2022, Vol. 43
, LI Yi-man , WANG Xue-jia , XU Ya-qiong , ZHANG Shu-qiang , LI Qian , XU Kai-li , LI Rong-hua , ZHANG Zeng-qiang
土壤是包括人类在内的大多数生物生存的物质基础.社会经济发展和环境保护往往是矛盾的[1, 2].人口的增加和工业的迅猛发展所造成的包括土壤重金属污染在内的环境破坏问题越来越严重.如何治理重金属污染土壤是摆在人类面前的重大挑战.植物修复作为生物修复的一种, 被认为是绿色、环保和低成本的修复技术手段, 然而如何提高其修复效率是当前需要突破的瓶颈问题.考虑到不同生物之间存在复杂的相互作用, 它们之间通过物质循环和能量传递呈现出对环境的适应性.与单一的生物修复相比, 构建多元生物协同修复将更具有优势[3].
微生物对重金属等有害物质表现出独特的耐性和解毒潜力[4~6], 关于其对重金属污染土壤的修复作用正在被不断挖掘[7~10].芽孢杆菌是一种常见的革兰氏阳性菌, 生长快且对环境适应性好, 抗逆性强, 逐渐被应用到环境治理领域[11].其中, 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)是一种解磷菌, 能够增加土壤养分含量, 促进植物生长, 并且能够增加土壤有益菌属和真菌的相对丰度, 抑制病原菌属[12].已经证实巨大芽孢杆菌能够提高土壤重金属有效态含量, 从而提高植物的修复效率[13~17].但是缺少巨大芽孢杆菌对土壤理化性质的长期影响效果研究及其对增强植物修复效率的研究.印度芥菜(Brassica juncea)被认定为Cd超富集植物.但作为引进物种, 其对气候敏感, 很难在我国大面积种植[18].芥菜是印度芥菜的近源植物, 在我国品种丰富, 生物量大, 生长周期短, 筛选出具有重金属耐性或高积累性的本土品种具有重要意义[19].本课题组已经从常见的21个芥菜品种筛选发现, 包心芥菜[Brassica juncea (L.) Czerniak.]对Cd具有良好的耐性和富集性[20], 但是其修复效率还有待提高.
因此, 本研究以巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为供试菌株, 首先开展了接菌处理下为期两个月的土壤理化性质监测试验.重点关注土壤pH值、有效态Cd和Zn含量及土壤酶活性变化.进而在盆栽试验条件下研究接菌处理对土壤理化性质、包心芥菜的生长和吸收重金属的影响, 明确巨大芽孢杆菌-包心芥菜联合修复的实际应用价值.
1 材料与方法 1.1 试验材料供试土壤采自陕西省宝鸡市凤县某冶炼厂周边土壤(33°56′57″N, 106°31′29″E), 采土深度为0~20 cm.将采集的土壤样品自然风干, 去除杂物后研磨过筛备用.本试验所用基肥为课题组以猪粪和麦秸为主要原料腐熟发酵所得堆肥样品.将堆肥样品磨碎过60目尼龙网筛备用.供试巨大芽孢杆菌菌剂从广西农保生物工程有限公司购入.供试土壤和堆肥样品基本理化性质见表 1.
|
表 1 堆肥基本理化性质1) Table 1 Basic characteristics of the soil and the compost sample |
1.2 试验设计 1.2.1 室内培养试验
将土壤样品装入塑料花盆(高12 cm, 直径10 cm), 每盆0.3 kg土, 并加入15 g(5%, 质量分数)的腐熟堆肥样品作为基肥(为和后续盆栽土壤保持一致).加水至田间持水量的60%, 平衡两周进行后续试验.分别将1 mL活菌量(cfu·mL-1)为1×105(T1)、1×107(T2)和1×109(T3)的巨大芽孢杆菌原液用无菌水稀释至20 mL, 均匀喷洒于各试验盆, 以加入无菌水的土壤作为对照(CK).每个处理设置3次重复.置于恒温培养箱中培养两个月, 温度设置为30℃.培养期间, 称重法维持土壤含水量.培养第3、7、15、30和60 d采集土壤样品(约15 g).将采集的土样分为两部分：一部分土样保存在4℃冰箱用于测定土壤酶活性; 另一部分土样自然风干, 研磨过筛, 用于其他土壤理化指标的测定.
1.2.2 盆栽试验盆栽试验在旱棚内进行, 为期60 d.将1.5 kg土壤样品装入高12 cm、直径15 cm的塑料花盆中, 并加入75 g(5%, 质量分数)的堆肥样品, 加入蒸馏水使含水量至田间持水量60%.将5 mL浓度为1×105 cfu·mL-1(T1)、1×107 cfu·mL-1(T2)和1×109 cfu·mL-1(T3)巨大芽孢杆菌原液用无菌水稀释至100 mL, 均匀喷洒于各试验盆, 以加入无菌水的土壤作为对照(CK).每个处理设置3次重复.包心芥菜种子用5%(体积分数)的次氯酸钠(NaClO)溶液消毒后, 用去离子水冲洗干净, 挑选籽粒饱满的种子备用.每盆播种10粒, 播种深度为0.5~1.0 cm, 待幼苗长出2~3片真叶后, 每盆间苗为3株.盆栽过程中用称重法定期补充水分, 且随机更换花盆的位置, 避免因外界条件(例如光照)造成的植物生长差异.植物收获时, 采集每株植物相同部位, 长势、叶龄相近且有代表性的叶片, 测定叶绿素含量及抗氧化酶活性.将采集的植物样品分地上和地下两部分, 地上部分用自来水冲洗后再用去离子水冲洗, 地下部分用自来水冲洗后再用EDTA-2Na溶液浸泡30 min, 以去除根系表面的可交换态金属离子, 最后用去离子水冲洗干净.将植物样品装入信封内于105℃下杀青30 min, 然后在70℃下烘至恒重, 记录植物干重.将植物样品研磨、密封保存待测.采集植株样品同时采集根际土壤样品, 利用抖落法采集紧贴根表颗粒较细的土壤作为根际土壤[21], 混合均匀后分成两部分, 后土壤样品处理方法同培养试验.
1.3 测定方法土壤pH和EC分别用玻璃电极和电导率仪进行测定; 土壤总氮、磷和钾分别用凯氏定氮法、钼锑抗比色法和火焰光度法测定; 土壤有机质采用重铬酸钾容量法(外加热法)测定; 土壤Cd和Zn总量用王水-高氯酸消解, AAS测定; 土壤有效态Cd含量(DTPA-Cd)和有效态Zn含量(DTPA-Zn)采用DTPA-TEA浸提, AAS法测定[22].土壤碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)采用磷酸苯二钠比色法测定; 土壤蔗糖酶(sucrase, SU)采用3-5二硝基水杨酸比色法测定; 土壤脲酶(urease, UR)采用靛酚比色法测定[23].植物Cd和Zn含量采用HNO3-HClO4消解, AAS测定.植物叶片超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑光还原法; 过氧化物酶(POD)采用愈创木酚-分光光度法测定; 过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法测定[24].植物叶片丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)显色, 分光光度法测试; 叶绿素含量采用丙酮浸提, 分光光度法测定[25].为保证测样准确性, 采用标准物质进行质量控制.土壤和植物样品所采用的标准物质分别是GBW07406(GSS-6)和GBW10046(GSB-24).标准物质按照与样品一致的处理方式进行测定, 土壤和植物标准样品Cd回收率分别为92%~108%和86%~102%; Zn的回收率分别为96%~110%和88%~104%.
1.4 数据分析所有原始数据采用Microsoft Excel 2010软件进行处理, 采用IBM SPSS 19.0软件在P < 0.05水平对数据进行单因素方差分析, 检验各个处理间差异的显著性, 采用Origin 2016软件绘制图形.
2 结果与分析 2.1 巨大芽孢杆菌处理对土壤pH值的影响图 1为不同浓度巨大芽孢杆菌处理下土壤pH值变化情况.在室内培养阶段, 在相同培养时期, 与CK相比, 不同浓度巨大芽孢杆菌处理土壤pH值均显著降低, 并且降低幅度与添加浓度正相关.培养结束时(第60 d), 与CK相比, 土壤pH值最大降幅为0.28个单位, 在处理为T3时取得.在接种菌液初期(第3 d), 土壤pH值变化显著, 对照土壤pH值则在第15 d显著降低.随着培养时间的延长, 土壤pH值整体呈下降趋势, 但在第4次取样时(第30 d)pH值与上一阶段相比显著升高(T2处理浓度除外).盆栽试验条件下根际土壤pH值在添加浓度为T2和T3处理显著降低.与CK相比, 不同浓度巨大芽孢杆菌处理下, 根际土壤的pH值降幅较小, 在0.29%~0.83%之间.
|
不同小写字母表示同一时间不同处理之间差异性显著(P < 0.05), 不同大写字母表示同一处理不同时间之间差异性显著(P < 0.05), 下同 图 1 不同条件下(室内培养和盆栽试验)巨大芽孢杆菌对土壤pH值的影响 Fig. 1 Effects of Bacillus megaterium on soil pH under the different conditions (indoor culture and pot experiment) |
与CK相比, 巨大芽孢杆菌均显著提高土壤有效态Cd和Zn含量, 且在T3处理最为显著(图 2).室内培养条件下, 在同一培养时期, 各接菌量之间对土壤有效态Cd和Zn含量差异不显著(有效态Cd含量第60 d除外).随着培养时间的延长, 各处理下土壤有效态Cd和Zn含量呈现出先上升后下降的趋势, 培养结束时(第60 d)其含量值均高于各自的初始值.
|
左和右纵坐标分别对应室内培养和盆栽试验相应数值 图 2 不同条件下(室内培养和盆栽试验)巨大芽孢杆菌对土壤有效态Cd和Zn含量的影响 Fig. 2 2 Effects of Bacillus megaterium on soil DTPA-Cd and DTPA-Zn under different conditions (indoor culture and pot experiment) |
不同处理下土壤有效态Cd和Zn含量在第15 d时达到最大.与CK相比, 第15 d时, 不同浓度巨大芽孢杆菌处理下土壤有效态Cd和Zn含量分别增加了19%~25%和13%~14%; 第60 d时, 土壤有效态Cd和Zn含量分别增加了24%~47%和11%~13%.盆栽条件下, 向土壤中加入巨大芽孢杆菌后, 土壤有效态Cd含量由5.27 mg·kg-1(CK)升高至6.26~6.75 mg·kg-1, 增幅为19%~28%, 最大增幅在浓度为T3处理取得; 有效态Zn含量由147.23 mg·kg-1(CK)升高至167.21~194.45 mg·kg-1, 增幅为14%~32%, 最大增幅同样在T3处理取得.与室内培养条件下相比, 细菌-植物联合情况下根际土壤有效态Cd和Zn含量增幅更大.
2.3 巨大芽孢杆菌处理对土壤酶活的影响从图 3可以看出, 在室内培养和盆栽试验中, 接菌处理均显著提高土壤碱性磷酸酶(ALP)、脲酶(UR)和蔗糖酶(SU)含量(室内培养条件下碱性磷酸酶和蔗糖酶的个别监测点除外).在室内培养阶段, 土壤ALP整体呈先上升后下降的趋势, 且在培养至第15 d时含量达到最大值.培养至第15 d和第60 d时, 接菌处理下土壤ALP含量分别为对照的1.10~1.23倍和1.03~1.17倍.土壤UR含量随培养时间的延长不断增加, 在培养结束时达到最大值, 其含量增加至对照的1.24~1.30倍.土壤SU含量随时间变化不断升高, 但与UR的增长趋势不同, 在第30 d之后增长幅度趋于平缓.与CK相比, 培养结束时, 接菌处理下土壤SU含量增加了1.21~1.26倍.盆栽条件下, 与对照相比, 接菌处理土壤ALP、UR和SU的含量分别增加了1.02~1.15、1.04~1.15和1.20~1.29倍.
|
图 3 室内培养和盆栽试验条件下巨大芽孢杆菌对土壤碱性磷酸酶、蔗糖酶和脲酶含量的影响 Fig. 3 Effect of Bacillus megaterium on the activities of alkaline phosphatase, sucrase, and urease under the different conditions of indoor culture and pot experiment |
接菌后包心芥菜的生物量变化情况如表 2所示.不同浓度巨大芽孢杆菌显著提高包心芥菜的生物量, 并且不同接菌浓度之间差异显著.与CK相比, 加入巨大芽孢杆菌后, 包心芥菜的干重增加了10.8%~23.8%, 在T3处理生物量取得最大值.由图 4所示, 施用巨大芽孢杆菌后, 包心芥菜地上部分Cd含量显著增加, 但不同接菌量之间差异不显著.与Cd不同, 接菌处理均显著提高植物地上和地下部分Zn含量.不同接菌处理使包心芥菜地上部分Cd富集浓度增加至对照的1.61~1.70倍, 地下部分Cd富集浓度为对照的1.05~1.15倍; 地上部分Zn富集浓度为对照的1.38~1.61倍, 地下部分Zn富集浓度为对照的1.47~1.53倍.生物富集系数(bioconcentration factor, BCF)反映了植物地上部分从土壤里面提取重金属的能力; 而转运系数(translocation factor, TF)则表示植物将重金属从根系向地上部分转移的能力.进一步比较不同处理之间植物的富集系数和转运系数发现(表 3), 接菌处理提高了包心芥菜的富集能力和转运能力, 并且包心芥菜对Cd的富集能力要高于Zn.
|
|
表 2 接种巨大芽孢杆菌对包心芥菜生理特性的影响1) Table 2 Addition effects of Bacillus megaterium on the physiological characteristics of mustard |
|
图 4 巨大芽孢杆菌对包心芥菜地上和地下部分Cd和Zn含量的影响 Fig. 4 Effects of Bacillus megaterium on the contents of Cd and Zn in above- and underground parts of mustard |
|
|
表 3 巨大芽孢杆菌对包心芥菜富集和转运能力的影响 Table 3 Effects of Bacillus megaterium on the bioconcentration factor (BCF) and translocation factor (TF) of mustard |
2.5 接种巨大芽孢杆菌对包心芥菜生理生化指标的影响
接菌对植物的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和叶绿素含量影响见表 2.接菌处理显著增加了植物POD含量, 但不同处理浓度之间差异不显著.与对照相比, 植物POD活性增加了1.11~1.16倍, T2处理POD活性达到最大值.加入巨大芽孢杆菌后, 植物SOD含量增加至对照的1.03~1.23倍, 在T2和T3处理下与对照之间差异显著.接菌显著提高了植物CAT含量, 增加量与添加浓度成正比, 并且不同浓度之间差异显著, 在T3处理下植物CAT含量(以鲜重计)升高至最大为895 U·(g·min)-1, 为对照的1.32倍.接菌处理使植物MDA含量降低, 仅在T3处理下差异显著, 最大降幅为22%.与对照相比, 接菌处理使植物叶绿素a、b和全量均显著增加, 增幅分别为7%~17%、20%~44%和11%~24%.
2.6 相关性分析图 5(a)为室内培养条件下(60 d)接菌处理土壤各理化性质之间的相关性.结果表明, 土壤重金属有效态含量、土壤各酶活性(ALP除外, P < 0.05)与土壤pH值均呈极显著负相关关系(P < 0.01); 重金属有效态含量与土壤各酶含量之间存在显著相关性(P < 0.05), 其中有效态Cd含量(DTPA-Cd)与各酶含量呈极显著相关性(P < 0.01); SU和UR之间存在极显著相关性(P < 0.01).图 5(b)反映了盆栽条件下接菌处理各测定指标之间的相关性.盆栽条件下土壤各理化性质之间相关性与室内培养条件基本一致, 但也有变化, 表现在有效态Zn含量(DTPA-Zn)与pH之间相关性减弱; 重金属有效态含量与SU之间表现为极显著相关性(P < 0.01); ALP和SU与UR之间的相关性增强, 为极显著(P < 0.01).值得关注的是, 土壤pH值与植物各检测指标之间均呈现显著负相关性(P < 0.05, SOD除外, 不显著).植物生物量与抗氧化酶、叶绿素含量呈极显著相关性(P < 0.01).CAT含量和叶绿素总量对植物地上、地下部分累积重金属Cd和Zn含量更为显著相关(P < 0.01); 植物体内抗氧化酶之间相关性显著(P < 0.05), 并且只有CAT与MDA之间存在极显著负相关性(P < 0.01); 同时CAT与叶绿素含量之间存在极显著相关性(P < 0.01), 而MDA与之呈现极显著负相关性(P < 0.01).综上, 土壤pH值变化是引起土壤重金属有效态活性和酶活性改变的关键因素, 在重金属胁迫情况下, 接菌处理通过提高植物抗氧化酶活性及叶绿素含量提高植物抗逆性, 促进其生长, 其中表现最为显著的抗氧化酶类型为CAT.
|
(a)室内培养, (b)盆栽试验; 1.pH, 2.DTPA-Cd, 3.DTPA-Zn, 4.ALP, 5.SU, 6.UR, 7.生物量, 8.地上部分Cd含量, 9.地下部分Cd含量, 10.地上部分Zn含量, 11.地下部分Zn含量, 12. POD, 13. SOD, 14.CAT, 15.MDA, 16.叶绿素a含量, 17.叶绿素b含量, 18.叶绿素总量 图 5 室内培养条件下土壤理化性质之间和盆栽试验下土壤理化性质与植物测定指标之间相关关系 Fig. 5 Correlations between soil physicochemical properties under indoor culture condition and soil physicochemical properties and plant indexes under pot experiment |
芽孢杆菌在自身新陈代谢过程中能够产生多种有机酸(如草酸和柠檬酸等), 从而导致土壤pH降低[26~28].接菌处理后土壤pH值在第3 d时即发生显著变化, 说明巨大芽孢杆菌能够在较短时间内适应土壤环境[29], 但在第30 d土壤pH值升高, 说明在第15 d和第30 d这一培养阶段微生物的代谢活动减弱, 这可能与外界环境条件发生了变化有关.微生物对环境变化敏感, 为了维持物质能量平衡, 会通过调节自身合成和分解有机酸的能力来适应环境的改变[30].在培养结束时(60 d), 加菌处理下土壤pH值下降程度明显, 表明巨大芽孢杆菌对土壤酸化作用具有良好的稳定性.此外, 由于土壤样品中加入了堆肥, 微生物可以分解堆肥中的有机质产生腐殖酸等酸性物质, 导致土壤pH值进一步降低.这一点也解释了对照土壤pH值随着培养时间的延长显著降低的原因.与本研究的结果相似, 郭堤[31]通过向土壤中添加0、2.5%、5%和10%的堆肥样品发现, 施加堆肥样品均显著降低了土壤pH值, 并且降低幅度与堆肥添加量成正比.
土壤重金属有效态含量与土壤性质(如pH、有机质、阳离子交换量、土质类型等)、污染物性质(如总量、元素种类)和生物因素等多方面因素有关[32, 33].在众多因素中, pH值是最值得首先关注的影响因素.对室内培养试验中土壤有效态Cd和Zn含量与土壤pH值进行回归分析, 将土壤有效态Cd和Zn含量设为y, 土壤pH值设为x, 得到的回归方程分别为：y=57.039-6.287x, R2=0.622(P < 0.01)和y=826.195-79.142x, R2=0.689(P < 0.01), 可见土壤有效态Cd和Zn含量值与pH值之间存在极显著负相关关系.这与已有的研究结果相似[30, 34, 35].结合图 1中土壤pH值测定结果, 第15 d土壤pH值降至最低, 在15~30 d土壤pH值显著升高.同样的, 土壤有效态Cd和Zn含量在第15 d升至最高, 在15~30 d降低, 表明土壤有效态Cd和Zn变化与土壤pH值变化存在同步性.与本研究结果相似, 杨榕等[30]在土壤中接种胶质芽孢杆菌, 发现根际和非根际土壤有效态Cd含量的变化与pH值在时间上变化统一.室内培养后期, 接菌处理土壤有效态Cd和Zn含量呈现下降趋势, 但变化不显著(有效态Cd含量在1×105 cfu·mL-1处理下除外), 表明接菌处理可以稳定提高土壤重金属有效性.邓月强等[16]通过盆栽试验的方法, 分析了浓度为5×109 cfu·mL-1巨大芽孢杆菌在不同接种量(10~60 mL)对伴矿景天修复Cd污染农田土壤效率的影响, 发现接种巨大芽孢杆菌后土壤有效态Cd含量较对照(CK)增加了15%~45%, 这与本研究结果相似.与室内培养条件下相比, 细菌-植物联合情况下根际土壤有效态Cd和Zn含量增幅更大.王小敏等[17]在试验中也证实巨大芽孢杆菌和包心芥菜联合作用与单施巨大芽孢杆菌对比, 土壤中更多的铁锰结合态Cd被活化为可交换态Cd, 而可交换态含量是DTPA可提取出的重金属含量的一部分[36].杨榕等[30]的试验结果表明, 接种胶质芽孢杆菌使得根际土壤有效态Cd含量要高于非根际土壤.这可能是接菌使得根际微环境发生变化, 微生物的代谢产物会刺激植物根系分泌有机酸[37], 使得根际土壤重金属有效态含量变化更加明显.
土壤酶活能够反映某一种土壤生态状况下的生物化学过程的相对强度, 测定其活性可以间接了解某种物质在土壤中的转化情况[38, 39].丁玲[40]的研究发现, 向铅锌复合污染土壤中加入不同浓度的巨大芽孢杆菌后, 土壤碱性磷酸酶的含量增加了7.95%~61.64%, 这与本研究结果相似.姜宇[41]从污泥中筛选出两株对Pb具有耐性的菌株添加到不同浓度Pb胁迫土壤中发现, 土壤酶活性(过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶和磷酸酶)有不同程度的提高.需要指出的是, 已有的研究结果表明, 土壤微生物活性与重金属浓度之间存在负相关关系, 即高溶解性重金属含量会抑制微生物的活性, 导致土壤酶活性越低[42, 43].本试验中接菌后土壤有效态Cd和Zn的含量升高, 酶活性没有降低反而升高.这是因为本试验是将巨大芽孢杆菌直接加入到土壤中, 并且其对重金属具有一定的耐性, 极大地丰富了土壤中微生物的数量与活性.同时, 酶对重金属胁迫敏感, 重金属可以通过与酶-底物复合物, 使酶蛋白变性或者与蛋白质活性基团相互作用降低酶活性; 但另一方面, 重金属离子可以酶的辅基形式参与反应, 提高酶的活性, 促进其与底物的配位结合[44].碱性磷酸酶参与土壤磷素的生物转化过程, 由于巨大芽孢杆菌的溶磷作用, 能够降解有机磷化合物, 巨大芽孢杆菌的加入使得土壤中磷素转化过程增强, 从而磷酸酶的活性增强.后期磷酸酶活性出现降低可能受土壤中较高的Cd和Zn有效态含量影响.这可能使磷酸酶对重金属胁迫更为敏感.曾路生等[45]在研究Cd污染对不同土壤酶活性影响时发现, 土壤酶活性对Cd的敏感程度表现为：脱氢酶>磷酸酶>脲酶.杨良静等[46]发现土壤酶对Cd的敏感程度依次表现为：蔗糖酶>脲酶>过氧化氢酶.吴春艳等[47]发现Cd和Cu等土壤酶的抑制作用表现为：磷酸酶>脲酶>蔗糖酶>过氧化氢酶.此外, 外源菌的加入和土壤理化性质的变化对土壤原始微生物的活性影响是十分微妙的.杨良静等[46]发现在Cd胁迫下, 细菌的数量缓慢增加, 而真菌和放线菌的数量变化则为先增加后降低.再者, 本试验中作为基肥加入的有机肥, 能够提高土壤肥力水平和有机质含量水平, 提高微生物的活性, 从而提高土壤酶活性[42].除了重金属含量, 土壤理化性质(pH、碳酸盐含量、有机质含量等)和微生物群落的变化等都将会造成土壤酶活性的改变[48].整体而言, 巨大芽孢杆菌对土壤碱性磷酸酶、蔗糖酶和脲酶活性均有明显促进作用.
3.2 接菌处理对植物生理特性的影响在土壤重金属植物修复领域中, 植物生长状况的好坏对修复效果起着决定性作用.巨大芽孢杆菌是一种溶磷促钾细菌, 可以提高土壤中磷钾的有效态含量, 从而促进植物的生长[16].另外, 有研究表明, 巨大芽孢杆菌还可以分泌促生激素IAA、产铁载体等促进植物生长, 并提高植物的抗逆能力[49].接种巨大芽孢杆菌能够促进植物的生长, 为后续进一步提高土壤的修复效率提供可能.丁玲[40]在人为污染的土壤中接种巨大芽孢杆菌发现, 印度芥菜的生物量平均增量在45%.王小敏等[17]的研究表明接种巨大芽孢杆菌将印度芥菜的生物量提高11.4%~35.9%.邓月强等[16]的研究发现接种巨大芽孢杆菌能够提高伴矿景天地上和地下部的生物量, 其增幅分别可以达到8.7%~66.7%和13.6%~81.8%.与本研究结果相似, 张冰等[50]向土壤中添加108、109和1010 cfu·kg-1巨大芽孢杆菌后青葙地上部Cd积累量增加了45.2%~63.1%.邓月强等[16]在土壤中接种1011 cfu·kg-1巨大芽孢杆菌后伴矿景天地上部Cd含量与对照相比增加了60.4%.孙宇靖[51]的研究发现接种褐环乳牛肝菌(Suillus luteus)使马尾松根部对重金属Pb、Zn、Cd、Cu和Mn比对照的累积量提高了1~5倍.由于接菌处理显著提高了土壤重金属有效态含量, 意味着重金属的生物有效性增大, 同时植株的生物量增加, 从而使植株各部分重金属含量增加.植物地上部分Cd增加量高于植物地上部分对Zn的提取, 同时植物对Cd的富集系数和转运系数也高于Zn.植物对重金属植物的积累过程包括土壤重金属的活化、根系的吸收、分离和保留、木质部的装载、地上部分的分布和叶片细胞的储存[52], 重金属Cd的移动性比Zn的移动性要强[53], 更容易被植物吸收.此外, Jun等[54]的研究发现, 植物对Cd和Zn的积累之间具有拮抗作用.植物对Cd的富集系数和转运系数大于1, 表明包心芥菜具有修复Cd污染土壤的潜力, 并且巨大芽孢杆菌的加入能够提高其富集能力.
逆境造成的植物衰老可能与逆境下活性氧(active oxygen)积累有关[55].植物在逆境环境中, 如重金属胁迫, 会导致植物体内氧代谢失调, 造成活性氧在植物体内累积, 进而会对植物造成一系列的损伤, 如抑制植物的生长.SOD、POD和CAT构成了植物体内活性氧清除的保护酶系统, SOD能够催化分子氧活化的第一个中间产物·O2-, 生成O2和H2O2, POD和CAT则进一步将H2O2分解清除, 生成H2O和O2[55].三者相互协调, 形成保护体系, 维持植物体内活性氧在较低水平.本研究结果表明, 接菌对植物SOD、POD和CAT这3种酶均具有促进作用, 能够避免或减轻活性氧对植物的伤害, 从而提高植物的抗逆性.与本试验研究结果相似, 姜宇[41]的研究发现, 低浓度和高浓度Pb胁迫处理下, 接菌处理均能够提高植物抗氧化酶活性, 减轻Pb对植物的胁迫.MDA为膜脂过氧化中的产物, 其含量高低可以反映细胞膜脂过氧化程度[56, 57].段成娇[58]将根瘤菌接种到铜污染土壤中发现, 接菌处理下苜蓿植物的MDA含量与对照相比显著下降.本试验中, 接菌处理下植物体内3种抗氧化酶含量升高, 使重金属胁迫下植物体内产生的活性氧被快速清除, 减缓或抑制了膜脂过氧化过程的发生, 所以与对照相比, MDA含量降低.添加巨大芽孢杆菌后, 包心芥菜叶绿素含量显著增加(P < 0.05).叶绿素含量的增加, 证明植物的光合作用增强, 可以促进机体合成更多的有机物质, 从而促进植物的生长, 这与本试验中包心芥菜生物量显著增加相吻合.
4 结论(1) 巨大芽孢杆菌通过降低土壤pH值提高土壤有效态Cd和Zn含量, 能够提高土壤磷酸酶、脲酶和蔗糖酶的活性, 并且具有良好的稳定性.
(2) 巨大芽孢杆菌能够促进包心芥菜的生长并提高其富集Cd和Zn的含量, 在添加量为1×109 cfu·mL-1(T3)时效果最佳.巨大芽孢杆菌通过促进植物抗氧化酶活性增强植物抗逆性, 其中表现最为显著的抗氧化酶类型为CAT.
(3) 综上, 巨大芽孢杆菌-包心芥菜联合具有修复Cd和Zn污染土壤的修复潜力.
| [1] | Bai L, Jiang L, Yang D Y, et al. Quantifying the spatial heterogeneity influences of natural and socioeconomic factors and their interactions on air pollution using the geographical detector method: a case study of the Yangtze River Economic Belt, China[J]. Journal of Cleaner Production, 2019, 232: 692-704. DOI:10.1016/j.jclepro.2019.05.342 |
| [2] | Chen H R, Wang L, Hu B F, et al. Potential driving forces and probabilistic health risks of heavy metal accumulation in the soils from an e-waste area, Southeast China[J]. Chemosphere, 2022, 289. DOI:10.1016/j.chemosphere.2021.133182 |
| [3] |
段桂兰, 崔慧灵, 杨雨萍, 等. 重金属污染土壤中生物间相互作用及其协同修复应用[J]. 生物工程学报, 2020, 36(3): 455-470. Duan G L, Cui H L, Yang Y P, et al. Interactions among soil biota and their applications in synergistic bioremediation of heavy-metal contaminated soils[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(3): 455-470. |
| [4] | Xie Y, Bu H S, Feng Q J, et al. Identification of Cd-resistant microorganisms from heavy metal-contaminated soil and its potential in promoting the growth and Cd accumulation of bermudagrass[J]. Environmental Research, 2021, 200. DOI:10.1016/j.envres.2021.111730 |
| [5] | Chen X M, Zhao Y, Zhao X Y, et al. Selective pressures of heavy metals on microbial community determine microbial functional roles during composting: sensitive, resistant and actor[J]. Journal of Hazardous Materials, 2020, 398. DOI:10.1016/j.jhazmat.2020.122858 |
| [6] | Tamariz-Angeles C, Huamán G D, Palacios-Robles E, et al. Characterization of siderophore-producing microorganisms associated to plants from high-Andean heavy metal polluted soil from Callejón de Huaylas (Ancash, Perú)[J]. Microbiological Research, 2021, 250. DOI:10.1016/j.micres.2021.126811 |
| [7] |
张文兴, 岳晓岚, 邓强, 等. 抗性微生物强化重金属污染土壤植物修复的研究进展[J]. 农学学报, 2021, 11(5): 46-50. Zhang W X, Yue X L, Deng Q, et al. Enhancing phytoremediation of heavy metal contaminated soil by resistant microorganisms: research progress[J]. Journal of Agriculture, 2021, 11(5): 46-50. |
| [8] | Cao S M, Wang W K, Wang F, et al. Drought-tolerant Streptomyces pactum Act12 assist phytoremediation of cadmium-contaminated soil by Amaranthus hypochondriacus: great potential application in arid/semi-arid areas[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016, 23(15): 14898-14907. DOI:10.1007/s11356-016-6636-y |
| [9] | Ren C G, Kong C C, Wang S X, et al. Enhanced phytoremediation of uranium-contaminated soils by arbuscular mycorrhiza and rhizobium[J]. Chemosphere, 2019, 217: 773-779. DOI:10.1016/j.chemosphere.2018.11.085 |
| [10] | Rufyikiri G, Huysmans L, Wannijn J, et al. Arbuscular mycorrhizal fungi can decrease the uptake of uranium by subterranean clover grown at high levels of uranium in soil[J]. Environmental Pollution, 2004, 130(3): 427-436. DOI:10.1016/j.envpol.2003.12.021 |
| [11] |
杨文玲, 杜志敏, 孙召华, 等. 芽孢杆菌在重金属污染土壤修复中的研究进展[J]. 环境污染与防治, 2021, 43(6): 759-763. Yang W L, Du Z M, Sun Z H, et al. Research progress of Bacillus in remediation of heavy metal contaminated soil[J]. Environmental Pollution and Control, 2021, 43(6): 759-763. |
| [12] | Zhao Y N, Mao X X, Zhang M S, et al. The application of Bacillus Megaterium alters soil microbial community composition, bioavailability of soil phosphorus and potassium, and cucumber growth in the plastic shed system of North China[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2021, 307. DOI:10.1016/j.agee.2020.107236 |
| [13] |
纪宏伟, 王小敏, 庞宏伟, 等. 枯草芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌对土壤有效态Cd的影响研究[J]. 水土保持学报, 2015, 29(3): 325-329. Ji H W, Wang X M, Pang H W, et al. Effect of Bacillus subtilis and Bacillus megaterium on soil available Cd[J]. Journal of Soil and Water Conservation, 2015, 29(3): 325-329. |
| [14] | 王小敏. 巨大芽孢杆菌对印度芥菜富集土壤镉的影响研究[D]. 保定: 河北农业大学, 2016. |
| [15] |
赵树民, 李晓东, 虞方伯, 等. 巨大芽孢杆菌LY02对黑麦草修复重金属污染土壤的影响[J]. 水土保持学报, 2017, 31(5): 340-344. Zhao S M, Li X D, Yu F B, et al. Effect of Bacillus megaterum LY02 on phytoremediation of heavy metal from contaminated soil by Lolium perenne L.[J]. Journal of Soil and Water Conservation, 2017, 31(5): 340-344. |
| [16] |
邓月强, 曹雪莹, 谭长银, 等. 巨大芽孢杆菌对伴矿景天修复镉污染农田土壤的强化作用[J]. 应用生态学报, 2020, 31(9): 3111-3118. Deng Y Q, Cao X Y, Tan C Y, et al. Strengthening the effect of Bacillus megaterium on remediation of Cd-contaminated farmland soil by Sedum plumbizincicola[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2020, 31(9): 3111-3118. |
| [17] |
王小敏, 纪宏伟, 刘文菊, 等. 巨大芽孢杆菌与印度芥菜对Cd污染土壤的联合修复效果研究[J]. 水土保持学报, 2014, 28(4): 232-236. Wang X M, Ji H W, Liu W J, et al. Effect of Bacillus megaterium and Brassica juncea combination on phytoextraction of Cd from polluted Soil[J]. Journal of Soil and Water Conservation, 2014, 28(4): 232-236. |
| [18] | Boomiraj K, Chakrabarti B, Aggarwal P K, et al. Assessing the vulnerability of Indian mustard to climate change[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2010, 138(3-4): 265-273. |
| [19] |
郭瞻宇, 张子杨, 蒋亚辉, 等. 不同品种芥菜对镉胁迫的敏感性分布及抗氧化特征[J]. 农业环境科学学报, 2018, 37(12): 2660-2668. Guo Z Y, Zhang Z Y, Jiang Y H, et al. Assessment of variation in sensitivity and antioxidant characteristics of different mustard cultivars under different Cd stress levels[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2018, 37(12): 2660-2668. DOI:10.11654/jaes.2018-0202 |
| [20] | 郭瞻宇. 镉、锌耐性芥菜品种筛选及其耐受机理研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2018. |
| [21] | Zhang C S, Lin Y, Tian X Y, et al. Tobacco bacterial wilt suppression with biochar soil addition associates to improved soil physiochemical properties and increased rhizosphere bacteria abundance[J]. Applied Soil Ecology, 2017, 112: 90-96. |
| [22] | 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. ((第三版)). 北京: 中国农业出版社, 2000. |
| [23] | 关松荫. 土壤酶及其研究法[M]. 北京: 农业出版社, 1986. |
| [24] | 高俊凤. 植物生理学实验指导[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006. |
| [25] |
刘文龙, 王凯荣, 王铭伦. 花生对镉胁迫的生理响应及品种间差异[J]. 应用生态学报, 2009, 20(2): 451-459. Liu W L, Wang K R, Wang M L. Physiological responses of different peanut (Arachis hypogaea L.) varieties to cadmium stress[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2009, 20(2): 451-459. |
| [26] |
杨卓, 王占利, 李博文, 等. 微生物对植物修复重金属污染土壤的促进效果[J]. 应用生态学报, 2009, 20(8): 2025-2031. Yang Z, Wang Z L, Li B W, et al. Promotion effects of microorganisms on phytoremediation of heavy metals-contaminated soil[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2009, 20(8): 2025-2031. |
| [27] | Rajkumar M, Sandhya S, Prasad M N V, et al. Perspectives of plant-associated microbes in heavy metal phytoremediation[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(6): 1562-1574. |
| [28] | Han Y L, Zhang L L, Gu J G, et al. Citric acid and EDTA on the growth, photosynthetic properties and heavy metal accumulation of Iris halophila Pall. cultivated in Pb mine tailings[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2018, 128: 15-21. |
| [29] |
柳晓光. 芽孢杆菌在植物-微生物联合修复技术中的应用研究进展[J]. 南方农业, 2021, 15(24): 11-12. Liu X G. Advances in the application of Bacillus in plant-microbe combined remediation technology[J]. South China Agriculture, 2021, 15(24): 11-12. |
| [30] |
杨榕, 李博文, 刘微. 胶质芽孢杆菌对印度芥菜富集土壤Cd及土壤pH的影响[J]. 环境科学学报, 2013, 33(6): 1648-1654. Yang R, Li B W, Liu W. Effects of Bacillus mucilaginosus on soil pH and Cd accumulation by Brassica juncea[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2013, 33(6): 1648-1654. |
| [31] | 郭堤. 密旋链霉菌Act12强化雪里蕻修复Cd、Zn污染土壤及其机理研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2020. |
| [32] |
夏文建, 张丽芳, 刘增兵, 等. 长期施用化肥和有机肥对稻田土壤重金属及其有效性的影响[J]. 环境科学, 2021, 42(5): 2469-2479. Xia W J, Zhang L F, Liu Z B, et al. Effects of long-term application of chemical fertilizers and organic fertilizers on heavy metals and their availability in reddish paddy soil[J]. Environmental Science, 2021, 42(5): 2469-2479. |
| [33] | Wu L H, Zhou J W, Zhou T, et al. Estimating cadmium availability to the hyperaccumulator Sedum plumbizincicola in a wide range of soil types using a piecewise function[J]. Science of The Total Environment, 2018, 637-638: 1342-1350. |
| [34] |
徐明岗, 李菊梅, 张青. pH对黄棕壤重金属解吸特征的影响[J]. 生态环境, 2004, 13(3): 312-315. Xu M G, Li J M, Zhang Q. Effect of pH on desorption of heavy metals from yellow brown earth[J]. Ecology and Environment, 2004, 13(3): 312-315. |
| [35] |
宗良纲, 张丽娜, 孙静克, 等. 3种改良剂对不同土壤-水稻系统中Cd行为的影响[J]. 农业环境科学学报, 2006, 25(4): 834-840. Zong L G, Zhang L N, Sun J K, et al. Effects of three amendments on behaviors of cadmium in different soil-rice system[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2006, 25(4): 834-840. |
| [36] |
王建乐, 谢仕斌, 王冠, 等. 不同提取剂提取土壤中重金属能力的对比研究[J]. 华南师范大学学报(自然科学版), 2020, 52(1): 55-62. Wang J L, Xie S B, Wang G, et al. A comparative study of the capacity of different extractants to extract heavy metals in soil[J]. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition), 2020, 52(1): 55-62. |
| [37] | Fischer K, Bipp H P. Removal of heavy metals from soil components and soils by natural chelating agents. Part Ⅱ. Soil Extraction by Sugar Acids[J]. Water, Air, and Soil Pollution, 2002, 138(1-4): 271-288. |
| [38] |
于寿娜, 廖敏, 黄昌勇. 镉、汞复合污染对土壤脲酶和酸性磷酸酶活性的影响[J]. 应用生态学报, 2008, 19(8): 1841-1847. Yu S N, Liao M, Huang C Y. Effects of cadmium and mercury combined pollution on soil urease and acid phosphatase activities[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2008, 19(8): 1841-1847. |
| [39] | 伍光和, 王乃昂, 胡双熙, 等. 自然地理学[M]. ((第四版)). 北京: 高等教育出版社, 2008. |
| [40] | 丁玲. 巨大/胶质芽孢杆菌与柠檬酸联合强化植物修复铅锌镉污染的土壤[D]. 保定: 河北大学, 2017. |
| [41] | 姜宇. 耐铅微生物与景观植物协同修复铅污染土壤研究[D]. 合肥: 安徽建筑大学, 2019. |
| [42] | Liang Q, Gao R T, Xi B D, et al. Long-term effects of irrigation using water from the river receiving treated industrial wastewater on soil organic carbon fractions and enzyme activities[J]. Agricultural Water Management, 2014, 135: 100-108. |
| [43] | Yang Z X, Liu S Q, Zheng D W, et al. Effects of cadium, zinc and lead on soil enzyme activities[J]. Journal of Environmental Sciences, 2006, 18(6): 1135-1141. |
| [44] |
刘娟, 张乃明, 于泓, 等. 重金属污染对水稻土微生物及酶活性影响研究进展[J]. 土壤, 2021, 53(6): 1152-1159. Liu J, Zhang N M, Yu H, et al. Effects of heavy metal pollution on microorganism and enzyme activity in paddy soil: a review[J]. Soils, 2021, 53(6): 1152-1159. |
| [45] |
曾路生, 廖敏, 黄昌勇, 等. 镉污染对水稻土微生物量、酶活性及水稻生理指标的影响[J]. 应用生态学报, 2005, 16(11): 2162-2167. Zeng L S, Liao M, Huang C Y, et al. Effects of Cd contamination on paddy soil microbial biomass and enzyme activities and rice physiological indices[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2005, 16(11): 2162-2167. |
| [46] |
杨良静, 何俊瑜, 任艳芳, 等. Cd胁迫对水稻根际土壤酶活和微生物的影响[J]. 贵州农业科学, 2009, 37(3): 85-88. Yang L J, He J Y, Ren Y F, et al. Effects of cadmium stress on microbes and enzyme activity in rice rhizosphere soil[J]. Guizhou Agricultural Sciences, 2009, 37(3): 85-88. |
| [47] |
吴春艳, 陈义, 闵航, 等. Cd2+和Cu2+对水稻土微生物及酶活性的影响[J]. 浙江农业科学, 2006(3): 303-307. Wu C Y, Chen Y, Min H, et al. Effects of Cd2+ and Cu2+ on population size of microorganisms and activity of enzyme in paddy soil[J]. Journal of Zhejiang Agricultural Sciences, 2006(3): 303-307. |
| [48] | Chodak M, Gołębiewski M, Morawska-Płoskonka J, et al. Diversity of microorganisms from forest soils differently polluted with heavy metals[J]. Applied Soil Ecology, 2013, 64: 7-14. |
| [49] | 赵树民. 巨大芽孢杆菌LY02对黑麦草修复重金属污染土壤的强化作用[D]. 杭州: 浙江农林大学, 2018. |
| [50] |
张冰, 刘杰, 蒋萍萍, 等. 巨大芽孢杆菌与柠檬酸联合强化青葙修复镉污染土壤研究[J]. 农业环境科学学报, 2021, 40(3): 552-561. Zhang B, Liu J, Jiang P P, et al. Bacillus megaterium and citric acid enhanced the remediation of Cd-contaminated soil by Celosia argentea Linn[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2021, 40(3): 552-561. |
| [51] | 孙宇靖. 褐环乳牛肝菌(suillus luteus)对马尾松富集转移重金属的影响[D]. 长沙: 中南林业科技大学, 2020. |
| [52] | Pasricha S, Mathur V, Garg A, et al. Molecular mechanisms underlying heavy metal uptake, translocation and tolerance in hyperaccumulators-an analysis: heavy metal tolerance in hyperaccumulators[J]. Environmental Challenges, 2021, 4. DOI:10.1016/j.envc.2021.100197 |
| [53] | Lasat M M. Phytoextraction of metals from contaminated Soil: a review of plant/soil/metal interaction and assessment of pertinent agronomic issues[J]. Journal of Hazardous Substance Research, 2000, 2. DOI:10.4148/1090-7025.1015 |
| [54] | Jun L, Wei H, Aili M, et al. Effect of lychee biochar on the remediation of heavy metal-contaminated soil using sunflower: a field experiment[J]. Environmental Research, 2020, 188. DOI:10.1016/j.envres.2020.109886 |
| [55] | 张继澍. 植物生理学[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006. |
| [56] | Chen J, Wang W H, Liu T W, et al. Photosynthetic and antioxidant responses of Liquidambar formosana and Schima superba seedlings to sulfuric-rich and nitric-rich simulated acid rain[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2013, 64: 41-51. |
| [57] | Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance[J]. Trends in Plant Science, 2002, 7(9): 405-410. |
| [58] | 段成娇. 重金属胁迫下土壤酶活性空间分布特征的原位研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2018. |