环境科学  2023, Vol. 44 Issue (2): 889-899   PDF    
低温下磁性载体MBBR系统微生物群落特征和功能预测分析
刘超, 李奇, 宋子洋, 胡鹏, 敬双怡, 李卫平     
内蒙古科技大学能源与环境学院, 包头 014010
摘要: 为阐明低温下磁性载体对移动床生物膜反应器(MBBR)处理能力的影响,探究了反应器内生物膜的微生物多样性、群落结构、功能特征和氮代谢通路.结果表明,与商用载体反应器(对照组)相比,磁性载体反应器具有更高的污染物去除率,其对NH4+-N和TN的平均去除率分别提高了16.2%和12.1%.Illumina高通量测序结果显示,磁性载体生物膜的微生物多样性和丰富度更高.由于不同微生物的磁化率不同,导致两种载体生物膜微生物群落结构存在显著差异.磁性载体生物膜中硝化菌属(如:NitrosomonasNitrospira)和反硝化菌属(如:SphaerotilusZoogloea)的相对丰度显著增多.PICRUSt2功能预测分析显示,磁性载体生物膜的整体基因功能表达水平更高,在信号传导机制和细胞内运输、分泌和囊泡运输等方面优势更明显.此外,大多数与氮代谢相关基因在磁性载体生物膜中丰度更高,如涉及硝化过程的基因amohao和反硝化过程基因napnor等,使得生物膜的低温脱氮潜力增强.以上结果从微观生物学角度更好地解释了反应器处理能力的差异,为磁性载体强化MBBR低温处理性能提供了理论依据.
关键词: 磁性载体      生物膜      高通量测序      微生物群落结构      基因功能预测     
Analysis of Microbial Community Characteristics and Function Prediction of MBBR with Magnetic Biocarriers at Low Temperature
LIU Chao , LI Qi , SONG Zi-yang , HU Peng , JING Shuang-yi , LI Wei-ping     
School of Energy and Environment, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010, China
Abstract: In order to clarify effect of magnetic biocarriers on the performance of MBBR at low temperatures, the microbial diversity, community structure, functional characteristics, and nitrogen metabolism of biofilm in the reaction system were investigated. The results indicated that MBBR with magnetic biocarriers had a better pollutant removal efficiency, with the average removal rates of NH4+-N and TN being 16.2% and 12.1% higher than those in the control group (commercial biocarriers), respectively. Illumina high-throughput sequencing analysis showed that higher diversity and richness of the bacterial community was established in the biofilm of magnetic biocarriers. There were obvious differences in microbial community structure of biofilm between the two biocarrier duos to bacterial magnetic susceptibility. The relative abundances of nitrifying bacteria (e.g., Nitrosomonas and Nitrospira) and denitrifying bacteria (e.g., Sphaerotilus and Zoogloea) were increased in the magnetic biocarriers. Functional prediction analysis with PICRUSt2 showed that the microorganism of magnetic biocarriers had a better total gene function expression level, which was significantly more increased than commercial biocarriers in gene-representing signal transduction mechanisms and intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport. Furthermore, most of the abundances of nitrogen metabolism genes were raised in the biofilm of magnetic biocarriers (e.g., genes amo and hao, were responsible for nitrification, and genes nap and nor, which were responsible for denitrification). Magnetic biocarriers increased biofilm potential for denitrification at low temperatures. Our results explained the difference in performance between the two reactors from microbiology and provided the theoretical basis for magnetic biocarrier-enhanced performances of MBBR at low temperatures.
Key words: magnetic biocarrier      biofilm      high-throughput sequencing      microbial community structure      gene function prediction     

在我国, 城镇污水处理厂的核心工艺普遍采用活性污泥法[1, 2].但其存在低温污水处理效能下降的问题, 主要表现在系统硝化能力不足, 进而限制了脱氮量[3].污水生物处理过程是通过一系列复杂的微生物代谢活动完成的, 低温会直接影响微生物的生长代谢, 对自养硝化菌的抑制作用尤为明显[4].近年来, 有些学者将磁强化技术应用于污水生物处理中, 发现合适强度的磁场能够提高系统的污染物去除率[5, 6].同时有研究表明, 磁强化后处理性能的提升主要是微生物作用.Zieliński等[7]研究发现8.1 mT磁场可提高氨氧化细菌的活性, 进而缩短了活性污泥的硝化时间.Xu等[8]研究表明30 mT磁场不仅能增加活性污泥中硝化菌属和反硝化菌属(Zoogloea)的丰度, 还能提高反硝化酶的活性及其编码基因的丰度.现有的研究结果阐述了磁场作用下系统处理性能与微生物酶活性及群落结构的关系, 但对微生物群落功能和代谢途径的深入认识有限.此外, 关于磁强化技术在污水生物处理方面的研究多集中于活性污泥系统, 而对生物膜系统及其微生物群落特征的研究较少.

基于高通量测序数据的PICRUSt功能预测分析因其结果可靠性高、成本低等优点, 已被广泛应用于污水处理系统中微生物群落功能的研究.Zhao等[9]利用PICRUSt预测表明聚酰胺可增加信号转导机制相关功能基因的丰度, 从而提高好氧颗粒污泥信号分子的分泌.Liu等[10]利用PICRUSt预测表明两级A/O-MBR处理垃圾渗滤液系统中含有大量的硝化和反硝化相关基因.余道道等[11]研究表明沸石能提高饥饿状态下厌氧氨氧化系统中信号传导通路和细胞防御机制相关功能基因的丰度, 进而促进厌氧氨氧化菌的恢复.因此微生物群落功能预测分析能够阐明出不同环境中微生物群落组成和功能之间的联系[12].移动床生物膜反应器(moving bed biofilm reactor, MBBR)能通过悬浮载体高效富集微生物, 增加反应器内的微生物多样性和丰富度, 从而提高污染物生物降解率, 常被应用于低温地区污水处理工艺中[13].本课题组采用熔融共混技术, 以聚乙烯颗粒和磁粉等原料制备了磁性载体, 克服了实际应用中磁粉易流失和磁铁规模小等问题.并初步证实磁性载体MBBR具有更高的硝化能性能.但是, 磁性载体MBBR处理低温污水系统中微生物群落功能预测的研究鲜见报道.

因此, 本研究在低温下构建磁性载体MBBR, 考察该反应器的污染物处理能力.采用16S rRNA基因高通量测序技术, 分析磁性载体生物膜微生物多样性、群落结构和功能菌群的变化特征.同时结合PICRUSt2功能预测, 重点分析微生物群落功能与群落结构之间的关系, 并构建磁性载体生物膜氮代谢通路.从微观生物学角度解析磁性载体的强化机制, 以期为磁性载体实际应用提供理论依据.

1 材料与方法 1.1 试验装置和运行方案

本试验采用2个相同的由有机玻璃制成的MBBR, 直径为30 cm, 高度为70 cm, 有效容积为46 L.装置如图 1所示.2个反应器并列运行, R1内投加磁性载体, R2内投加商用载体作为对照组, 载体填充率均为25%.磁性载体由课题组自制[14], 其表面磁感应强度约为0.5 mT.反应器挂膜启动采用排泥法, 接种污泥取自包头某市政污水处理厂的好氧池, 污泥MLSS约为6.8 g·L-1.

1.水箱, 2.进水管, 3.蠕动泵, 4.磁性载体, 5.商用载体, 6.曝气盘, 7.曝气泵, 8.出水管, 9.排泥管 图 1 试验装置示意 Fig. 1 Experimental device

本试验主要分析低温环境中磁性载体MBBR的处理性能和生物膜微生物特征.即在水温为(9±1)℃下连续运行42 d, 2个反应器运行条件相同.由蠕动泵调控进水流量, 使得HRT为10.5 h.采用曝气泵进行曝气, 由阀门控制曝气量保持反应器内DO为4.5~5.0 mg·L-1.pH值保持在7.5~8.0.通过控制室温维持试验所需水温.定期检测相关水质指标, 当反应器稳定运行后对生物膜进行高通量测序.

1.2 试验用水

本试验用水为人工配制的生活污水, 葡萄糖(C6H12O6)为碳源, 氯化铵(NH4Cl)为氮源, 磷酸二氢钾(KH2PO4)为磷源, 碳酸钠(NaHCO3)提供碱度, 并加入微量元素[15].本试验用水水质:COD为300~388 mg·L-1, ρ(NH4+-N)为20~33 mg·L-1, ρ(TP)为4.0~4.5 mg·L-1.

1.3 分析方法 1.3.1 常规指标

COD采用重铬酸钾法测定, NH4+-N采用纳氏试剂光度法测定, TN采用过硫酸钾消解紫外分光光度法测定[16].pH、DO和温度使用Multy 8330多功能水质分析仪(PONSEL, 法国)测定.

1.3.2 DNA提取、PCR扩增和高通量测序

取反应器稳定运行后(第40 d)的生物膜样本进行高通量测序.采用超声振荡将载体上生物膜脱落, 再置于干冰中送至上海美吉生物医药科技有限公司.使用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒(MP, 美国)提取生物膜总DNA, 提取后利用NanoDrop 2000检测DNA纯度和浓度, 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性[17].选用通用引物338F和806R对细菌16S rRNA基因的V3-V4可变区进行PCR扩增[18].反应完成后将同一样本的PCR产物混合, 使用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 并使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒(Axygen, 美国)对产物进行纯化和定量.使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit试剂盒(Illumina, 美国)构建MiSeq文库, 并使用Illumina MiSeq PE300平台进行高通量测序[19].

1.4 测序数据处理

将高通量测序得到的双端序列数据, 使用Trimmomatic软件进行质控过滤, 使用FLASH软件进行拼接.并使用UPARSE软件在97%的相似水平下对非重复序列进行OTUs聚类[20], 在聚类过程中去除单序列和嵌合体.为获得OTUs对应的物种分类信息, 基于QIIME平台和Silva数据库(https://www.arb-silva.de/), 采用RDP classifier对OTUs代表序列进行物种分类注释, 并分别在各个分类水平统计样本的群落组成.使用Mothur软件计算样本的Chao1和ACE(菌群丰度)、Shannon和Simpson(菌群多样性)等α多样性指数[21].基于测序数据使用PICRUSt2软件进行基因功能预测, 根据EggNOG数据库(http://eggnog.embl.de/)得到COG功能基因注释及其丰度, 根据KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)获得与氮代谢相关的功能基因及其丰度[22].

2 结果与讨论 2.1 污染物去除效果分析

图 2为运行期间反应器对COD和NH4+-N的去除效果.从中可知, 当水温为(9±1)℃时, 投加磁性载体的R1反应器对污染物去除率更高.运行稳定后(34~42 d), R1和R2的出水COD分别为(37±3)mg·L-1和(49±2)mg·L-1, 出水ρ(NH4+-N)分别为(7.60±0.75)mg·L-1和(11.94±1.33)mg·L-1.相较于R2, R1对COD和NH4+-N的去除率分别提高了3.6%和16.2%, 均存在极显著差异(独立样本T检验, P < 0.01).表明低温下磁性载体能够增强好氧生物膜的代谢活性, 从而提高反应器的污染物去除效果, 且对硝化能力的提升更为明显.此外, 稳定期间R1和R2对TN的去除率分别为38.1%和26.0%.在好氧MBBR中存在TN的去除, 说明2个反应器发生了稳定的同步硝化反硝化反应(SND)[23], 而在低温下磁性载体能显著提高生物膜的反硝化性能.

图 2 不同MBBR的出水水质和污染物去除率 Fig. 2 Characteristics of the effluent and the pollutant removal rate in the two MBBRs

2.2 微生物α多样性分析

当反应器稳定运行后, 对磁性载体和商用载体上生物膜的微生物进行高通量测序, 2组样本分别获得81 927和84 028条有效序列.按最小样本序列数抽平后, 2组样本有效序列统一为69 022条.OTUs聚类分析结果显示, 2组样本共得到1 479个OTUs, 其中共有的OTUs为896个, 磁性载体样本的OTUs比商用载体增多了215个.

通过样本的α多样性分析来反映不同载体上生物膜微生物群落的丰富度和多样性.表 1所列的指数为常用α多样性指数, 其中Chao1和Ace指数均与微生物群落丰富度呈正相关, Shannon指数与微生物群落多样性呈正相关, Simpson指数与微生物群落多样性呈负相关, Coverage指数反映微生物群落覆盖度.由表 1可知, 2组样本Coverage指数均达到0.98以上, 说明测序结果能代表样本中微生物的真实情况.磁性载体的Chao1、Ace和Shannon指数均高于商用载体, 且Simpson指数低于商用载体.说明磁性载体上生物膜的微生物丰富度和多样性均高于商用载体.这表明在低温环境中, 磁性载体可提高生物膜微生物多样性, 为反应器具有较好的污染物去除效果提供了菌群基础.

表 1 微生物α多样性指数 Table 1 Bacterial α-diversity index of biofilm samples

2.3 微生物群落结构分析

为了揭示磁性载体对生物膜微生物群落结构的影响, 本研究对2组样本的OTUs分别在门、纲和属水平上进行了分析.

2.3.1 门、纲水平微生物群落结构

在门水平上, 2组样本的细菌域共鉴定出36个菌门.磁性载体独有菌门为WS2、FCPU426和河床菌门(Zixibacteria), 商用载体独有菌门为克隆单胞菌门(Cloacimonadota), 但这4个独有菌门在各自样本中的含量都极低.2组样本共有菌门有32个, 说明两种载体生物膜中细菌门的种类相似.其中有8个菌门至少在1组样本中相对丰度大于1%, 为生物膜中的优势菌门.如图 3(a)所示, 磁性载体和商用载体生物膜中的主要优势菌门均为变形菌门(Proteobacteria, 60.19%和56.65%)、拟杆菌门(Bacteroidota, 15.68%和21.39%)和放线菌门(Actinobacteriota, 11.23%和12.83%), 三者总的相对丰度分别为86.93%和90.67%.其中, Proteobacteria占绝对优势, 该菌门是污水厂中最常见的优势菌, 在硝化/反硝化和有机物降解等方面发挥着重要作用[24~26], 其大量存在保证了2个反应器的正常运行.Bacteroidota作为第二优势菌门, 包含了降解复杂有机物的相关菌群[27].相较于商用载体, 磁性载体生物膜中Proteobacteria的相对丰度升高了3.54%, 而Bacteroidota的含量有所下降(5.75%).表明磁性载体能促进Proteobacteria的生长, 但对Bacteroidota有一定抑制作用, 体现磁场会对不同种类的微生物产生不同的影响[28].此外, 虽然生物膜中硝化螺旋菌门(Nitrospirota)的含量相对较少, 但其却是硝化过程的主要参与者[29].磁性载体生物膜中Nitrospirota的相对丰度(0.29%)高于商用载体的(0.18%), 说明低温下磁性载体有利于Nitrospirota的生长和富集.

图 3 门和纲水平微生物群落结构 Fig. 3 Microbial community structure at the phylum and class levels

在纲水平上2组样本共鉴定出96个菌纲.其中磁性载体独有菌纲为17个, 普通载体独有菌纲为4个.如图 3(b)所示, 共有优势菌纲主要包括γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、放线菌纲(Actinobacteria)和α-变形菌纲(α-Proteobacteria), 这些菌纲在不同生物膜中相对丰度之和均大于86%.有研究指出, 氨氧化细菌(ammonia oxidizing bacteria, AOB)主要隶属于β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria[30].相比于商用载体(44.07%), 磁性载体中γ-Proteobacteria的相对丰度升高至53.40%.

2.3.2 属水平群落结构

在属水平上2组样本共鉴定出559个菌属, 磁性载体独有菌属为93个, 普通载体独有菌属为58个.图 4(a)为优势菌属的相对丰度柱状图.从中可知, 不同载体生物膜的优势菌属及其相对丰度存在明显差异.磁性载体生物膜中含量最高的前3种菌属为球衣菌属(Sphaerotilus, 30.79%)、未标注的腐螺旋菌科(norank_f__Saprospiraceae, 5.01%)和黄杆菌属(Flavobacterium, 3.94%).而商用载体生物膜中含量最高的前3种菌属为假单胞菌属(Pseudomonas, 25.91%)、黄杆菌属(Flavobacterium, 15.19%)和中村氏菌属(Nakamurella, 10.41%).其中, Sphaerotilus具有固定重金属离子和好氧反硝化的能力, 能在好氧条件下将Fe2+氧化为Fe3+, 同时还原NO3--N[31].在本研究中, Sphaerotilus成为磁性载体生物膜的绝对优势菌属, 而在商用载体中的相对丰度仅为0.90%.胡智丰等[32]同样发现Sphaerotilus是铁基质生物载体的主要优势菌属, 且具有自养反硝化脱氮功能.这表明铁及其磁性氧化物有利于Sphaerotilus的生长繁殖.Pseudomonas为常见的反硝化菌属, 是商用载体生物膜的绝对优势菌属, 但在磁性载体中的相对丰度仅有0.70%.隶属于拟杆菌门的Flavobacterium具有较好的反硝化脱氮能力, 且能在低温环境中有效降解有机物[33].该菌属是两种载体生物膜的主要优势菌属, 但其在商用载体中的含量高于磁性载体.此外, 节杆菌属(Arthrobacter)具有异养硝化能力[34], 其仅在磁性载体生物膜中检出, 并成为了优势菌属(1.85%).由此可知, 磁性载体生物膜在属水平上的微生物群落结构发生了显著变化.这可能是由于每种细菌具有不同的磁化率(magnetic susceptibility)[35], 导致生物膜中各菌属对磁场的响应趋势不同.

(a)菌属相对丰度, (b)优势菌属层次聚类; ① 磁性载体1, ② 磁性载体2, ③ 商用载体1, ④ 商用载体2 图 4 属水平微生物群落结构 Fig. 4 Microbial community structure at the genus level

为进一步表明磁性载体生物膜微生物群落结构的变化特征, 对生物膜样本中相对丰度大于1%的菌属进行聚类, 并绘制成热图.如图 4(b)所示, 根据菌属在不同生物膜中分布规律, 可将其分为两大类.Cluster 1这类菌属的含量在磁性载体中较多, 而Cluster 2这类菌属的含量在商用载体中较多.说明磁性载体会促进Cluster 1中菌属的生长, 同时也会对Cluster 2中的菌属产生抑制作用, 从而造成了两种载体生物膜属水平微生物群落结构的显著差异.结合反应器处理效果分析, 表明磁性载体的生物膜微生物群落结构更有利于低温污水处理.

2.3.3 脱氮功能菌群

根据文献[36, 37]可得出, 2组样本中与生物脱氮过程相关的功能菌群包括氨氧化菌(AOB)、亚硝酸盐氧化菌(NOB)和反硝化菌(DNB), 其主要菌属的种类及相对丰度如表 2所示.

表 2 主要脱氮菌属相对丰度 Table 2 Relative abundance of key bacteria of the nitrogen removal at the genus level

由于受到低温的抑制作用, 2组样本中AOB和NOB的含量均较低.但相比于商用载体中AOB(0.16%)和NOB(0.19%), 磁性载体生物膜中AOB和NOB的相对丰度分别增加至2.30%和0.33%.共有的AOB主要包括Ellin6067、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和突柄杆菌属(Prosthecobacter)[38], NOB主要为硝化螺菌属(Nitrospira).同时, 磁性载体生物膜中存在MND1、节杆菌属(Arthrobacter)和硝基念珠菌属(Candidatus_Nitrotoga)这3种独有的硝化菌属.体现出硝化菌倾向于在磁场条件下生长, 与Li等[39]的研究结果一致.以上结果表明低温下磁性载体可以高效富集硝化菌, 提高生物膜中硝化菌的含量.此结果与前文中R1反应器具有更好的硝化性能相吻合.

2组样本中均检测到多种反硝化菌(DNB), 这为好氧MBBR中发生稳定的SND现象提供了微观基础.磁性载体和商用载体生物膜中的优势DNB菌属分别为球衣菌属(Sphaerotilus)和假单胞菌属(Pseudomonas), 这两种菌属均被报道具有好氧反硝化能力.其他含量较高的典型DNB, 包括黄杆菌属(Flavobacterium)、动胶菌属(Zoogloea)、芽殖杆菌属(Gemmobacter)和食酸菌属(Acidovorax)等, 但在不同载体生物膜中的相对丰度存有差异.鞘脂杆菌属(Terrimonas)和独岛菌属(Dokdonella)属于好氧反硝化菌, 它们在磁性载体生物膜中的相对丰度分别为1.09%和1.04%, 均高于商用载体(0.85%和0.84%).同时生物膜中存在少量的自养反硝化菌, 包括噬氢菌属(Hydrogenophaga)、铁锈菌属(Ferruginibacter)和发硫菌属(Thiothrix)等[40].大多数DNB为异养兼性厌氧菌, 在好氧条件下仍能保持较为丰富的多样性.此外, 生物膜中存在DO梯度, 可为内部生长的反硝化菌提供缺氧条件[41].加之生物膜中存在好氧反硝化菌, 两者协同促使SND现象的发生.低温环境中硝化过程是制约整个生物脱氮的关键因素[42], 因此磁性载体在促进生物膜硝化性能的同时, 也会加快反硝化过程的发生, 这也是R1反应器脱氮效率更高的主要原因.

2.4 微生物群落功能预测分析 2.4.1 COG功能基因注释

为了获得不同载体生物膜的微生物群落功能, 本研究使用PICRUSt2进行了COG功能预测.如图 5(a)所示, 2组样本均预测得到23种COG功能, 可分为四大类:代谢(metabolism); 信息储存和处理(information storage and processing); 细胞过程和信号(cellular processes and signaling); 贫乏特征(poorly characterized).其中代谢相关基因在2组样本中丰度最高, 是生物膜微生物的基础功能.

(a)基因丰度分类统计; (b)样本差异性分析 图 5 COG功能预测分析 Fig. 5 Analysis of COG functional prediction

从COG子类上分析, 磁性载体生物膜的总体功能要优于商用载体.除了[Z]细胞骨架, 其他22种COG功能在磁性载体的基因丰度都高于商用载体.功能基因丰度较高的依次为[S]功能未知、[E]氨基酸运输和代谢和[C]能量生产和转换.氨基酸运输和代谢主要参与氨基酸分解转化和蛋白质合成, 为微生物提供必需的能量和碳源[43].较高水平的氨基酸代谢也有利于生物脱氮[44].其次为[M]细胞壁/膜/质膜形成、[J]翻译、核糖体结构和生物发生、[P]无机离子运输和代谢、[G]碳水化合物运输和代谢以及[T]信号转导机制等功能.其中, 核糖体为蛋白质产生的场所, 这意味着磁性载体能促进细胞合成蛋白质, 完成良好的代谢和信号传导[45].信号传导机制能够产生信号分子加强各功能体间的交流, 调控细菌生化反应和群体行为, 来应对低温环境造成的影响.综上, 低温下磁性载体能够刺激微生物细胞的功能基因表达, 促进微生物间的信息交流和微生物的生长代谢, 使得生物膜保持较高的活性.这也进一步解释了R1反应器污染物去除效果更好的现象.

对不同生物膜样本COG功能基因的相对丰度进行差异检验, 分析磁性载体对微生物群落功能结构的影响, 结果如图 5(b)所示.从中可知, 不同样本中除[V]防御机制无显著差异(P>0.05), 其余功能基因的相对丰度都存有极显著差异(P < 0.01).同时发现磁性载体中22种COG功能基因丰度的增加程度不同.磁性载体对[T]信号转导机制、[U]细胞内运输、分泌和囊泡运输、[N]细胞运动、[M]细胞壁/膜/质膜形成以及[I]脂质运输和代谢等功能的促进作用更大, 导致[S]功能未知、[E]氨基酸运输和代谢以及[P]无机离子运输和代谢等功能的相对丰度低于商用载体.结合上文分析, 表明磁性载体主要通过促进细胞过程和信号传导方面功能基因的表达, 调节生物膜微生物菌群的互作关系, 进而增强低温下微生物的繁殖和代谢活动.

2.4.2 氮代谢功能基因

从基因的角度能够更好地解析磁性载体对生物脱氮过程的影响.因此本研究利用PICRUSt2对参与氮代谢的相关功能基因进行了预测分析.通过与KEGG库中65个直系同源基因(KEGG Orthology)对比, 2组样本均获得48个氮代谢功能基因, 体现出生物膜较丰富的氮代谢多样性.其中33个基因在磁性载体生物膜中的丰度高于商用载体.进一步分析发现, 生物膜中主要存在着硝化、反硝化、异化硝酸盐还原和同化硝酸盐还原等氮代谢通路, 但厌氧氨氧化的相关功能基因未检测到(图 6图 7).

图 6 氮代谢功能基因丰度 Fig. 6 Abundance of the functional genes for nitrogen metabolism

扇形面积表示不同生物膜中各基因丰度的比例 图 7 生物膜中主要氮代谢通路 Fig. 7 Main pathways of nitrogen metabolism in the biofilm samples

图 6可知, 硝化过程所涉及的相关功能基因有amo(amoA/B/C)、haonxr(nxrA/B). amo编码的氨单加氧酶(AMO)能将NH4+-N氧化为NH2OH, 同时NH2OH在hao编码的羟胺氧化还原酶(HAO)催化下迅速氧化为NO2-. nxr编码的亚硝酸盐氧化还原酶能最终将NO2-氧化为NO3-.前两种酶催化发生的氨氧化是硝化过程的限速步骤[46].且有研究表明amo丰度与氨氧化速率呈正相关[47].在磁性载体生物膜中amohao的丰度相对较高, 而nxr的丰度相对较低.表明磁性载体能够增加amohao的丰度, 加快氨氧化速率, 从而推动整个硝化过程的进行.

与反硝化过程有关的基因包括nar(narG/H/I)、nap(napA/B)、nir(nirK/S)、nor(norB/C)和nosZ.narnap是参与反硝化过程第一步的两种关键基因, 分别编码不同类型异化硝酸盐还原酶, 负责将NO3-还原为NO2-. nap的丰度在磁性载体生物膜中更多, 而nar基因变化趋势相反, 其丰度在磁性载体中略有下降.说明磁场可能会影响不同硝酸盐还原酶的合成, 导致发生不同的还原反应.这也与两种载体生物膜中脱氮菌群结构差异相一致. nir编码的亚硝酸盐还原酶(NIR)可进一步将NO2-还原为NO, 其在商用载体生物膜中的丰度相对较高.nornosZ分别编码一氧化氮还原酶(NOR)和一氧化二氮还原酶(NOS), 对应参与NO还原和N2O还原过程, 完成整个反硝化过程.这两种基因的丰度均在磁性载体生物膜中更高.这也表明磁性载体具有降低反硝化过程中NO和N2O温室气体释放的可能性[48].同时, 生物膜中还存在大量有关异化硝酸盐还原的基因(nirB/DnrfA/H)和同化硝酸盐还原的基因(narBNRnasA/BnirA).其中异化硝酸盐还原可作为微生物的呼吸作用, 同化硝酸盐还原可将氮素转化为生物质, 这两个过程都能将NO2-还原为NH4+-N.本研究结果表明, 在磁场刺激下生物膜中几种关键氮代谢功能基因的丰度得到了提升, 使得硝化/反硝化作用的潜在能力更强.并结合群落功能水平、脱氮菌群结构和群落多样性分析, 从微观生物学角度初步解析了磁性载体提高MBBR低温处理性能的作用机制.

3 结论

(1) 相比于商用载体, 磁性载体能增强MBBR处理低温污水的能力.其对COD、NH4+-N和TN的平均去除率分别提高了3.6%、16.2%和12.1%, 硝化/反硝化性能改善尤为显著.

(2) 磁性载体MBBR中具有更高的生物膜微生物多样性.同时磁性载体有利于硝化菌和部分反硝化菌(SphaerotilusZoogloeaTerrimonasDokdonella等)的生长富集, 为系统高效脱氮提供菌群基础.

(3) 磁性载体能促进生物膜微生物功能基因表达的上调, 特别是信号传导机制功能方面, 进而通过调节菌群互作关系增强生物膜对低温的适应性.此外, 磁性载体还能提升关键氮代谢基因(amohaonap等)的丰度, 使得生物膜硝化/反硝化潜在能力增强.

参考文献
[1] 张冰, 吴林蔚, 文湘华. 全国城市污水处理厂中微生物群落的溯源分析[J]. 环境科学, 2019, 40(8): 3699-3705.
Zhang B, Wu L W, Wen X H. Potential source environments for microbial communities in wastewater treatment plants (WWTPs) in China[J]. Environmental Science, 2019, 40(8): 3699-3705.
[2] 贺赟, 李魁晓, 王佳伟, 等. 不同季节城市污水处理厂微生物群落特性[J]. 环境科学, 2021, 42(3): 1488-1495.
He Y, Li K X, Wang J W, et al. Microbial community structure of waste water treatment plants in different seasons[J]. Environmental Science, 2021, 42(3): 1488-1495.
[3] 韩文杰, 吴迪, 周家中, 等. 长三角地区MBBR泥膜复合污水厂低温季节微生物多样性分析[J]. 环境科学, 2020, 41(11): 5037-5049.
Han W J, Wu D, Zhou J Z, et al. Microbial diversity analysis of WWTPs based on hybrid-MBBR process in a low temperature season in the Yangtze river delta[J]. Environmental Science, 2020, 41(11): 5037-5049.
[4] Antoniou P, Hamilton J, Koopman B, et al. Effect of temperature and pH on the effective maximum specific growth rate of nitrifying bacteria[J]. Water Research, 1990, 24(1): 97-101. DOI:10.1016/0043-1354(90)90070-M
[5] Ma B R, Wang S, Li Z W, et al. Magnetic Fe3O4 nanoparticles induced effects on performance and microbial community of activated sludge from a sequencing batch reactor under long-term exposure[J]. Bioresource Technology, 2017, 225: 377-385. DOI:10.1016/j.biortech.2016.11.130
[6] Hu B, Wang Y L, Quan J N, et al. Effects of static magnetic field on the performances of anoxic/oxic sequencing batch reactor[J]. Bioresource Technology, 2020, 309. DOI:10.1016/j.biortech.2020.123299
[7] Zieliński M, Cydzik-Kwiatkowska A, Zielińska M, et al. Nitrification in activated sludge exposed to static magnetic field[J]. Water, Air, & Soil Pollution, 2017, 228(4). DOI:10.1007/s11270-017-3316-6
[8] Xu D, Ji H M, Ren H Q, et al. Inhibition effect of magnetic field on nitrous oxide emission from sequencing batch reactor treating domestic wastewater at low temperature[J]. Journal of Environmental Sciences, 2020, 87: 205-212. DOI:10.1016/j.jes.2019.05.014
[9] Zhao L J, Su C Y, Liu W H, et al. Exposure to polyamide 66 microplastic leads to effects performance and microbial community structure of aerobic granular sludge[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2020, 190. DOI:10.1016/j.ecoenv.2019.110070
[10] Liu J B, Zhang P Y, Tian Z Y, et al. Pollutant removal from landfill leachate via two-stage anoxic/oxic combined membrane bioreactor: Insight in organic characteristics and predictive function analysis of nitrogen-removal bacteria[J]. Bioresource technology, 2020, 317. DOI:10.1016/j.biortech.2020.124037
[11] 余道道, 孙敬起, 霍唐燃, 等. 沸石载体恢复受饥饿影响厌氧氨氧化菌的性能研究[J]. 北京大学学报(自然科学版), 2021, 57(3): 507-516.
Yu D D, Sun J Q, Huo T R, et al. Effect of zeolite on recovery of anammox bacteria affected by starvation[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, 2021, 57(3): 507-516.
[12] Zhang L H, Zhang M S, You S J, et al. Effect of Fe3+ on the sludge properties and microbial community structure in a lab-scale A2O process[J]. Science of the Total Environment, 2021, 780. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.146505
[13] 李韧, 于莉芳, 张兴秀, 等. 硝化生物膜系统对低温的适应特性: MBBR和IFAS[J]. 环境科学, 2020, 41(8): 3691-3698.
Li R, Yu L F, Zhang X X, et al. Adaptability of nitrifying biofilm systems to low temperature: MBBR and IFAS[J]. Environmental Science, 2020, 41(8): 3691-3698.
[14] 敬双怡, 刘超, 侯娜, 等. 一种磁性亲电型悬浮生物载体及制备方法[P]. 中国专利: CN 112520839A, 2021-03-19.
[15] 孙洪伟, 陈翠忠, 高宇学, 等. 碳氮比对活性污泥胞外聚合物的长期影响[J]. 中国环境科学, 2018, 38(3): 950-958.
Sun H W, Chen C Z, Gao Y X, et al. Effect of C/N ratio on extracellular polymeric substance (EPS) in the sequencing batch reactor (SBR)[J]. China Environmental Science, 2018, 38(3): 950-958.
[16] 国家环境保护总局. 水和废水监测分析方法[M]. (第四版). 北京: 中国环境科学出版社, 2002.
[17] 涂晨, 田媛, 刘颖, 等. 大连海岸带夏、秋季大气沉降(微)塑料的赋存特征及其表面生物膜特性[J]. 环境科学, 2022, 43(4): 1821-1828.
Tu C, Tian Y, Liu Y, et al. Occurrence of atmospheric (Micro) plastics and the characteristics of the plastic associated biofilms in the coastal zone of Dalian in summer and autumn[J]. Environmental Science, 2022, 43(4): 1821-1828.
[18] Tan Z, Liu Y W, Liu H Y, et al. Effects of 5-hydroxymethylfurfural on removal performance and microbial community structure of aerobic activated sludge treating digested swine wastewater[J]. Journal of Environmental Chemical Engineering, 2021, 9(5). DOI:10.1016/j.jece.2021.106104
[19] 崔丙健, 高峰, 胡超, 等. 不同再生水灌溉方式对土壤-辣椒系统中细菌群落多样性及病原菌丰度的影响[J]. 环境科学, 2019, 40(11): 5151-5163.
Cui B J, Gao F, Hu C, et al. Effect of different reclaimed water irrigation methods on bacterial community diversity and pathogen abundance in the soil-pepper ecosystem[J]. Environmental Science, 2019, 40(11): 5151-5163.
[20] Zhao L J, Su C Y, Wang A L, et al. Comparative study of aerobic granular sludge with different carbon sources: effluent nitrogen forms and microbial community[J]. Journal of Water Process Engineering, 2021, 43. DOI:10.1016/j.jwpe.2021.102211
[21] Wei H W, Wang L H, Hassan M, et al. Succession of the functional microbial communities and the metabolic functions in maize straw composting process[J]. Bioresource Technology, 2018, 256: 333-341.
[22] Cheng Y, Chon K, Ren X H, et al. Contributions of enhanced endogenous microbial metabolism via inoculation with a novel microbial consortium into an anoxic side-stream reactor to in-situ sludge reduction for landfill leachate treatment[J]. Journal of Environmental Management, 2021, 295. DOI:10.1016/j.jenvman.2021.113088
[23] Mao Y J, Quan X, Zhao H M, et al. Accelerated startup of moving bed biofilm process with novel electrophilic suspended biofilm carriers[J]. Chemical Engineering Journal, 2017, 315: 364-372.
[24] Yuan Y, Zhou Z, Jiang J, et al. Partial nitrification performance and microbial community evolution in the membrane bioreactor for saline stream treatment[J]. Bioresource Technology, 2021, 320. DOI:10.1016/j.biortech.2020.124419
[25] Ye L, Shao M F, Zhang T, et al. Analysis of the bacterial community in a laboratory-scale nitrification reactor and a wastewater treatment plant by 454-pyrosequencing[J]. Water Research, 2011, 45(15): 4390-4398.
[26] Hu M, Wang X H, Wen X H, et al. Microbial community structures in different wastewater treatment plants as revealed by 454-pyrosequencing analysis[J]. Bioresource Technology, 2012, 117: 72-79.
[27] 刘春, 王聪聪, 陈晓轩, 等. 微气泡曝气生物膜反应器处理低C/N比废水脱氮过程[J]. 环境科学, 2019, 40(2): 754-760.
Liu C, Wang C C, Chen X X, et al. Biological nitrogen removal process in a microbubble-aerated biofilm reactor treating low C/N wastewater[J]. Environmental Science, 2019, 40(2): 754-760.
[28] Zhao B, Sha H, Li J W, et al. Static magnetic field enhanced methane production via stimulating the growth and composition of microbial community[J]. Journal of Cleaner Production, 2020, 271. DOI:10.1016/j.jclepro.2020.122664
[29] 刘雨馨, 王建芳, 钱飞跃, 等. 低温下全自养脱氮颗粒污泥适应低基质效能[J]. 环境科学, 2020, 41(9): 4161-4168.
Liu Y X, Wang J F, Qian F Y, et al. Adaptability of completely autotrophic nitrogen removal over granular sludge to low-strength at low temperature[J]. Environmental Science, 2020, 41(9): 4161-4168.
[30] Chen Z G, Wang X J, Yang Y Y, et al. Partial nitrification and denitrification of mature landfill leachate using a pilot-scale continuous activated sludge process at low dissolved oxygen[J]. Bioresource Technology, 2016, 218: 580-588.
[31] Deng S H, Li D S, Yang X, et al. Biological denitrification process based on the Fe(0)-carbon micro-electrolysis for simultaneous ammonia and nitrate removal from low organic carbon water under a microaerobic condition[J]. Bioresource Technology, 2016, 219: 677-686.
[32] 胡智丰, 邓时海, 张超, 等. 集成式铁基质生物膜反应器自养反硝化深度脱氮[J]. 化工学报, 2020, 71(7): 3304-3312.
Hu Z F, Deng S H, Zhang C, et al. Advanced nitrogen removal of autotrophic denitrification by integrated iron substrate biofilm reactor[J]. CIESC Journal, 2020, 71(7): 3304-3312.
[33] Dong X Q, He Y Z, Peng X X, et al. Triclosan in contact with activated sludge and its impact on phosphate removal and microbial community[J]. Bioresource Technology, 2021, 319. DOI:10.1016/j.biortech.2020.124134
[34] Ho K L, Chung Y C, Tseng C P. Continuous deodorization and bacterial community analysis of a biofilter treating nitrogen-containing gases from swine waste storage pits[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(8): 2757-2765.
[35] Zhu Y M, Xu D, Ren H Q, et al. Metagenomic insights into the "window" effect of static magnetic field on nitrous oxide emission from biological nitrogen removal process at low temperature[J]. Journal of Environmental Management, 2021, 298. DOI:10.1016/j.jenvman.2021.113377
[36] Li S, Li D, Zhang S R, et al. Effect of aeration modes on simultaneous nitrogen and phosphorus removal and microbial community in a continuous flow reactor with granules[J]. Bioresource Technology, 2019, 294. DOI:10.1016/j.biortech.2019.122154
[37] Liu T, He X L, Jia G Y, et al. Simultaneous nitrification and denitrification process using novel surface-modified suspended carriers for the treatment of real domestic wastewater[J]. Chemosphere, 2020, 247. DOI:10.1016/j.chemosphere.2020.125831
[38] Gonzalez-Martinez A, Rodriguez-Sanchez A, Garcia-Ruiz M J, et al. Performance and bacterial community dynamics of a CANON bioreactor acclimated from high to low operational temperatures[J]. Chemical Engineering Journal, 2016, 287: 557-567.
[39] Li M Q, Zhang J, Liang S, et al. Novel magnetic coupling constructed wetland for nitrogen removal: Enhancing performance and responses of plants and microbial communities[J]. Science of the Total Environment, 2022, 819. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.152040
[40] 李冬, 杨敬畏, 李悦, 等. 缺氧/好氧交替连续流的生活污水好氧颗粒污泥运行及污染物去除机制[J]. 环境科学, 2021, 42(5): 2385-2395.
Li D, Yang J W, Li Y, et al. Aerobic granular sludge operation and nutrient removal mechanism from domestic sewage in an anaerobic/aerobic alternating continuous flow system[J]. Environmental Science, 2021, 42(5): 2385-2395.
[41] Mattei M R, Frunzo L, D'Acunto B, et al. Modelling microbial population dynamics in multispecies biofilms including Anammox bacteria[J]. Ecological Modelling, 2015, 304: 44-58.
[42] 王少伦, 杨宏. 高效包埋硝化活性填料硝化特性及应用研究[J]. 化工学报, 2020, 71(5): 2305-2311.
Wang S L, Yang H. Nitrification characteristics and application research of high-efficiency embedded filler[J]. CIESC Journal, 2020, 71(5): 2305-2311.
[43] Zheng M S, Zhou N, Liu S F, et al. N2O and NO emission from a biological aerated filter treating coking wastewater: main source and microbial community[J]. Journal of Cleaner Production, 2019, 213: 365-374.
[44] 唐琳钦, 王安柳, 宿程远, 等. 不同氮源对好氧颗粒污泥理化特性及微生物群落影响[J]. 广西师范大学学报(自然科学版), 2021, 39(2): 144-153.
Tang L Q, Wang A L, Su C Y, et al. Effects of different nitrogen sources on physicochemical properties and microbial community of aerobic granular sludge[J]. Journal of Guangxi Normal University (Natural Science Edition), 2021, 39(2): 144-153.
[45] 王晓曈, 杨宏. 基于粒径分化的厌氧氨氧化污泥性能与微生物多样性分析[J]. 环境科学, 2021, 42(4): 1930-1938.
Wang X T, Yang H. Analysis of performance and microbial diversity of ANAMMOX sludge based on particle size differentiation[J]. Environmental Science, 2021, 42(4): 1930-1938.
[46] Li K, Qian J, Wang P F, et al. Differential responses of encoding-amoA nitrifiers and nir denitrifiers in activated sludge to anatase and rutile TiO2 nanoparticles: What is active functional guild in rate limiting step of nitrogen cycle?[J]. Journal of Hazardous Materials, 2020, 384. DOI:10.1016/j.jhazmat.2019.121388
[47] Sun H W, Shi W Y, Cai C J, et al. Responses of microbial structures, functions, metabolic pathways and community interactions to different C/N ratios in aerobic nitrification[J]. Bioresource Technology, 2020, 311. DOI:10.1016/j.biortech.2020.123422
[48] Feng C W, Li Z H, Zhu Y M, et al. Effect of magnetic powder on nitrous oxide emissions from a sequencing batch reactor for treating domestic wastewater at low temperatures[J]. Bioresource Technology, 2020, 315. DOI:10.1016/j.biortech.2020.123848