2023, Vol. 44
2. 宁夏大学生态环境学院, 银川 750021
2. School of Ecology and Environment, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
玉米(Zea mays L.)是禾本科的一年生草本植物, 是人类重要的粮食和饲料作物.目前, 传统耕作(CT)是我国主要的耕作方式, 宁夏引黄灌区用传统耕作种植玉米.然而, 传统耕作会导致犁盘紧凑且封闭, 阻碍深层土层中土壤水、肥料和热量的循环, 会加速土壤侵蚀和土壤退化, 并严重影响生态系统功能[1, 2].为解决上述问题, 农业研究人员研究了多种耕作方式来提高土壤肥力, 保障土壤的可持续性利用性[3~5].粉垄耕作(DVRT)是我国实施的一种新的耕作方法, 它结合了深松、深耕、轮作和垂直耕作的优点[6], 广泛应用于不同气候带的耕地.DVRT由配备的6个垂直螺旋钻头的粉垄机械将土壤垂直粉碎至预期深度, 在不干扰土壤层和生产新的硬质盘的情况下打破压实的犁盘和松散土壤层, 形成更适合作物生长的土壤环境[7, 8].因此, 选择适宜的耕作方式, 对改变耕地土壤硬实度, 打破原有犁底层提升土壤质量有着非常重要的作用.
土壤微生物在维持生物多样性、改善土壤碳固存、提供生态系统功能和在农业生态系统中实现养分循环方面发挥着至关重要的作用[9].土壤微生物群落受耕作方法、气候、施肥和pH值等多种因素影响[10~12].已有研究表明, DVRT对土壤微生物群落结构和多样性产生有益的影响[13, 14].然而, CT的应用可能使土壤肥力下降, 并导致土壤微生物多样性下降[15].目前, 有关DVRT如何影响土壤微生物群落和生态系统功能的研究, 已成为相关科研工作者研究的热点.
分子生态网络分析技术是基于随机矩阵理论来研究生态系统内作用关系的一种方法[16].网络分析经常揭示可能反映社区组织的非随机共变模式.例如, 直接相互作用或共同的生态位, 并为调查难以在微生物群落中评估的生态概念提供解决途径[17], 对分类共现网络模式的分析提供了对关键种群以及生物群落中重要模块成员的新见解[18].分子生态网络分析还可用于探索间作土壤中微生物相互作用或反应的变化[19].有研究已经使用这种方法来检测微生物群落之间的共现关系, 如Sun等[20]对西藏地区对照和放牧条件的土壤微生物网络碳循环和氮循环基因进行分析, 发现放牧条件下的网络关键基因(模块枢纽和连通者)与对照显著不同.胡志娥等[21]研究表明, 长期覆膜促进了细菌和真菌共生网络中物种间的协同作用, 降低了物种间的相互竞争.此外, 陈兆进等[22]基于高通量测序的分子生态网路分析表明, 新乡市重金属污染土壤的关键细菌分别为: 节杆菌属、大理石雕菌、Nocardioides、Ferruginibacter、Flavitalea、硝化螺旋菌和Lysobacter等.然而, 针对宁夏引黄灌区中土壤细菌网络的互作分析还鲜有报道, 影响细菌网络结构的环境因子有待研究.
因此本研究中采用Illumina MiSeq技术和分子生态网络分析, 探讨了DVRT和CT对耕地土壤细菌多样性、群落组成结构及生态系统功能的影响, 以探究土壤环境因子与土壤细菌群落变化规律及其与细菌多样性的关系, 以期为探寻合理的耕作方式, 提升耕地质量, 改善土壤微生物功能提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 试验样地概况田间试验于2020年4~9月在宁夏回族自治区石嘴山市平罗县头扎村(38°55′52″N, 106°39′39″E) 进行, 属温带大陆性气候, 海拔为1 091 m, 年蒸发量为1 755 mm, 平均风速为2~3 m ·s-1, 年无霜期为171 d, 年降水量为184 mm, 年平均气温为8.21℃.试验区土壤为灌淤土. 2020年9月20日试验玉米收获并测产, 粉垄耕作处理玉米产量为9 096 kg ·hm-2, 传统耕作处理玉米产量为6 078 kg ·hm-2.土壤环境背景值：WC(含水率)为12.38%、pH为8.53、EC(电导率)为1.38 mS ·cm-1、ω[TOC(总有机碳)]为20.63 g ·kg-1、ω[TN(总氮)]为0.86 g ·kg-1、ω[AN(碱解氮)]为38.38 mg ·kg-1、ω[TP(总磷)]为0.58 g ·kg-1、ω[AP(有效磷)]为34.69 mg ·kg-1、ω[TK(总钾)]为20.63 g ·kg-1和ω[AK(有效钾)]为42.81 mg ·kg-1.
1.2 试验设计本研究对2种处理进行了评估, 即传统耕作(CT)和粉垄耕作(DVRT).这2种处理在1个完整的区组设计中每个重复4次, 总共8个小区.每块小区面积为67.5 m2(4.5 m×15 m), 四周设有保护行.试验中玉米品种为Dika 5.粉垄耕作于2020年4月11日进行, 所用机器为悬挂式粉垄机.传统耕作采用旋耕机进行作业.施用商业复合肥(N ∶P2O5 ∶K2O≈12% ∶25% ∶5%), 施用量为450 kg ·hm-2.试验田田间管理均一致. 2020年4月11日机械播种, 行距0.5 m, 株距0.25 m. 2020年6月22日第1次灌水, 2020年7月15日第2次灌水.
1.3 土壤样本采集土样采集时间为苗期(T1, 2020-05-22)、大喇叭口期(T2, 2020-07-15)和成熟期(T3, 2020-09-15), 每个时间点采用五点取样法在小区0~20 cm和20~40 cm土层进行3次重复采样取平均值.将装有样本的无菌袋运回实验室, 过2 mm筛网, 保存于-80℃, 以备后续DNA提取.收获期土壤风干后过2 mm筛网, 用于土壤理化性质的测定.
1.4 DNA抽提和PCR扩增各土层DVRT和CT一共36个土壤样品进行Illumina MiSeq测序.根据E.Z.N.A.® soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)说明书进行微生物总DNA抽提, 使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量, 使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度; 细菌引物采用338F (5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3′)[23], 扩增程序如下：95℃预变性3 min, 27个循环(95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s), 然后72℃稳定延伸10 min, 最后在4℃进行保存(PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型).PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL, 2.5 mmol ·L-1 dNTPs 2 μL, 上游引物(5 μmol ·L-1) 0.8 μL, 下游引物(5 μmol ·L-1) 0.8 μL, TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL, 模板DNA 10 ng, 补足至20 μL.
1.5 Illumina MiSeq测序和测序数据处理将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物, 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行回收产物纯化, 2%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用QuantusTM DVRTuorometer (Promega, USA)对回收产物进行检测定量.使用NEXTDVRTEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库.利用Illumina公司的MiSeq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司).
使用fastp[24]软件对原始测序序列进行质控, 使用FLASH[25]软件进行拼接.使用UPARSE软件, 根据97%[26]的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体.利用RDP classifier[27]对每条序列进行物种分类注释, 细菌比对Silva 16S rRNA数据库, 设置比对阈值为70%.
1.6 土壤理化分析土壤含水量(WC)采用烘干法测定; pH采用水浸提电位法测定; 电导率(EC)的测定采用5 ∶1的水土比浸提, 用DDS-308A电导仪进行测定; 总有机碳(TOC)由TOC仪器(multi N/C 2100S, Analytik Jena)测定; 总氮(TN)由凯氏定氮仪定量; 碱解氮(AN)采用碱解扩散法测定; 总磷(TP)采用酸溶-钼锑抗比色法测定; 有效磷(AP)采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法测定; 总钾(TK)采用NaOH碱熔-火焰光度计法测定; 有效钾(AK)采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定[28].
1.7 数据分析采用SPSS 18.0分析软件(SPSS Inc., 美国) 进行独立样本t检验.使用Canoco(5.0)用于冗余分析(RDA).使用MENAP (http://129.15.40.240/mena/) 构建生态网络.使用Cytoscape软件对导出数据网络进行可视化.主坐标分析(PCoA)、偏曼特尔检验(Partial Mantel test)、置换多因素方差分析(PERMANOVA), 使用R (Version 4.0.5) vegan制图表.
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质由表 1可知, 在0~20 cm土层中, CT处理中WC、TOC、TN、TP、AN、AP和TK含量均显著低于DVRT处理(P < 0.05), 但是pH和EC均显著高于DVRT处理(P < 0.05).在20~40 cm土层, CT处理中WC、TOC、TN、TP、AP和TK含量均显著低于DVRT处理(P < 0.05), 但是AN、pH和EC均显著高于DVRT处理(P < 0.05).
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表 1 不同土层土壤理化性质1) Table 1 Soil physicochemical properties of different soil layers |
2.2 不同耕作处理对细菌群落的影响
分析了Shannon指数和Ace指数, 以评估在不同耕作方式下耕地土壤细菌群落的α多样性. 如表 2所示, 在T1时期, 各土层DVRT处理的Ace指数显著高于CT处理; 在T2时期中, 0~20 cm土层的Shannon指数高于CT处理, 20~40 cm土层的Shannon指数和Ace指数均显著高于CT处理; 在T3时期, 各土层DVRT处理的Shannon指数和Ace指数均显著高于CT处理.
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表 2 不同生育期内土壤细菌群落多样性指数和丰富度估计量1) Table 2 Soil bacterial diversity index and community richness in different growth periods |
图 1为丰度排名前10的细菌门, 所有样本的优势门平均(相对丰度>5%)为: 放线菌门(26.53%)、变形菌门(20.32%)、绿弯菌门(17.65%)、酸杆菌门(17.03%)和芽单胞菌门(5.35%), 占微生物序列的86.87%.在0~20 cm土层中, T1时期DVRT的放线菌门和酸杆菌门丰度显著高于CT处理; T2时期DVRT的放线菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门丰度显著高于CT处理; T3时期DVRT的放线菌门丰度显著高于CT处理.在20~40 cm土层中, T2时期DVRT的放线菌门和拟杆菌门丰度显著高于CT处理, T1和T3时期DVRT和CT处理前10细菌门丰度不显著.分析不同土层和耕作方式下耕地土壤细菌群落的β多样性.细菌群落的PCoA (图 2)和置换多因素方差分析(表 3)表明, DVRT和CT处理显著影响不同土层和不同时期的土壤细菌群落分布, 并且不同土层下DVRT与CT处理细菌群落分离.总之, 在DVRT和CT处理下, 不同土层和耕作方式中土壤细菌群落的相对丰度和组成存在显著差异.
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同生育期的细菌门不同小写字母表示显着差异(t-text) 图 1 不同时期和不同处理下细菌群落门水平相对丰度 Fig. 1 Relative abundance on bacterial community at phylum level in different periods and treatments |
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图 2 不同处理下细菌群落组成的主坐标分析(PCoA) Fig. 2 Principal co-ordinates analysis (PCoA) of bacterial community composition under different treatments |
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表 3 基于Bray-Curtis距离的置换多因素方差分析1) Table 3 PERMANOVA based on Bray-Curtis distance |
2.3 影响土壤细菌网络结构的环境因子
为了研究土壤环境因子与细菌群落结构之间的关系, 进行了冗余分析(RDA), 揭示了上述环境因子的重要性及其对不同土层土壤细菌群落的影响(图 3).由图 3 (a)可知, 0~20 cm土层中, 环境因子对细菌群落的总解释量为91.41%, RDA1和RDA2的解释量分别为74.53%和16.88%, DVRT处理与TOC、AN和TP相关性较高, CT处理与EC和pH相关性较高.由图 3 (b)可知, 20~40 cm土层中, 环境因子对细菌群落的总解释量为98.52%, RDA1和RDA2的解释量分别为96.12%和2.40%, DVRT处理与AP、TK和TP相关性较高, CT处理与EC和pH相关性较高.使用基于Bray-Curtis距离的偏曼特尔检验来确定影响细菌群落的关键环境因子(表 4).其中, TP、pH和EC这3个指标的Pearson相关系数均在0.5≤ |r |≤1之间, 是高度线性相关的环境因子.进一步证实环境因子(TP、pH和EC)与细菌群落显著相关(P < 0.05). 因此, 本研究的TP、pH和EC是关键的环境因子, 对耕地土壤中的细菌群落有显著影响.
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(a)：1.Acidobacteriota, 2.Actinobacteriota, 3. Proteobacteria, 4.Nitrospirota, 5.Unclassified, 6.Myxococcota, 7.Bacteroidota, 8.Gemmatimonadota, 9.Verrucomicrobiota, 10. Firmicutes, 11. Latescibacterota, 12.Planctomycetota, 13.Desulfobacterota, 14. Chloroflexi, 15. Methylomirabilota; (b)：1.Desulfobacterota, 2.Unclassified, 3.Chloroflexi, 4.Nitrospirota, 5.Verrucomicrobiota, 6.Planctomycetota, 7.Acidobacteriota, 8. Methylomirabilota, 9.Actinobacteriota, 10.Firmicutes, 11.Proteobacteria, 12.Myxococcota, 13.Gemmatimonadota, 14.Bacteroidota, 15.Latescibacterota; 红色箭头连线表示环境因子, 蓝色箭头连线表示细菌门 图 3 16S rRNA基因与土壤特征的冗余分析(RDA) Fig. 3 Redundancy analysis (RDA) of 16S rRNA genes and soil characteristics |
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表 4 土壤细菌门水平与环境因子偏曼特尔检验结果1) Table 4 Partial Mantel test between soil bacterial community at phylum level and environmental factors |
2.4 DVRT和CT处理下土壤细菌群落的分子生态网络分析
为了揭示不同土层中DVRT和CT处理下的耕地土壤细菌群落结构的差异, 进行了从16S rRNA基因数据得出的pMENs分析(图 4), 基于RMT方法构建的4个网络的相关性阈值均为0.94, 并总结了网络的拓扑性质(表 5).基于经验生态网络的平均聚集系数和模块性, 均高于相应的随机网络, 表明DVRT和CT处理网络具有典型小世界的特征和模块化拓扑(表 5).不同土层中的DVRT处理的细菌网络节点数比CT处理的多, 物种间关系更加复杂(表 5).从pMENs中研究了DVRT和CT处理下的土壤中网络模块数.0~20 cm土层中, DVRT的可视化网络[图 4 (a)]和CT的可视化网络[图 4 (b)]处理方法分别具有30个模块和23个模块. 20~40 cm土层中, DVRT的可视化网络[图 4 (c)]和CT的可视化网络[图 4 (d)]处理方法分别具有30个模块和24个模块.本研究构建的4个网络均以正相关关系占优, 表明了各处理的细菌之间均以协同合作关系为主, 竞争关系较弱, 但不同土层DVRT网络规模大于CT, 粉垄耕作使耕地微生物之间的合作关系更强.
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大于5个节点的模块在各自的网络中用不同的颜色标记; 红色的链接表示负相关, 蓝色的链接表示正相关 图 4 RMT分析的耕地土壤中细菌群落的系统发育分子生态网络(pMENs) Fig. 4 Phylogenetic molecular ecology networks (pMENs) of bacterial communities in cultivated land soils based on RMT analysis |
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表 5 微生物分子生态网络特征参数 Table 5 Characteristic parameters of the molecular ecological network of soil microorganisms |
利用Zi-Pi图来显示基于DVRT和CT拓扑处理的土壤中的分布(图 5). 根据简化的分类, 网络中的所有节点在Zi=2.5和Pi=0.62的阈值下都分为4个象限.网络枢纽在第一象限, 均无节点.模块枢纽在第二象限, 与连接器的拥有连通性, 可以在本模块内和/或在不同模块之间连接不同的节点.外围节点在第三象限, 拥有大于97%的DVRT和CT处理的节点, 通常连接到本模块中的节点[29].连接器在第四象限, 是土壤细菌群落的关键微生物, 这些模块连接器与本模块中的许多节点高度连接.由图 5(a)可知, 0~20 cm土层中, DVRT处理的连接器为放线菌门(OTU 78).由图 5(b)可知, 20~40 cm土层中, DVRT处理的连接器为酸杆菌门(OTU 4494)和放线菌门(OTU 1314).CT处理均没有连接器.以上结果表明, DVRT处理极大地改变了本试验样地土壤中关键微生物的拓扑作用.
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图 5 土壤细菌网络的拓扑角色分布 Fig. 5 Topological role distribution map of bacterial networks |
不同的农业耕作方式可以影响土壤理化性质.李浩等[30]研究了粉垄耕作对宿根蔗和新植蔗生长过程中土壤养分含量影响, 得出粉垄耕作可以改善土壤理化性状, 提高速效氮磷含量.哈斯格日乐等[31]研究指出, 粉垄耕作相较于常规耕作降低了土壤电导率.孙美乐等[32]研究指出, 粉垄耕作改良了棉花不同时期的土壤结构, 增加了土壤含水量.以上发现与本研究结果一致, 即粉垄耕作可以降低耕地土壤pH和电导率, 使土壤养分含量得到提升.粉垄耕作可以提供给耕地疏松的土壤环境条件, 使土壤养分的循环增强, 并且土壤孔隙度的增加可以使盐分向下转移, 同时降低了pH值, 改善了耕地土壤盐渍化.然而, 在20~40 cm土层中, 粉垄耕作的碱解氮含量低于传统耕作, 可能的原因是, 粉垄耕作可以促进作物及其根系生长, 加速了作物对碱解氮的吸收与利用, 使这个土层的碱解氮含量降低.
土壤微生物受耕作方式影响[12, 33], 但关于粉垄耕作影响土壤微生态及其土壤环境的研究较少.周佳等[33]研究指出, 粉垄处理下水稻根际土壤细菌群落多样性香农指数显著高于免耕处理.本研究指出粉垄耕作可以增加不同生育期和不同土层的细菌群落结构的Shannon指数、Ace指数和优势菌门的丰度, 并且基于Bray-Curtis距离的PCoA和置换多因素方差分析结果表明, 不同生育期各处理组间散点分离, 这与覃锋燕等[13]和刘洪等[14]研究的结果相似.由此可知, 粉垄耕作改善了耕作层土壤环境, 使土壤细菌群落α多样性和β多样性也发生了改变.进一步采用RDA分析和偏曼特尔检验分析了不同耕作方式下土壤细菌群落与环境因子的关系, 筛选出了TP、EC和pH这3个高度相关的环境因子.已有研究指出, 土壤微生物群落结构和丰度受pH、EC和TP的影响[33~35].说明本研究中, 粉垄耕作通过改变土壤环境因子, 特别是pH、TP和EC, 进而改变了土壤细菌群落多样性.
农业生产中土壤生态系统功能受耕作方式影响, 不同的耕作方法导致细菌群落结构和丰度有所差异, 这可能表明不同耕作方法可能会影响土壤生态系统的功能群落[33, 36, 37].为了更好地揭示土壤细菌的相互作用, 本研究采用功能分子生态网络方法研究土壤微生物群落结构和功能, 评估了不同耕作方式和土层之间耕地土壤生态系统功能的差异.在生态系统中, 微生物以复杂的网络结构共存和相互作用[38].图 4揭示了2种耕作方式土壤细菌群落的不同结构.模块中的高度连接的微生物可能在群落内具有相似的生态特征[39].与传统耕作相比, 粉垄耕作的细菌群落组成分布和多样性更丰富, 并且具有更多功能模块和多样化的生态功能组.在分子生态网络中, 节点数、连接数和平均连通度用来指示网络的规模和复杂程度, 平均连通度越大表明网络节点之间具有更为复杂的联系[40].粉垄耕作的节点数较高, 其网络中物种间有共生关系[41], 表明不同土层中粉垄耕作的土壤细菌网络规模更大, 物种间关系更加复杂.网络中物种间的相互关系可描述为正相关和负相关, 正相关表示物种的生态位相同或具有共生关系, 负相关代表着竞争或捕食关系[42].粉垄耕作的网络正相关连线数高于传统耕作, 表明粉垄耕作加深了土壤微生物之间的合作.由此可推断, 当外界环境发生扰动时, 粉垄耕作细菌网络可以减缓扰动的传递, 使其结构保持稳定, 并且稳定的细菌网络可能改善参与土壤养分循环的细菌群落多样性, 这与胡晓婧等[16]研究结果相似.因此, 粉垄耕作比传统耕作的土壤更具组织性和多样化的生态功能组, 增强了土壤微生物对养分利用的能力, 使耕地微生态得到改善.
Zi-Pi图可以显示出不同耕作处理的拓扑作用(图 5), 也显示了土壤微生物网络中的关键节点, 这些关键节点称为通才[43].不同处理的OTU通才被分配到不同的模块枢纽和连接器, 具有连通性. 0~20 cm土层中, 粉垄耕作处理连接器的通才属于放线菌门. 20~40 cm土层中, 粉垄耕作处理连接器的通才属于放线菌门和酸杆菌门.它们可以在自己的模块内和/或在不同模块之间连接不同的节点, 表明这些通才可以在不同的耕作处理下塑造耕地土壤微生物群落.已有研究表明, 放线菌门可以降解土壤中各种不溶性有机物质以供细胞代谢所需的各种营养, 参与养分循环[44].酸杆菌门可以降解植物残体多聚物, 并参与单碳类化合物代谢[45].总之, 粉垄耕作改变了耕地中的特征性OTU和通才微生物的拓扑作用, 增强了土壤微生物网络的养分循环功能, 这可能是粉垄耕作改善耕地土壤微生物多样性和群落结构的重要因素之一.
本研究利用Illumina MiSeq测序技术结合分子生态网络, 对宁夏引黄灌区不同耕作方式的土壤细菌群落进行研究, 发现粉垄耕作改变了细菌网络结构和关键微生物, 改善了潜在的生态系统功能, 土壤电导率、pH值和全磷含量是影响耕地土壤细菌群落结构的主要环境因子.此外, 本研究仅关注了3个玉米生育期耕作土壤的细菌结构分析.未来应针对粉垄耕作对土壤养分和土壤微生态的变化进行长期定位研究, 还需要考虑对土壤团聚体、有机碳和土壤呼吸等方向进行深入研究, 以便全面了解粉垄耕作改善耕地土壤生态系统功能的机制.
4 结论(1) 粉垄耕作能有效提高各土层的土壤养分含量, 0~20 cm土层的WC、TOC、TN、TP、AN、AP和TK含量显著提高, 20~40 cm土层的WC、TOC、TN、TP、AP、AK和TK含量显著提高.粉垄耕作能降低各土层的土壤pH和EC.
(2) 采用高通量测序技术表明, 在不同生育期中, 粉垄耕作能够提升不同土层耕地土壤细菌的α多样性指数.在0~20 cm土层中, 粉垄耕作显著增加了苗期放线菌门和酸杆菌门的丰度, 大喇叭口期的放线菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门的丰度, 成熟期放线菌门的丰度; 在20~40 cm土层中, 显著增加了大喇叭口期的放线菌门和拟杆菌门的丰度.细菌β多样性分析发现, 土壤细菌群落分布受耕作方式的影响.筛选出EC、pH和TP是影响耕地土壤细菌群落分布的主要环境因子.
(3) 分子生态网络分析表明, 粉垄耕作改变了耕地中的特征性OTU和关键微生物的拓扑作用, 增强了土壤微生物网络的养分循环功能.
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