2023, Vol. 44
2. 西安理工大学水利水电学院, 西安 710048
2. Institute of Water Resources and Hydro-Electric Engineering, Xi'an University of Technology, Xi'an 710048, China
细菌是水生生态系统的重要组成部分, 在生物地球化学循环中起着不可替代的作用[1].比如, 细菌通过利用溶解的有机化合物并将其转化为对自养生物有用的无机化学物质来维持水生生态系统的生产力[2].细菌通过同化和异化等代谢过程完成碳、氮和磷等元素的降解, 也可以促进有机物的降解和污染物的转化, 从而维持水生生态系统的平衡[3].例如, 蓝藻门会导致水体富营养化严重, 被污染水体可能出现食物链污染, 对生态系统造成重大的环境威胁[4]; 当在废水和废弃物厌氧处理系统中起重要作用的厚壁菌门存在时, 说明水体已经面临污染胁迫[5], 与氮和甲烷代谢相关的浮游细菌在水生生态系统中发挥着不成比例的重要作用, 尽管它们在细菌群落中的比例很小[6].此前, 对细菌的研究多集中在群落结构和分布特征上, 对其代谢功能研究展开较少.因此, 本研究系统分析水生生态系统中细菌群落的结构、分布和其代谢功能特征, 对维护水体环境有着极为重要的意义.
西安市作为北方缺水城市, 城市湖泊补水较少, 水体交换速率慢, 且受周边居民生产生活的影响, 城市湖泊水体环境较差[7].张锋等[8]对汉城湖的水环境进行了全面调查, 发现部分水质指标已经超出景观娱乐用水水质A类标准的最低要求.城市景观水体大多处于静止、封闭或半封闭状态, 自净能力差, 水生生物单一, 且生态系统不稳定[9].
因此, 本文以西安市景观湖泊(汉城湖、南湖、兴庆湖和桃花潭)为研究对象, 对4个湖泊进行实地调查以及理化指标测定; 并使用Illumina Nova高通量测序技术获得湖泊水体细菌群落结构特征, 分析水体中细菌群落分布规律; 应用RDA分析得出细菌群落与环境因子的相关性; 利用Tax4Fun预测细菌群落代谢功能, 以期为城市景观湖泊水环境健康发展提供依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况本研究涉及西安市区4个典型的城市湖泊, 分别位于西安市主城区的东、西、南、北这4个方向, 每个湖泊周围环境有明显差异, 可以代表西安市不同类型城市湖泊水体的特征.
南湖位于西安市东南郊, 来水水源为曲江水厂第一道水, 全长1 088 m, 宽窄不等, 最宽处552 m, 平均水深1.68 m, 水力停留时间约38 d.南湖因地势开凿, 湖形曲折, 南北长, 东西窄[10].
汉城湖位于西安市西北方向, 补水来自沣河, 湖体自南向北流入渭河, 全长6 270 m, 宽20~100 m不等, 水力停留时间约14 d.在2009年前, 汉城湖是城市污水主要排污口, 城市河道改造后, 承接兴庆湖、护城河、老城区和西北郊区部分城市排污、雨洪排泄任务[11].
桃花潭位于浐河下游, 补水来自临近河流和西安市第三污水处理厂出水, 全长1 200 m, 宽约660 m, 平均水深1.3 m[12].
兴庆湖位于西安市城区东南角, 补水为南郊水厂和雨水, 面积约1.1×105 m2, 平均水深1.6m, 水力停留时间约310 d, 该湖是西安市东郊地区的防洪缓冲库[13].
1.2 样品采集及处理分别在西安市汉城湖、兴庆湖、南湖、桃花潭的进水口、湖中心和出水口进行采样点布设, 具体位置如图 1所示.
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图 1 采样点布设示意 Fig. 1 Schematic diagram of sampling point layout |
水样于2020年8月采集, 使用简易采水器在水面以下0.5 m处取3个水样, 各1 L.装入无菌聚乙烯瓶内, 临时保存在4℃以下的保温箱, 直至运送到实验室.在超净工作台, 使用0.22 μm醋酸纤维滤膜过滤截留水样中的细菌, 将滤膜保存在-80℃以下, 直至进行细菌群落测序.
1.3 水体理化指标测定对南湖(N11~13)、兴庆湖(N21~23)、桃花潭(N31~33)和汉城湖(N41~43)共12个采样点的水体理化性质进行测定, 测定指标及检测方法, 如表 1所示.
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表 1 水质指标及其测定方法 Table 1 Water quality index and its determination method |
1.4 DNA提取
采用标准化CTAB法提取样本DNA.即将样品加入含有溶菌酶和1 000 μL CTAB缓冲液的裂解液中.用酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA, 在-20℃条件下用异丙醇沉淀, 然后经75%乙醇洗涤2次, 用ddH2O溶解.最后加入1 μL RNase A在37℃下消化RNA 15 min, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和纯度, 根据DNA浓度, 无菌水稀释到1 ng·μL-1[14].
1.5 PCR扩增16S V4区扩增采用带Barcode的特异引物, 带正向引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和反向引物806 R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′)的通用引物[15].PCR反应采用Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), 总体积为30 μL(Phusion Master Mix 15 μL, 6μmol·L-1引物, 10 μL gDNA, 2 μL H2O).
PCR反应程序为：在98℃进行1 min, 随后30个循环(98℃, 10 s; 50℃, 30 s; 72℃, 30 s), 然后在72℃下进行最后延伸步骤5 min.PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测, 根据PCR产物浓度进行等量混样, 充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 对目的条带使用Qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物.
1.6 测序数据处理使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建库试剂盒进行文库的构建, 构建好的文库经过Qubit定量和文库检测, 合格后, 使用NovaSeq 6000进行上机测序.
使用FLASH将读取的成对的数据合并, 根据特异性Barcode分配给每个样品, 利用QIIME软件包对FLASH生成的原始标签进行筛选和分析.
根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据, 截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/), 拼接得到的原始Tags数据(raw tags)[16].利用Qiime(V1.9.1, http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)[17]对FLASH生成的数据进行筛选和分析. 经以上处理, Tags序列通过(https://github.com/torognes/vsearch/)[18]进行去除嵌合体序列的处理, 得到最终的有效数据(effective tags).
1.7 Tax4Fun功能预测分析使用Tax4Fun预测了浮游细菌群落的潜在功能概况, Tax4Fun是一个开源的R包, 它基于16S rRNA标记基因概况预测微生物群落的功能能力.根据SILVA 123数据库使用封闭参考获得OTU表, 使用京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径参考使用标准化OTU表计算代谢能力[19].
1.8 数据分析利用Origin 2018软件对水体理化性质、细菌丰度进行分析处理及绘图; 利用Canoco5.0软件对细菌群落物种信息进行去趋势对应分析(detrended correspondence analysis, DCA), 后基于冗余分析(redundency analysis, RDA)探究细菌群落与环境因子间的响应关系; 最后利用Tax4Fun进行细菌群落代谢功能预测.
2 结果与讨论 2.1 西安市4个湖泊水质现状图 2为西安市4个湖泊基本水质指标分布状况, 水体pH在6.98~7.61之间, 水体基本呈中性或弱碱性.溶解氧在5.26~10.69 mg·L-1之间, 其中汉城湖溶解氧最高, 桃花潭溶解氧最低.桃花潭COD、TP、TN和NH4+-N均为最高, 分别达到地表劣Ⅴ类、Ⅴ类、劣Ⅴ类和Ⅲ类水质标准; 南湖、兴庆湖和汉城湖COD达到Ⅳ类, TP达到Ⅳ类, NH4+-N达到Ⅱ类, 南湖和兴庆湖TN达到Ⅴ类, 汉城湖仅达劣Ⅴ类.总体来说, 4个湖泊均存在氮营养盐污染, 其中汉城湖和桃花潭氮超标严重.
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图 2 4个湖泊水质现状 Fig. 2 Status of water quality in the four lakes |
α多样性用于分析样本内的细菌群落多样性, 通过单样本的多样性分析可以反映样本内的细菌群落的丰富度和多样性, 并用一系列统计学指数分析评估各样本中细菌群落的物种丰富度和多样性的差异[20].选用Simpson、Chao1、ACE和Shannon等指数来反映细菌群落的相对丰度.Chao1指数和ACE指数用来表征物种的丰富度[21], Chao1指数和ACE指数数值越大, 表明群落丰富度越高; Simpson指数和Shannon指数用来表征物种的多样性[22], Simpson指数和Shannon指数数值越大, 表明群落多样性越高.
如图 3所示, 西安市4个湖泊水体Chao1指数平均值分别为：南湖(1 019.25)、兴庆湖(793.16)、桃花潭(1 030.92)和汉城湖(932.25); ACE指数平均值分别为：南湖(1 038.66)、兴庆湖(817.50)、桃花潭(1 072.22)和汉城湖(939.77); Shannon指数平均数分别为：南湖(5.99)、兴庆湖(5.34)、桃花潭(6.84)和汉城湖(6.44); Simpson指数平均数分别为：南湖(0.95)、兴庆湖(0.94)、桃花潭(0.98)和汉城湖(0.97).结果表明, 西安市4个湖泊水体中细菌群落丰富度高低为：桃花潭>南湖>汉城湖>兴庆湖; 细菌群落多样性高低为：桃花潭>汉城湖>南湖>兴庆湖.综合α多样性各项指标, 桃花潭均高于其他湖泊, 说明桃花潭水体细菌多样性较高, 水体环境适合细菌的生长繁殖[23], 这可能与桃花潭存在一定程度富营养化有关.
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图 3 湖泊水体细菌多样性指数 Fig. 3 Bacterial diversity index of lake water |
图 4为西安市4个城市湖泊水样中细菌在门水平的相对丰度分布结果.每个样本选取在门水平上最大丰度前10的物种, 生成物种相对丰度柱形累加图进行分析.可以看出, 湖泊水体中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度(18.3%~73.8%)显著高于其他门类, 在地表水细菌群落中是常见的优势菌群.其他主要菌群门类依次为：放线菌门(Actinobacteria, 2.7%~49.7%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 3.0%~24.8%)、蓝藻门(Cyanobacteria, 0.9%~16.3%)、疣微菌门(Verrucomicrobia, 0.9%~12.7%)、厚壁菌门(Firmicutes, 0.8%~7.1%)和绿弯菌门(Chloroflexi, 0.8%~4.4%), 这与其他水环境中细菌群落组成基本相似[24].在4个湖泊中相对丰度均较少的有：酸杆菌门(Acidobacteria, 0.1%~1.5%)、Parcubacteria菌门(0%~1.2%)和单胞菌门(Gemmatimonadetes, 0.1%~1.1%).
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图 4 门水平细菌结构分布 Fig. 4 Bacterial structure distribution at the phylum level |
在门分类水平上, 4个湖泊水体的细菌群落分布有所差异.兴庆湖中优势菌群(平均丰度>5%)为变形菌门和拟杆菌门; 汉城湖中优势菌群为放线菌门、变形菌门、拟杆菌门、蓝藻门和疣微菌门; 南湖中优势菌群为变形菌门、放线菌门和蓝藻门; 桃花潭中优势菌群为放线菌门、变形菌门、蓝藻门和拟杆菌门.其中, 汉城湖细菌丰富度最高, 包含细菌种群数量最多.从各湖泊3个采样点来看, 湖泊进水、湖心和出水中细菌群落分布和相对丰度变化不大.
水体中的细菌对水质有明显的指示意义[25].变形菌门在有机物分解和循环中有重要作用, 可以去除水体中的磷, 并将亚硝酸盐转化成硝酸盐, 其高丰度与其高营养可用性有关[26]; 拟杆菌门与许多哺乳动物的肠道微生物群相关, 其中一些物种被认为是有效的粪便指示剂, 其丰度较高可能由于住宅区废水直接排放造成, 这些废水可能含有硝酸盐、氨和粪便等污染物[27]; 放线菌门是与水体净化过程相关的重要细菌, 可以产生多种抗生素、细菌素和酶, 对水环境有消毒作用, 可抑制并杀灭病原细菌[28]; 蓝藻门是水体富营养化主要指示生物, 相对较高的蓝藻门的分布, 表明湖泊存在潜在的富营养化的风险[29]; 疣微菌门在富营养环境下可利用硫酸盐降解多糖, 在寡营养条件下可以通过化能自养代谢获取能量[30].这些细菌的分布主要与湖泊水体水质和环境状况有关.
2.3.2 属水平细菌群落结构分布在属分类水平上, 不同湖泊水体中的优势菌属及其数量存在一定差异, 属水平细菌相对丰度如图 5所示.南湖的优势菌属(平均丰度>5%)为：unidentified_α-变形菌属(unidentified_α-Proteobacteria, 15.9%~20.9%)和黑草属(Buchnera, 3.6%~22.6%), 兴庆湖的优势菌属为：Pseudarcicella(18.0%~20.0%)、栖湖菌属(Limnohabitans, 10.4%~12.0%)、多核杆菌属(Polynucleobacter, 8.9%~10.6%)、红育菌属(Rhodoferax, 7.6%~7.8%)、Malikia(3.7%~7.6%)和Pseudorhodobacter(3.8%~6.6%), 汉城湖的优势菌属为：unidentified_微酸菌属(unidentified_Acidimicrobiia, 2.0%~8.7%), 桃花潭的优势菌属为：多核杆菌属(Polynucleobacter, 3.7%~5.3%).
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图 5 属水平细菌结构分布 Fig. 5 Bacterial structure distribution at the genus level |
4个湖泊水体中优势属主要属于变形菌门、放线菌门和拟杆菌门, 这与门水平优势菌分析结果一致.在这些属水平的细菌中, 属于γ-变形菌纲的布赫纳氏菌属、Limnohabitans、Malikia、多核杆菌属和红育菌属分别在固氮[31]、硝酸盐还原[32]、反硝化作用[33]、溶解性有机物降解[34]和硝化作用[35]等氮的循环过程中发挥作用; 属于α-变形菌纲的unidentified_α-变形菌属能够利用有机物去除污染[36], 桃花潭中α-变形菌属相对含量较低, 说明桃花潭中能起到脱氮除磷效果的菌群较少, 而通过对比分析水质检测结果, 发现桃花潭中氮磷化合物浓度高于其他采样点; 属于微酸菌纲的unidentified_微酸菌属是水质净化重要细菌, 其在汉城湖、南湖和桃花潭中较高的相对丰度表明其水环境生态修复及净化效果较好; 属于拟杆菌纲的Pseudarcicella为指示水体所受的粪便污染提供了途径, 其在兴庆湖中较高的相对丰度表明兴庆湖粪源污染较严重, 可能存在未经处理的生活废水排入[37].
2.4 环境因子对细菌群落差异的影响由于细菌对水环境的变化十分敏感, 细菌功能和多样性与环境因子之间的关系对于促进水环境的健康至关重要[38].本研究选取6个湖泊水体基本理化性质指标(pH、DO、COD、NH4+-N、TN和TP)作为环境因子, 运用线性模型RDA分析属水平前8种细菌群落与环境因子间的响应关系, 结果如图 6所示.检验结果显示, TN(r2=0.765, P=0.002)、TP(r2=0.571, P=0.004)、NH4+-N(r2=0.540, P=0.004)和pH(r2=0.316, P=0.046)对湖泊水体细菌群落的影响达到显著水平(P < 0.05).以上相关性分析进一步解析了西安市4个城市湖泊水体细菌群落结构与环境因子的响应关系.
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1.pH, 2.COD, 3.TP, 4.NH4+-N, 5.DO, 6.TN; A. Buchnera, B. unidentified_α-Proteobacteria, C. Pseudarcicella, D. Limbohabitans, E. Polynucleobacter, F. unidentified_Acidimicrobiia, G. Rhodoferax, H. Malikia; 红色剪头表示环境因子, 蓝色箭头表示细菌群落 图 6 水体细菌群落与关键环境因子的RDA分析 Fig. 6 Redundancy analysis of bacterial community and key environmental factors in water |
从细菌与环境因子的关联性上看, 第一象限中, Buchnera、Limbohabitans、Malikia、Pseudarcicella与NH4+-N、TN、TP和COD呈正相关关系, 与pH、DO呈负相关关系; 第二象限中, unidentified_α-变形菌属和unidentified_微酸菌属与pH、DO呈正相关关系, 与NH4+-N、TN、TP和COD呈负相关关系; 第四象限中, Rhodoferax、Polynucleobacter与NH4+-N、TN、TP和COD呈正相关关系, 与pH和DO呈负相关关系.本研究发现影响细菌群落的最大影响因素为氮磷营养盐(TN、TP和NH4+-N), 这与其他学者对影响淡水细菌群落关键因子的研究结果一致[39].
2.5 Tax4Fun功能预测细菌群落代谢功能Tax4Fun是用来分析预测细菌群落的代谢功能的R程序包, 根据数据库注释结果, 选取每个样本或分组在各注释层级上最大丰度排名前10的功能信息, 生成功能相对丰度柱状堆积图如图 7所示.西安市4个湖泊细菌群落代谢功能依次包括：代谢(metabolism)、遗传信息处理(genetic-information-processing)、环境信息处理(environmental-information-processing)、细胞进程(cellular-process)、人类疾病(human-diseases)和有机体系统(organismal-system).为更好地理解不同细菌群落的功能作用, 使用基于KEGG第2层级代谢途径数据分析库分析的Tax4Fun功能预测来获得细菌代谢途径.主要的代谢功能有：氨基酸代谢(amino acid metabolism)、碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、能量代谢(energy metabolism)、核苷酸代谢(nucleotide metabolism)以及辅因子和维生素的代谢(metabolism of cofactors and vitamins)等.其中, 氨基酸代谢和碳水化合物代谢丰度最高, 营养来源是影响水环境细菌群落结构的潜在动力[40].氨基酸是有机氮的主要赋存形态, 其降解对细菌繁殖有促进作用, 代谢有益于细菌对氨基酸的利用等[41].氨基酸代谢相关细菌能促进氨基酸产生和腐殖质合成[42].动植物腐败物使湖泊中有机物积累, 异养型细菌利用碳水化合物代谢途径分解有机物[43], 湖泊中优势菌门(变形菌门和拟杆菌门)可以降解有机物, 进一步证明该区域有机物浓度较高.细菌基因功能一方面调节环境以维持自身生命活动, 另一方面细菌细胞间的群体感应抵抗了环境波动以维持细菌群落的相对稳定.由此可见, 细菌群落是水生生态系统中至关重要的一部分[44].
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图 7 细菌群落代谢功能相对丰度 Fig. 7 Bacterial community functional relative abundance |
景观湖泊分布于居民区, 西安市的城市景观湖泊大都具有游览观光和休闲娱乐, 甚至防洪保安和农业灌溉等功能, 对市民的生产生活及身体健康有重要影响[45].Sandifer等[46]研究表明环境中的细菌菌群与人体健康密切相关.西安市4个湖泊中存在的细菌种类较多, 其中不乏和人类疾病相关的细菌, 如图 8所示, 包括：耐药性(drug resistance)、传染性疾病(ifectious disease)、癌症(cancers)、内分泌及代谢性疾病(endocrine and metabolic)、神经退行性疾病(neurodegenerative disease)、心血管疾病(cardiorascular)、物质依赖(substance dependence)和免疫性疾病(immune disease). 其中以耐药性与传染性疾病相对丰度最高, 免疫性疾病最低, 这表明西安市4个湖泊存在潜在的耐药性细菌污染以及传染性疾病风险. 耐药细菌以及致病细菌可通过食物链向人类传播, 也会通过各种途径传播至周围环境[47]. 由于抗生素在水环境中的大量残留, 携带耐药性基因的细菌在环境中急剧增长, 因此, 对水环境潜在的耐药性细菌的监测和深入研究十分必要[48]; 水环境污染导致溶血性霍乱弧菌已成为我国细菌性食源性疾病的首要病因, 应加强传染性疾病的预防, 以确保水环境及人类身体健康[49].
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图 8 细菌群落致病程度预测 Fig. 8 Bacterial community pathogenicity prediction |
(1) 从西安市4个湖泊水体细菌群落α多样性来看, 细菌多样性高低为：桃花潭>汉城湖>南湖>兴庆湖, 桃花潭细菌多样性最高, 兴庆湖最低.
(2) 变形菌门是4个湖泊水体中细菌群落占比最高的门类, 变形菌门在有机物分解和循环中有重要作用, 是地表水中常见的优势菌群.不同湖泊水体中的优势菌属及其数量存在一定差异, 但大都属于变形菌门、放线菌门和拟杆菌门.
(3) 西安市城市湖泊水体的理化性质与细菌群落结构存在显著相关性, 这些相关性也解释了湖泊水质分布规律, 氮磷营养盐为其细菌群落的关键环境因子(P < 0.05).
(4) Tax4Fun功能预测分析显示, 西安市4个湖泊中氨基酸代谢和碳水化合物代谢这2种代谢功能丰度最高, 细菌代谢较为活跃; 4个湖泊存在潜在的耐药性细菌污染以及传染性疾病风险较大, 因此应关注西安市景观湖泊水体细菌的潜在风险, 以保障水环境健康及可持续发展.
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