理具有特异OTUs个数为17, 占0.53%, SWN360处理具有特异OTUs个数为17, 占0.53%, 说明咸水灌溉和氮肥施用均能够降低物种数量, 改变土壤微生物群落多样性.芽单胞菌属(Gemmatimonas)、Gemmatirosa、土壤红杆菌属(Solirubrobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、Pyrinomonas和Conexibacte是4个处理共有OTUs中的优势菌属.Malpighia、Vicugna、Ostrea和Phytolacca等是FWN0处理特有的菌属, Blomia、Cucurbita、Mesocyclops和Saussurea等是FWN360处理特有的菌属, Petalonia、Cyclotella、Antheraea和Acartia等是SWN0处理特有的菌属, Eyprepocnemis、Ahnfeltiopsis、Chlorosarcina和Syntrichia等是SWN360处理特有的菌属.
2.4 土壤微生物门水平群落组成门水平上的微生物群落组成情况如图 2所示.其优势菌门为：变形菌门(Proteobacteria)(28.22%, 平均相对丰度, 下同)、放线菌门(Actinobacteria)(22.99%)、酸杆菌门(Acidobacteria)(9.67%)、绿弯菌门(Chloroflexi)(7.83%)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(6.91%), 其相对丰度均大于5.00%, 平均相对丰度占总序列的75.61% (75.07%~76.49%).其次为浮霉菌门(Planctomycetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)和奇古菌门(Thaumarchaeota), 平均相对丰度均大于1.00%, 其它细菌门类的相对丰度合计为11.43% (10.96%~11.92%).
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图 2 不同处理门水平前10种微生物的相对丰度 Fig. 2 Relative abundances of the top ten phyla under by different treatments |
咸水灌溉与氮肥施用均显著影响土壤微生物门水平群落结构(图 3).在淡水灌溉下, 与FWN0处理相比, FWN360处理显著增加绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)和Armatimonadetes的相对丰度, 显著降低变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和广古菌门(Euryarchaeota)的相对丰度.在咸水灌溉下, 与SWN0处理相比, SWN360显著增加变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度, 显著降低酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、Candidatus_Tectomicrobia、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)和candidate_division_NC10的相对丰度.
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图 3 不同处理门水平聚类分析热图 Fig. 3 Heat map of dominant phyla under different treatments |
在不施氮肥条件下, 与FWN0处理相比, SWN0处理显著降低变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和疣微菌门(Verrucomicrobia)的相对丰度, 显著增加放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、Candidatus_Tectomicrobia、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)和Armatimonadetes的相对丰度.在施氮肥条件下, 与FWN360处理相比, SWN360显著降低酸杆菌门(Acidobacteria)、蓝细菌(Cyanobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和candidate_division_NC10的相对丰度, 显著增加放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)和Armatimonadetes的相对丰度.
在门分类水平下选取相对丰度前20的物种对微生物群落组成与土壤理化性质进行相关性分析(图 4).变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、蓝细菌(Cyanobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)与土壤SOC和TN呈显著负相关, 与土壤pH呈显著正相关, 酸杆菌门(Acidobacteria)、蓝细菌(Cyanobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)与土壤AK呈显著正相关.放线菌门(Actinobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)与土壤SOC和TN呈显著正相关, 绿弯菌门(Chloroflexi)与土壤AK和pH呈显著负相关.芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和厚壁菌门(Firmicutes)与土壤AP呈显著负相关, 与土壤TN呈显著正相关.
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红色表示正相关, 蓝色表示负相关, 圆形面积大小表示相关性大小；P≥0.05无标记, *表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 4 门水平前20种微生物与土壤理化性质的相关性分析 Fig. 4 Analysis of correlation between bacterial community of the top 20 phyla and soil physical and chemical properties |
属水平上的微生物群落组成情况如图 5所示.通过序列比对获得各处理土壤样品中微生物群落相对丰度较高的前10个菌属, 其中10个菌属的平均相对丰度均＞1.00%, 占样品总序列的26.99%(25.18%~28.09%).优势菌属有芽单胞菌属(Gemmatimonas)(3.65%, 平均相对丰度, 下同)、Gemmatirosa(3.18%)、土壤红杆菌属(Solirubrobacter)(3.02%)、链霉菌属(Streptomyces) (2.02%)、Pyrinomonas(2.00%)和Conexibacter(1.73%).
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图 5 不同处理属水平前10种微生物的相对丰度 Fig. 5 Relative abundances of the top ten genus under different treatments |
咸水灌溉与氮肥施用均显著影响土壤微生物属水平群落结构(图 6).在淡水灌溉下, 与FWN0处理相比, FWN360处理显著增加Streptomyces和硝化螺旋菌属(Nitrospira)的相对丰度, 显著降低土壤红杆菌属(Solirubrobacter)和红色杆菌属(Rubrobacter)的相对丰度.在咸水灌溉下, 与SWN0处理相比, SWN360处理显著增加亚硝化螺菌属(Nitrososphaera)、Sphingomonas和硝化螺旋菌属(Nitrospira)的相对丰度, 显著降低芽单胞菌属(Gemmatimonas)、Candidatus_Entotheonella和土壤红杆菌属(Solirubrobacter)的相对丰度.
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图 6 不同处理属水平聚类分析热图 Fig. 6 Heat map of dominant genus under different treatments |
在不施氮肥条件下, 与FWN0处理相比, SWN0处理显著降低Pyrinomonas、Sphingomonas、硝化螺菌属(Nitrospira)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和土壤红杆菌属(Solirubrobacter)的相对丰度, 显著增加Gemmatirosa、Streptomyces、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、Candidatus_Entotheonella、红色杆菌属(Rubrobacter)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)和分支杆菌属(Mycobacterium)的相对丰度.在施氮肥条件下, 与FWN360处理相比, SWN360处理显著降低芽单胞菌属(Gemmatimonas)、Pyrinomonas、硝化螺菌属(Nitrospira)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和土壤红杆菌属(Solirubrobacter)的相对丰度, 显著增加类诺卡氏菌属(Nocardioides)和红色杆菌属(Rubrobacter)的相对丰度.
在属分类水平下选取总丰度前20的物种对微生物群落组成与土壤理化性质进行相关性分析(图 7).芽单胞菌属(Gemmatimonas)和Gemmatirosa与土壤TN呈显著正相关, 与土壤AP呈显著负相关.土壤红杆菌属(Solirubrobacter)与土壤AP呈显著负相关.链霉菌属(Streptomyces)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)与土壤SOC和TN呈显著正相关, 与土壤pH呈显著负相关.Pyrinomonas和硝化螺菌属(Nitrospira)与土壤AP呈显著正相关, Pyrinomonas与土壤TN呈显著负相关.
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红色表示正相关, 蓝色表示负相关, 圆形面积大小表示相关性大小; P≥0.05无标记, *表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 7 属水平前20种微生物与土壤理化性质的相关性分析 Fig. 7 Analysis of correlation between bacterial community of the top 20 genera and soil physical and chemical properties |
使用LEfSe (LDA>3.5, P < 0.05)进行组间比较分析, 分析不同处理土壤微生物群落在相对丰度上有显著差异的物种(图 8).通过LEfSe分析, 细菌共有46个显著差异种群, 其中FWN0处理15个、FWN360处理8个、SWN0处理9个、SWN360处理14个.FWN0处理的差异物种, 门水平上：酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和拟杆菌门(Bacteroidetes); 纲水平上：α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)和鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria); 目水平上：伯克氏菌目(Burkholderiales)和鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales).FWN360处理的差异物种, 纲水平上：Blastocatellia和硝化螺旋菌纲(Nitrospira); 目水平上：硝化螺旋菌目(Nitrospirales); 属水平上：吡喃单胞菌属(Pyrinomonas)和硝化螺旋菌属(Nitrospira); 科水平上：硝化螺旋菌科(Nitrospiraceae).SWN0处理的差异物种, 门水平上：放线菌门(Actinobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes); 纲水平上：放线菌纲(Actinobacteria)和芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes); 目水平上：芽单胞菌目(Gemmatimonadales); 科水平上：芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)和红螺菌科(Rhodospirillacea); 属水平上：芽单胞菌属(Gemmatimonas)和Gemmatirosa.SWN360处理的差异物种, 门水平上：绿弯菌门(Chloroflexi); 纲水平上：α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)和黄杆菌纲(Flavobacteriia); 目水平上：微球菌目(Micrococcales)、硝化螺旋菌目(Nitrospirales)和黄杆菌目(Flavobacteriales); 科水平上：硝化螺旋菌科(Nitrospiraceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae).以上结果说明, 氮肥施用会降低群落差异物种数, 在未施氮肥条件下, 咸水灌溉会降低群落差异物种数, 但在施用氮肥条件下, 咸水灌溉会提高群落差异物种数.
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不同颜色节点表示在相应组中显著富集并对组间差异有显著影响的微生物群; 浅黄色节点表示在不同组间没有显著差异或对组间差异没有显著影响的微生物群 图 8 土壤微生物群落的LEfSe差异分析 Fig. 8 LEfSe analysis of soil microbial communities |
基于属水平的相关性网络分析发现(图 9), 网络中传递性(transitivity)为0.694 6, 网络直径Diameter为3, 节点间平均最短路径长度为1.6, 共有184个有效节点(degree), 说明网络是连通的, 表明4个处理的土壤微生物之间存在相互作用.在所有节点中, 放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)占比最多, 分别占33.70%、21.74%和17.39%, 说明放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)与其他物种的相关性较密切.20个菌属间相关性程度不同, 其中有44个正相关关系和48个负相关关系.基于节点中心性(Degree Centrality), 该值最高的5个属为类诺卡式菌属(Nocardioides)、Streptomyces、Pyrinomonas、Candidatus_Solibacter和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium), 表明这些物种在网络中属于核心物种.
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1.unclassified_p__Candidatus_Rokubacteria, 2.Nitrososphaera, 3.unclassified_p__Chloroflexi, 4.Candidatus_Solibacter, 5.unclassified_d__bacteria, 6.unclassified_c__β-Proteobacteria, 7.Solirubrobacter, 8.Nocardioides, 9.unclassified_p__Acidobacteria, 10.unclassified_c__Actinobacteria, 11.Gemmatirosa, 12.Bradyrhizobium, 13.Streptomyces, 14.Conexibacter, 15.Sphingomonas, 16.Pyrinomonas, 17.Candidatus_Entotheonella, 18.Gemmatimonas, 19. unclassified_o__Solirubrobacterales, 20. Nitrospira; 网络中的节点表示所属门类, 每个节点的大小与特定属的相对丰度成正比; 节之间的红线表示正相关, 绿线表示负相关, 线的粗细表示相关的大小 图 9 土壤微生物属水平相关性网络图分析 Fig. 9 CorrNetwork analysis of genus level communities |
基于不同处理中微生物的EggNOG注释的功能分类显示, 有50%的功能与代谢相关(图 10).在代谢类别中, 氨基酸转运和代谢(amino acid transport and metabolism)是最丰富的类别, 其次是能量生成和转化(energy production and conversion), 以及碳水化合物的转运和代谢(carbohydrate transport and metabolism).碳水化合物的转运和代谢(carbohydrate transport and metabolism)在FWN0、FWN360、SWN0和SWN360处理中分别占24%、25%、25%和25%, 信号转导机制(signal transduction mechanisms)在FWN0、FWN360、SWN0和SWN360处理中分别占26%、25%、25%和24%, 复制、重组和修复(replication, recombination, and repair)在FWN0、FWN360、SWN0和SWN360处理中分别占23%、24%、26%和27%, 转录(transcription)在FWN0、FWN360、SWN0和SWN360处理中分别占24%、25%、26%和25%.咸水灌溉和氮肥施用提高碳水化合物转运和代谢及复制、重组和修复的相对丰度, 但降低信号转导机制的相对丰度.咸水灌溉提高转录的相对丰度, 氮肥施用对转录无影响.
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图 10 样本功能Circos图分析 Fig. 10 Analysis of sample function Circos diagram |
咸水灌溉与氮肥施用均显著影响土壤碳氮代谢的功能基因(图 11).在淡水灌溉条件下, 与FWN0处理相比, FWN360显著提高硝化基因(amoA、amoB、amoC、hao、nxrA)、反硝化基因(nirK、nirS、norC)和碳代谢基因(mcrA、pmoA)的相对丰度, 降低反硝化(napA、narB)的相对丰度.在咸水灌溉条件下, 与SWN0处理相比, SWN360处理显著提高N代谢相关酶硝化基因(nxrA、amoA、amoB、amoC、hao)和碳代谢基因(pmoA)的相对丰度, 显著降低反硝化基因(napA、nasA、norC、nosZ)的相对丰度.
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1. nasB, 2. narB, 3. napA, 4. nasA, 5. nirK, 6. nirS, 7. hao, 8. nxrB, 9. norC, 10. nosZ, 11. amoA, 12. amoB, 13. amoC, 14. nxrA, 15. mcrA, 16. pmoA 图 11 功能基因相对丰度 Fig. 11 Relative abundance of function genes |
在不施氮肥条件下, 与FWN0处理相比, SWN0处理显著提高反硝化基因(nirK、nirS、nasB、norC)和硝化基因(nxrA)的相对丰度, 降低硝化基因(amoB、amoC、nxrA)的相对丰度.在施氮肥条件下, 与FWN360处理相比, SWN360提高反硝化基因(nirK、nirS、nasB)的相对丰度, 降低反硝化(napA、nosZ)、硝化(amoA、amoC)和碳代谢(pmoA、mcrA)的相对丰度.
2.8 RDA分析微生物门水平群落与土壤理化性质间的关系如图 12所示.微生物门水平群落和土壤理化性质的RDA分析结果显示, 轴1和轴2解释群落结构总变异的85.95%和6.41%. FWN0和FWN360与SWN0和SWN360在轴1分开, 说明咸水灌溉能够显著改变土壤微生物门水平群落结构, FWN0与FWN360处理并未在轴2分开, 但SWN0和SWN360在轴2分开, 说明在咸水灌溉下氮肥施用能显著改变土壤微生物门水平群落结构.微生物门水平群落与SWC(解释度3.24%, P=0.010)、BD(解释度2.49%, P=0.004)和EC1∶5(解释度0.27%, P=0.003)、pH(解释度35.51%, P=0.010)、SOC(解释度51.94%, P=0.010)和AP(解释度14.25%, P=0.038)显著相关.
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1. Acidobacteria, 2. unclassified_d__Bacteria, 3. Planctomycetes, 4.Gemmatimonadetes, 5.Actinobacteria, 6.Cyanobacteria, 7.Firmicutes, 8.Proteobacteria, 9.Bacteroidetes, 10.Chloroflexi; 箭头显示具有统计意义的环境参数, 其中箭头的方向表示相关程度最高的方向, 箭头的长度表示相关的大小, 蓝色箭头表示土壤理化性质, 红色箭头表示土壤微生物 图 12 土壤微生物门水平群落结构与土壤理化性质间RDA分析 Fig. 12 RDA analysis of the correlation among soil microbial phylum communities with soil physical and chemical properties |
微生物属水平群落与土壤理化性质间的关系如图 13所示.微生物属水平群落和土壤理化性质的RDA分析结果显示, 轴1和轴2解释群落结构总变异的90.76%和4.88%, FWN0和FWN360与SWN0和SWN360在轴1分开, FWN0和SWN0与FWN360和SWN360在轴2分开, 说明咸水灌溉和氮肥施用均能显著改变土壤微生物属水平群落结构.微生物属水平群落与SWC(解释度7.52%, P=0.016)、BD(解释度6.46%, P=0.004)、EC1∶5(解释度2.83%, P=0.004)和pH(解释度30.04%, P=0.034)显著相关.
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1. Pyrinomonas, 2. unclassified_p__Acidobacteria, 3. unclassified_c__β-Proteobacteria, 4. unclassified_d__Bacteria, 5. unclassified_p__Chloroflexi, 6. Streptomyces, 7. Solirubrobacter, 8. Gemmatirosa, 9. Conexibacter, 10. Gemmatimonas; 箭头显示具有统计意义的环境参数, 其中箭头的方向表示相关程度最高的方向, 箭头的长度表示相关的大小, 蓝色箭头表示土壤理化性质, 红色箭头表示土壤微生物 图 13 土壤微生物属水平群落结构与土壤理化性质间RDA分析 Fig. 13 RDA analysis of the correlation among soil microbial genus communities with soil physical and chemical properties |
功能基因与土壤理化性质间的关系如图 14所示.功能基因和土壤理化性质的RDA分析结果显示, 轴1和轴2解释群落结构总变异的73.75%和15.82%, FWN0和FWN360与SWN0和SWN360在轴1分开, FWN0和SWN0与FWN360和SWN360在轴2分开, 说明咸水灌溉和氮肥施用均能显著改变微生物功能基因.功能基因与SWC(解释度41.66%, P=0.001)、BD(解释度38.25%, P=0.007)和EC1∶5(解释度66.64%, P=0.001)和AP(解释度14.25%, P=0.038)显著相关, 其中nirK、nxrA、nirS、nasB、norC、amoA、pmoA、hao、amoB和amoC与EC1∶5呈显著正相关, narB、nasA、napA、nosZ和mcrA与EC1∶5呈显著负相关.
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1.nirK, 2.nxrA, 3.nirS, 4.nasB, 5.norC, 6.amoA, 7.pmoA, 8.hao, 9.amoB, 10.amoC, 11.nxrB, 12.narB, 13.nasA, 14.napA, 15.nosZ, 16.mcrA箭头显示具有统计意义的环境参数, 其中箭头的方向表示相关程度最高的方向, 箭头的长度表示相关的大小, 蓝色箭头表示土壤理化性质, 红色箭头表示功能基因 图 14 功能基因与土壤理化性质间RDA分析 Fig. 14 RDA analysis of the correlation among function genes with soil physical and chemical properties |
淡水资源不足是全世界面临的严峻问题, 由于干旱区淡水资源匮乏, 使用咸水灌溉已成为维持干旱区农业可持续发展的必要手段.然而, 长期咸水灌溉会增加土壤盐分, 导致土壤盐渍化, 对土壤理化性质和养分转化产生不良影响.本研究发现, 咸水灌溉会增加土壤盐分、含水量和有机碳含量, 但降低土壤pH, 这是因为咸水灌溉带来的盐分会降低土壤水势, 导致作物受到盐分胁迫, 影响根系吸收水分, 从而使土壤含水量增加[24], 而土壤pH的下降, 主要是因为盐渍化土壤中强酸性离子(如NO3-、SO42-和Cl-)的积累[25].咸水灌溉会提高土壤有机碳含量, 因为持续的咸水灌溉后, 形成的盐渍化环境使土壤微生物活动减弱, 影响微生物矿化, 从而抑制有机质分解, 经过多年积累, 有机质含量增加[26].本研究还发现, 施氮会降低土壤含水量和pH, 因为氮肥会促进作物生长, 增加作物水分吸收和蒸腾作用[27], 从而提高土壤含水量, 土壤pH的降低, 原因可能是化学氮肥添加后土壤中尿素的氨化和硝化均会释放大量质子(H+), 从而降低土壤pH值[28].氮肥施用提高土壤有机碳和全氮含量, 因为施氮为微生物增殖提供了大量氮源, 也在一定程度上对土壤中微生物生物量的增加产生刺激作用, 使得土壤有机质含量进一步提高[29].本研究中氮肥施用显著降低土壤速效钾和速效磷含量, 原因是氮素对磷素有一定的协同作用, 土壤养分之间相互影响, 作物氮素的吸收会促进作物对速效磷和速效钾的利用, 从而降低土壤中速效磷和速效钾含量[30, 31].
干旱区淡水资源短缺, 咸水灌溉对土壤生态环境的影响正受到越来越多的关注.土壤微生物作为土壤养分循环的主要驱动力, 是评价土壤质量的重要指标, 在土壤养分循环中起着至关重要的作用, 包括有机质分解和土壤团聚体形成[32].盐分对土壤微生物群落活性、多样性和结构存在显著影响, 本研究发现咸水灌溉能够提高细菌和古菌的丰度, 原因可能是部分微生物对高盐环境具有一定适应性[33].咸水灌溉可以显著改变微生物群落结构, 原因可能是盐分影响土壤水分的可利用性, 导致土壤微生物活性和群落结构发生改变[34].氮肥也对土壤微生物有重要影响, 有研究发现氮肥施入土壤后很快发生固定, 被微生物同化供其吸收利用[35], 也有研究表明施氮会提高土壤微生物活性和数量[36, 37].本研究发现, 氮肥施用能够改变土壤微生物群落结构, 因为氮肥能够通过改变根系分泌物来间接影响土壤微生物群落结构[38], 施用氮肥还可以提高古菌丰度, 因为氮肥可为土壤古菌提供必需的养分[39].
盐分也会影响土壤微生物群落丰度和结构.本研究中不同处理的土壤微生物优势门类为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和芽单胞菌门, 这与Guo等[40]研究结果较为一致.咸水灌溉显著提高放线菌门、芽单胞菌门和厚壁菌门的丰度, 但降低硝化螺旋菌门、硝化螺菌属和疣微菌门的丰度.放线菌门是盐碱土壤中丰富的嗜盐细菌代表, 具有较好的耐盐性, 属于耐盐细菌[41], 因此放线菌对盐分有较好的适应性.厚壁菌门具有较好的耐盐性, 不易受盐分影响, 故盐分对其丰度有促进作用, 这与先前的研究结果相一致[42], 许多作物致病菌属于厚壁菌门[43], 说明咸水灌溉可能会增加土壤致病细菌, 进而对作物健康产生威胁.芽单胞菌在化学转化过程中具有很活跃的作用, 尤其是在高盐土壤中[44], 故咸水灌溉下芽单胞菌门的相对丰度高于淡水灌溉处理.硝化螺旋菌门和硝化螺菌属丰度的降低是因为硝化螺旋菌对盐分比较敏感, 在高盐环境下显著减少[45].疣微菌门是参与土壤氮循环的微生物类群[46], 咸水灌溉降低疣微菌门丰度, 说明咸水灌溉可能会对土壤氮循环产生不利影响.绿弯菌门营养型广泛, 不仅能通过光能和化能自养, 而且会利用各类元素, 推动元素的耦合循环[47], 本研究发现, 施氮能够显著提高绿弯菌门的丰度.氮肥施用还能显著提高硝化螺旋菌门、硝化螺菌属和亚硝化螺菌属的相对丰度, 这是因为施氮会提高土壤氮含量和有机质含量, 增加可供土壤微生物利用的碳源和氮源, 为细菌生物量的增加提供必需养分[39].在本研究中, 芽单胞菌属、类诺卡式菌属、红杆菌属、中慢生根瘤菌属和分支杆菌属为咸水灌溉下丰度较高的菌属, 其中芽单胞菌属归于芽单胞菌门, 可广泛分布在各种自然环境中[48], 可在恶劣环境下生存, 耐受高盐分环境[49], 中慢生根瘤菌属耐受的pH范围为4.0~10.0[50], 红杆菌属归于放线菌门, 有较强抗性, 故可适应高盐分环境.以上结果表明, 长期咸水灌溉和氮肥施用改变土壤微生物群落结构组成, 但由于对盐分和氮肥的耐受力不同, 不同微生物对盐分和氮肥的响应表现不一.
土壤微生物主要通过其功能基因的表达来调节土壤氮的转化, 盐分会导致土壤细菌群落功能发生变化[51].本研究发现, 咸水灌溉会促进反硝化基因nirK、nirS、nasB和norC的相对丰度, 抑制硝化基因amoB、amoC和nxrA的相对丰度, 这与硝化和反硝化菌群有关, 咸水中的Cl-会抑制硝化酶和硝化细菌的活性, 而耐盐反硝化菌群会在高盐度条件下进化[52].有研究表明, 盐分显著抑制反硝化基因nirK、nirS和nosZ的丰度[53], 这与本研究所得到的结论相反, 这是因为不同环境下的反硝化细菌种群不同, 不同反硝化细菌对盐分的耐受度不同.氮肥也会影响土壤微生物功能基因, 本研究发现, 氮肥施用会促进硝化基因amoA、amoB、amoC、hao和nxrA的相对丰度, 抑制反硝化基因narB、napA、nasA和nosZ的相对丰度, 这是因为适量氮肥有助于增加土壤微生物种群数量, 提高硝化细菌活性, 促进硝化作用[54].
土壤微生物中的细菌对土壤物质分解、转化和循环等有较大影响[55].土壤微生物群落与土壤理化性质密切相关, 本研究通过分析土壤微生物群落与土壤理化性质间的相关关系, 发现绿弯菌门与土壤有机碳和全氮含量显著正相关, 而与土壤速效磷含量显著负相关, 绿弯菌门与光合作用有关, 能在一定程度上促进作物生长发育[47].本研究发现, 厚壁菌门与土壤全氮显著正相关, 因此土壤全氮对厚壁菌群的丰度有促进作用, 这与以往的研究结果相一致[56]; 酸杆菌门在酸性环境及寡营养条件适合生存[57], 可作为土壤贫瘠的评价指标, 有研究表明酸杆菌门与土壤pH显著负相关[58], 这与本研究结果不一致, 本研究中酸杆菌门与土壤pH显著正相关, 酸杆菌门虽具有嗜酸的特点但也能够在中性和碱性环境中大量存活[59]; 芽单胞菌属与土壤全氮显著正相关, 与土壤速效磷显著负相关, 其适宜生长在中性环境条件下, 可以增加作物抗性, 抑制病原菌侵害[60]; 放线菌门与土壤有机碳和全氮呈显著正相关, 放线菌门在有机物分解和养分循环中发挥重要作用, 这与郑佳华等[61]的研究结果相一致; 有研究表明放线菌与速效钾呈极显著正相关, 细菌与有效磷、全钾、碱解氮呈极显著正相关[62], 本研究发现酸杆菌门(Acidobacteria)、蓝细菌(Cyanobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)与土壤速效钾呈显著正相关.RDA分析表明, 土壤盐分、容重和含水量是影响土壤微生物群落结构和功能基因的主导因子, 其中盐分对土壤微生物群落结构和功能基因影响最为显著.土壤微生物对盐分变化十分敏感, 当土壤盐分含量升高时, 盐胁迫直接改变了土壤微生物的生存环境, 导致土壤微生物受到渗透胁迫, 从而降低土壤微生物种群数量和活性[63].
4 结论(1) 长期咸水灌溉和氮肥施用显著改变土壤理化性质, 咸水灌溉提高土壤含水量、盐分、有机碳和全氮含量, 降低土壤pH和速效钾含量, 氮肥施用提高土壤有机碳和全氮含量, 降低土壤含水量、pH和速效钾含量.
(2) 咸水灌溉和氮肥施用显著改变土壤微生物群落组成, 咸水灌溉显著降低变形菌门、酸杆菌门、蓝细菌和硝化螺旋菌门的相对丰度, 显著增加放线菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门和厚壁菌门的相对丰度.氮肥施用显著增加绿弯菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度, 显著降低酸杆菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、蓝细菌、和疣微菌门的相对丰度.
(3) 咸水灌溉促进反硝化基因nirK、nirS、nasB和norC的相对丰度, 抑制硝化基因amoB、amoC和nxrA的相对丰度, 氮肥施用促进硝化基因amoA、amoB、amoC、hao和nxrA的相对丰度, 抑制反硝化基因narB、napA、nasA和nosZ的相对丰度.
(4) 长期咸水灌溉显著改变微生物群落结构, 氮肥施用降低土壤微生物群落的潜在生物标志物的数量, 土壤盐分、容重和含水量是影响土壤微生物群落结构和功能基因的主导因子.
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