2022, Vol. 43
2. 宁波大学植物病毒学研究所, 省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室, 宁波 315211
2. State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Institute of Plant Virology, Ningbo University, Ningbo 315211, China
土壤微生物群落是世界上最丰富最多样化的群落之一, 其多样性对维持生态系统功能和持续性发展至关重要[1].有研究表明土壤微生物群落可以驱动地球生物化学循环、分解有机物、抑制土传病害和促进植物生长等[2~4].生物多样性降低已成为全球关注的热点, 农业集约化、气候变化和土地利用方式等可能导致生物多样性降低[5~7], 并且可能对生态系统功能服务和可持续发展产生负面影响, 比如阻碍植物吸收养分和地上地下群落之间的资源循环[8, 9].但是, 目前大部分相关研究主要集中于地上部生物多样性的丧失[10], 对地下生物多样降低的研究相对较少, 这将阻碍人们正确认识生物多样性降低产生的后果.
土壤多功能性是指土壤生态系统能够同时提供和维持多个生态功能的能力, 包括微生物活性、养分循环、土壤养分储存、土壤氮转化和凋落物分解等[11], 土壤多功能性的完整是实现生态系统功能的基础[12].微生物群落通过自身的代谢作用, 分解土壤有机质, 改善土壤养分储存条件, 促进养分循环, 而矿化产物则被植物或者其他微生物群落利用[13], 因此微生物多样性与土壤有效养分多功能性密切相关.土壤胞外水解酶作为微生物代谢的中间产物, 与微生物群落多样性和组成密切相关, 能够反映土壤养分和生物活性状况, 常被用来评价土壤质量和生态系统功能[14].本研究选用土壤有效养分、生物活性和小麦生物量代表土壤多功能性, 能够较为全面地反映土壤地上地下功能现状, 对土壤多功能性做出综合评价.Trivedi等[15]的研究表明, 微生物功能多样性(包括硝化菌、甲烷转化菌和反硝化菌)丧失降低了土壤有效硝酸盐、甲烷和一氧化二氮通量, 影响了土壤关键过程.Chen等[16]的研究表明, 细菌多样性是维持生菜生产力的关键, 细菌多样性降低会影响土壤关键过程, 进而减少生菜生物量.Delgado-Baquerizo等[17]结合全球调研和室内试验, 发现微生物多样性与生态系统多种功能都呈显著正相关, 这些功能包括土壤养分循环、凋落物分解、抵抗病原菌和植物生产力; 该研究还表明微生物群落之间的互作, 尤其是优势物种在推动土壤多功能性中发挥着重要作用.但是, 由于微生物群落存在高度功能冗余, 因此有研究者表明微生物多样性降低并不会影响土壤多功能性, 包括碳矿化、硝化和反硝化等土壤过程[18].由此可见, 人们对微生物多样性与土壤多功能性的关系认识十分有限, 并且存在争议.
细菌和真菌是被研究最多的微生物类群, 目前关于微生物多样性与土壤多功能性关系的研究也主要聚焦于细菌和真菌[15, 18].相对细菌和真菌而言, 原生生物的重要性往往被忽视.原生生物作为土壤中数量最多, 种类最多的真核生物, 在调控植物健康、促进养分循环和维持生态系统平衡等方面发挥着重要作用[19].原生生物是细菌和真菌的主要捕食者, 它可以自上而下调控微生物群落, 比如原生生物对细菌群落的选择性捕食可以导致细菌群落组成和功能发生定向变化[20, 21].以上研究都表明, 应该拓宽土壤微生物多样性降低的范围, 综合考虑细菌、真菌和原生生物多样性降低对土壤多功能性的影响.
到目前为止, 关于土壤微生物多样性研究主要集中于特定的微生物类群和广泛的田间试验[3], 缺乏定量的土壤微生物多样性分析.小麦作为我国第三大粮食作物, 其生产直接影响我国粮食发展和安全[22].因此, 在本研究中利用稀释灭绝法[16, 23, 24]构建微生物多样性梯度, 以小麦“烟农999”为供试作物, 通过高通量测序对细菌、真菌和原生生物群落进行表征, 以土壤有效养分含量、土壤生物活性和小麦生物量为土壤多功能性, 探寻土壤多功能性对微生物群落多样性降低的响应.
1 材料与方法 1.1 土壤采集与制备本研究所用土壤于2021年3月从中国山东临沂市莒南县龙窝村(35°6.57′N, 118°38.14′E)的小麦试验田采集(表层土壤0~20 cm).该试验田从2013年开始进行小麦抗病性鉴定, 拥有较好的研究基础和长期稳定的耕作模式.土质为棕壤, 土壤基础理化性质如下：pH为5.16、ω[总氮(TN)]为3.19 g·kg-1、ω[总碳(TC)]为24.60 g·kg-1、ω[硝态氮(NO3--N)]为59.33 mg·kg-1和ω[铵态氮(NH4+-N)]为40.30 mg·kg-1.土壤去除杂质和残根, 过2 cm筛后, 一部分25℃避光储存, 另一部分装入灭菌袋于121℃, 90 min下灭菌两次[24].灭菌效果通过LB肉汤培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基检测：5 g灭菌土壤与25 mL灭菌水充分振荡混合之后, 将土壤悬浊液分别接种到LB肉汤和PDA固体培养基上, 于37℃下培养6 d[25], 并未见细菌、真菌或其他微生物在培养基上生长.灭菌土壤和未灭菌土壤分别在25℃培养箱中避光培养20 d, 使土壤稳定, 此时灭菌土壤CO2矿化速率趋于稳定, 为1.18 mg·(kg·h)-1.
1.2 试验设计将5 g未灭菌土壤与25 mL灭菌水充分混合2 min, 静置1 min制备土壤原始悬浊液[26].将土壤原始悬浊液进行梯度稀释：100、103、106和109, 然后以1:25的土水比将不同浓度土壤悬浊液和灭菌水分别接种到灭菌土壤中, 以上操作均在超净工作台进行.最后设置的处理组为OS(未灭菌土壤)、D0(接种10-0稀释菌液)、D3(接种10-3稀释菌液)、D6(接种10-6稀释菌液)、D9(接种10-9稀释菌液)和SS(接种灭菌水).接种完成后加入灭菌水使土壤含水率达到田间持水量的60%, 封上封口膜于25℃培养箱中避光预培养2周.用于盆栽种植的塑料花盆内径14 cm, 高11 cm, 每个花盆装载已预培养土壤0.7 kg, 每个处理5个重复, 共30盆.在本文中选择小麦“烟农999”作为研究对象, 提前3 d使用灭菌水将小麦在培养箱中催芽, 每个花盆种植5株小麦, 种植时按尿素：0.25 g·kg-1、KH2PO4：0.15 g·kg-1和KCl：0.04 g·kg-1施加基肥.所有盆栽随机摆放在温室中, 每天光照12 h, 白天温度25℃±2℃, 夜间温度20℃±2℃, 培养期间浇灌灭菌水, 使土壤含水率保持在田间持水量的60%.10 d之后间苗, 每个花盆保留长势一致的3株小麦, 一个半月之后追施尿素, 追施量为基肥的一半, 两个月之后采集小麦和土壤样品(图 1).样品采集时, 每个盆栽混为一个样品(包括3株小麦), 将小麦根系与土壤分离, 每盆土壤充分混合之后, 分别保存于-80℃、4℃和风干处理, 用于后续DNA提取和土壤多功能性测定.
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图 1 试验设计示意 Fig. 1 Schematic of the experimental design |
土壤可溶性有机碳(DOC)、可溶性有机氮(DON)、NO3--N、有效磷(AP)、速效锰(AMn)、速效锌(AZn)、速效钙(ACa)和速效镁(AMg)为土壤有效养分多功能性[27]. 0.5 mol·L-1 K2SO4提取DOC和DON, 使用元素分析仪测定(FlashSamart, 赛默飞世尔, 中国)[28]. 1 mol·L-1 KCl提取NO3--N, 使用连续流动分析仪(AA3; SEAL Analytical GmbH, Norderstedt, 德国)测定[28]. AP采用0.05 mol·L-1 HCl-0.025 mol·L-1(
与碳氮磷循环相关的6种胞外水解酶活性和CO2矿化速率[29]为土壤多功能性生物活性指标.水解酶包括与碳循环相关的α-葡萄糖苷酶(AG)、β-葡萄糖苷酶(BG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-木糖苷酶(XYL), 与氮循环相关的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和参与磷循环的酸性磷酸酶(PHOS).胞外水解酶活性采用紫外-荧光微孔板酶检测技术测定[30], AG、BG、CBH、XYL、NAG和PHOS底物分别为：4-甲基伞形酮-α-D-葡萄糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-纤维二糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-木吡喃糖苷、4-甲基伞形酮-N-乙酰基-β-D-葡萄糖苷和4-甲基伞形酮-磷酸盐.向1 g土壤中加入120 mL pH为5.5的乙酸钠缓冲液, 于磁力搅拌器上搅拌为悬浮状态, 然后将200 μL底物和50 μL样品悬浮液加入96孔黑色酶标板中, 25℃恒温培养箱避光培养4 h, 培养结束后用酶标仪(Infinite M200 PRO, Tecan, Hombrechtikon, 瑞士)在激发波长365 nm和吸收波长450 nm下测定荧光值[30].20 g土壤装入250 mL血清瓶, 25℃密封避光培养24 h后采集气体, 利用气相色谱测定CO2矿化速率[31](Agilent 8890, 安捷伦, 美国).
小麦样品用灭菌水冲洗干净之后在烘箱中于105℃杀青0.5 h, 再65℃烘干至恒重, 称取重量获得生物量.
1.4 DNA提取与扩增子测序称取0.3 g土壤按照Power Soil DNA提取试剂盒(MoBio, San Diego, 美国)制造商的说明书进行DNA提取.使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific, Wilmington, 美国)进行DNA浓度测定, 使用1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测.高通量测序在广州美格基因Illumina MiSeq PE250(Illumina, San Diego, CA, 美国)平台上进行.使用引物515F-806R(515F：5′-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA-3′, 806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′)[32]、its1-its2(its1：5′-CTTGGTCATTTAGAG GAAGTAA-3′, its2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)和Euk560F-TAReukREV3(Euk560F：5′-CCAGC ASCYGCGGTAATWCC-3′, TAReukREV3：5′-ACTTTC GTTCTTGATYRA-3′)分别对细菌16S rRNA基因V4-1区域, 真菌ITS1-2区域和原生生物18SV4-1区域进行扩增, 所有聚合酶链式反应均在15μL体系中进行.PCR扩增条件为：95℃ 3 min, 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 45 s, 35个循环, 72℃延伸10 min.扩增完成后, 使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 并对PCR产物进行纯化、定量和等量混合后构建文库.最后, 使用QubitⓇ 4.0荧光仪(Thermo Science)测定文库质量, 并在Illumina MiSeq PE250平台上对所有文库进行测序.DNA测序数据均已上传至美国国家生物技术信息中心(NCBI), 提取号为PRJNA795951.
下机数据在QIIME 2(v.2020.8)平台进行拼接和质控[33], 在此过程中去除barcode和引物序列, 并且进行双端合并.使用q2 demux插件对原始数据进行多路分解和质量控制, 去除平均Phred得分(Q得分)低于20、碱基不明确、引物不匹配和序列长度小于150 bp的读数[34], 被保留的高质量读数根据反向引物末端的特异条形码指定给相应样本.然后使用DADA2[35]去噪, 并且去除嵌合体, 最后采用100%相似聚类得到扩增序列变体(amplicon sequence variants, ASV)细菌30 505条, 真菌7 928条, 原生生物15 285条, 使用数据库silva132[36]、UNITE database[37]和pr2 database[38]分别对细菌、真菌和原生生物进行物种注释.对得到的ASV表格进一步质量控制：首先删除叶绿体和古菌ASV(原生生物还要去除真菌、后生动物和胚芽植物ASV), 然后过滤掉序列总数少于20的ASV, 最后抽平, 每个样本得到细菌50 645 reads, 真菌184 861 reads, 原生生物41 933 reads.
1.5 土壤多功能性计算为了测度土壤多功能性, 前人提出了许多多功能指数的计算方法, 如：单功能法[39]、平均值法[10]和阈值法[1, 40]等.其中平均值法简单直观, 能对同一系统多个服务功能进行可解释的定量描述, 因此使用频率最高[10, 41].本研究先计算每个变量的Z得分, 再采用平均值法[10]对土壤多功能性指数进行计算, 计算公式为：
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(1) |
式中, Mi为样方i的土壤多功能指数, N为土壤功能变量总数, xij为样方i第j种土壤功能变量的实际测量值, uj为第j种土壤功能变量在所调查样本中的平均值, 
除了结构方程模型外(structural equation models, SEM), 所有统计分析均在R4.0..2(http://www.r-project.org)中完成.基于Tukey检验(P < 0.05), 确定不同处理间土壤多功能各指标和微生物(包括细菌、真菌和原生生物, 下同)α多样性(包括丰富度指数和香农指数, 下同)差异.主坐标分析(PCoA)基于Bray-Curtis变异系数完成, 用于确定不同处理间微生物群落差异, 并且使用R语言的“vegan”包和相似性分析(ANOSIM)确定分组检验是否有意义[42].使用R语言“psych”包和Pearson检验绘制微生物多样性与土壤多功能性指标之间的相关性热图[43].使用最小二乘法的线性回归确定微生物多样性与土壤多功能性之间的关系[44].利用集成推进树(aggregated boosted tree, ABT)筛选出对土壤多功能性指数相对贡献值前20的属水平微生物, 并且使用气泡图表示这些类群在不同处理中的相对丰度, 进一步利用线性回归模型确定特定微生物类群相对丰度与土壤多功能性指数之间的关系.
利用Amos Graphics 22(SPSS Inc, Chicago, 美国)构建SEM, 确定微生物多样性稀释处理、细菌多样性、真菌多样性和原生生物多样性对土壤多功能性的直接或间接影响.采用极大似然法(maximum likelihood method)对模型参数进行估计.使用卡方(χ2)、均方根误差(RMR)、拟合优度指数(GFI)和近似误差均方根(RMSEA)对模型优度进行检验.使用IBM SPSS statistics 22(SPSS Inc, Chicago, 美国)分别对细菌、真菌和原生生物的丰富度指数、香农指数和β多样性进行标准化降维处理, 得到微生物多样性[45].
2 结果与分析 2.1 土壤细菌、真菌和原生生物群落多样性与OS相比, 稀释处理D0、D3、D6、D9和SS的细菌α多样性均显著降低[图 2(a)和2(b)].OS的细菌丰富度指数为1053, 稀释处理丰富度在300~600之间.与OS相比, D0的丰富度指数显著降低了47.95%, 而D3、D6、D9和SS显著降低了58.74%~64.51%.与OS相比, D0和D3的香农指数显著降低, 而D3、D6、D9和SS之间的香农指数差异不显著.主坐标分析(PCoA)表明OS、D0和D3分别与D6、D9和SS处理下细菌群落结构显著分异(P < 0.001), 但是D6、D9和SS处理下细菌群落结构未存在显著分异.其中主坐标一轴(PCoA1)对群落结构差异的解释率为36.98%, 二轴(PCoA2)解释率为14.90%[图 2(c)].
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不同小写字母表示在P < 0.05水平上差异显著, (c)表示土壤细菌β多样性, (f)表示土壤真菌β多样性, (i)表示土壤原生生物β多样性 图 2 不同土壤微生物多样性梯度下细菌、真菌和原生生物群落的丰富度指数、香农指数和β多样性 Fig. 2 Richness index, Shannon index and β diversity of bacterial, fungal, and protist communities under different microbial diversity gradients |
与OS相比, 稀释处理D0、D3、D6、D9和SS的真菌α多样性均显著降低[图 2(d)和2(e)].OS的真菌丰富度指数为424, 稀释处理丰富度在149~207之间.与OS相比, D0、D3、D6、D9和SS的真菌丰富度指数显著降低了51.13%~64.81%.对土壤真菌香农指数分析可知, 从OS到SS真菌香农指数呈梯度下降趋势, 说明在接种低浓度土壤悬浊液的处理中, 土壤真菌群落更趋向均一化, 即使他们的丰富度差异并不显著.PCoA表明OS、D0、D3、D6、D9和SS的真菌群落组成都显著分异(P < 0.001).PCoA1对群落结构差异的解释率为36.41%, PCoA2解释率为23.05%[图 2(f)].
与OS相比, 稀释处理D0、D3、D6、D9和SS的原生生物α多样性均显著降低[图 2(g)和2(h)].OS的原生生物丰富度指数为610, 稀释处理丰富度指数在233~339之间.与OS相比, D0、D3、D6、D9和SS的原生生物丰富度指数显著降低了44.40%~61.80%.对土壤原生生物香农指数分析可知, 与OS相比稀释处理D0、D3、D6、D9和SS的香农指数均显著下降, 但是D0、D3、D6、D9和SS之间没有显著差异.PCoA表明稀释处理和OS原生生物群落组成显著分异(P < 0.001), 但是D0、D3、D6、D9和SS微生物群落结构大部分重叠.PCoA1对原生生物群落结构差异的解释率为26.65%, PCoA2解释率为15.49%[图 2(i)].
由上述分析可知, 稀释灭绝法成功构建了微生物多样性梯度.微生物对稀释灭绝法的响应是: 真菌>细菌>原生生物.
2.2 微生物多样性降低对土壤有效养分、生物活性和小麦生物量的影响如表 1所示, 与未灭菌土壤OS相比, 稀释处理D0、D3、D6、D9和SS的DOC、AMn、AZn、ACa和AMg含量均显著增加, NO3--N和AP含量显著降低. 其中DOC增加最显著的是SS处理, 与OS相比增加了155%. AMn、AZn、ACa和AMg在稀释处理中分别增加了186%~214%、37%~69%、84%~107%和50%~77%.土壤AP和NO3--N含量都在SS处理中最低, 与OS相比分别降低了21%和97%.其次, 与碳循环相关的酶AG、BG、CBH和XYL活性均随着稀释梯度的增加呈先增加后降低趋势, 并在D3和D6处理中达到最大值.其中AG、CBH和XYL活性都是在D3处最高, 分别为11.26、92.21和87.90 nmol·(g·h)-1, BG酶活在OS和D6中都较高, 最高为250.41 nmol·(g·h)-1.与氮循环相关的酶NAG活性也是在D3处最高, 为273.23 nmol·(g·h)-1.与磷循环相关的酶PHOS活性随着稀释梯度的增加显著降低, 与OS相比降低了70%.最后, 与OS相比, 稀释处理显著增加了小麦的生物量, 在D9处理中小麦生物量达到最高10.70 g, 增加了34.42%.
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表 1 不同微生物多样性梯度下土壤有效养分含量、生物活性和小麦生物量1) Table 1 Soil available nutrient, biological activity, and wheat biomass under different microbial diversity gradients |
由图 3可知, 土壤有效养分中DOC、AMn、AZn、ACa和AMg均与细菌、真菌和原生生物多样性呈显著负相关.NO3--N和AP与细菌、真菌和原生生物多样性呈显著正相关.DON含量只与真菌多样性有显著相关性.土壤生物活性中参与碳循环的酶XYL和参与氮循环的酶NAG活性与微生物多样性呈显著负相关.参与磷循环的酶PHOS与细菌、真菌和原生生物的多样性呈显著正相关.相比参与碳循环的酶(AG、BG、CBH和XYL)而言, NAG和PHOS对土壤微生物多样性降低响应更强烈.小麦生物量也与土壤微生物多样性呈显著负相关.
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1.细菌丰富度指数, 2.细菌香农指数, 3.细菌β多样性, 4.真菌丰富度指数, 5.真菌香农指数, 6.真菌β多样性, 7.原生生物丰富度指数, 8.原生生物香农指数, 9.原生生物β多样性; 不同星号为显著性：*表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 3 微生物群落多样性与土壤有效养分、生物活性和小麦生物量之间的相关性 Fig. 3 Correlation between microbial community diversity and soil available nutrients, biological activity, and wheat biomass |
利用公式(1), 将土壤有效养分、生物活性和小麦生物量进行标准化, 计算出土壤多功能性指数, 并且使用线性回归对土壤多功能性与微生物丰富度指数、香农指数和β多样性的PCoA1分别进行拟合.由图 4分析可知, 细菌、真菌和原生生物的α多样性(包括丰富度和香农指数)都与土壤多功能性指数显著负相关(P < 0.01).细菌和原生生物β多样性与土壤多功能性指数显著正相关, 而真菌β多样性与土壤多功能性指数显著负相关(P < 0.001).说明随着微生物多样性的降低土壤多功能性有增加趋势.
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灰色区域表示回归线95%的置信区间 图 4 微生物(细菌、真菌和原生生物)多样性与土壤多功能性之间的线性关系 Fig. 4 Linear relationship between microbial diversity (bacteria, fungi, and protest) and soil multifunctionality |
为进一步探寻土壤中特定微生物类群对土壤多功能性的影响, 本研究利用ABT筛选出细菌、真菌和原生生物共867个菌属中对土壤多功能性相对影响率前20的物种(图 5).在这20个属中有9个属于细菌, 它们分别来自拟杆菌门(Bacteroidota)和变形菌门(Proteobacteria); 有5个属于真菌, 它们分别来自子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota); 有6个属于原生生物, 它们分别来自绿藻门(Chlorophyta)、丝足虫门(Cercozoa)、伪真菌总门(Pseudofungi)和纤毛虫门(Ciliophora).由气泡图分析可知, 20个类群中有11个相对丰度随着稀释梯度的增加逐渐降低, 在OS中显著富集, 这些类群包括细菌属：Rudaea(0.06%)、Taibaiella(0.56%)、Pseudolabrys(0.77%)和Chujaibacter(0.49%)；真菌属：短柄菌属(Solicoccozyma, 10.60%)、瓦湖胶珊瑚菌(Holtermanniella, 0.60%)、瓶束霉属(Ascodesmis, 0.62%)、顶孢霉属(Acremonium, 0.78%)和类葚孢属(Sporidesmiella, 0.24%); 原生生物属：裂丝藻属(Stichococcus, 0.27%)和腐霉属(Pythium, 0.88%).其中对土壤多功能性相对影响率较大的依次是真菌短柄菌属(Solicoccozyma)、细菌属Rudaea、原生生物裂丝藻属(Stichococcus)和真菌瓦湖胶珊瑚菌(Holtermanniella), 并且它们都在OS中显著富集, 而在稀释处理中相对丰度较低.对这4个微生物类群与土壤多功能性之间的关系进一步分析(图 6), 结果表明, 真菌短柄菌属(Solicoccozyma)、细菌属Rudaea和真菌瓦湖胶珊瑚菌(Holtermanniella)相对丰度与土壤多功能性指数呈极显著负相关(P < 0.001).由上分析可知, 关键微生物类群在土壤多功能性生物过程中发挥了指示性作用.
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气泡图表示物种相对丰度, 柱状图表示微生物类群对土壤多功能性的相对影响率 图 5 对土壤多功能性相对影响率前20的微生物类群和它们的相对丰度 Fig. 5 Top 20 microbial taxa with relative influence to soil multifunctionality and their relative abundances |
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灰色区域表示回归线95%的置信区间 图 6 特定微生物类群相对丰度与土壤多功能性之间的线性关系 Fig. 6 Linear relationship between microbial taxa and soil multifunctionality |
本研究利用结构方程模型构建了细菌、真菌和原生生物多样性影响土壤多功能性的整体路径, 并且使用参数χ2、RMR、GFI和RMSEA对模型进行评估.由图 7(a)可知, 首先稀释灭绝法对土壤多功能性有直接正影响, 其次稀释灭绝法会显著改变真菌和原生生物多样性, 进而影响细菌多样性.原生生物对真菌多样性和细菌多样性存在直接正影响, 真菌群落多样性对细菌多样性也存在直接正影响.原生生物、真菌和细菌多样性对土壤多功能性都存在直接或间接的显著影响.虽然原生生物和真菌多样性对土壤多功能性存在直接正向调控, 但是由图 7(b)可知, 它们对土壤多功能性的标准化总效应为负.值得注意的是细菌在推动土壤多功能性中发挥着关键作用, 是驱动土壤多功能性变化的主要生物因子.
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(a)中红色箭头表示正相关, 蓝色箭头表示负相关, 实线表示相关性显著, 虚线表示相关性不显著, 路径宽度表示相关性强度; 不同星号为显著性：*表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 7 细菌、真菌和原生生物多样性对土壤多功能性影响的结构方程模型 Fig. 7 Structural equation model for the effects of bacterial, fungal, and protest diversity on soil multifunctionality |
在探寻土壤微生物多样性与土壤多功能性关系的道路上最大的障碍是缺乏合理的试验方法来诱导土壤微生物多样性发生定向的变化[46].本研究通过在灭菌土壤中接种不同浓度土壤微生物悬浊液成功构建了微生物多样性梯度(图 2).结果表明与未灭菌OS相比, 添加悬浊液和灭菌水处理的土壤细菌、真菌和原生生物多样性都显著降低.但是与已有研究相似[16, 24], 接种液稀释程度与微生物多样性减少程度并不一致, 这可能受到小麦根系分泌物的影响.因为已有研究表明根系分泌物会参与植物根际区域一系列的生物和非生物反应[47], 这可能影响微生物在根际的重新定植, 进而减轻了不同处理之间的差异.土壤悬浊液接种到灭菌土壤中, 微生物重新定植, 此过程受到多种因素的影响, 并且十分复杂, 除了受到优先效应(某些优势物种优先在土壤中定植, 并且影响其他物种的定植)的影响外[48], 还可能受到一系列的确定性和随机过程的影响[49].有学者认为随着稀释程度的增加, 在微生物重新定植的过程中将有更高的随机运动和更低的资源竞争, 这将导致随机性过程增加[50].但是由细菌、真菌和原生生物的β多样性分析可知, 不同处理之间微生物群落总体是分开的[图 2(c)、2(f)和2(i)], 尤其是细菌和真菌, 并且各处理的重复组有更强的聚集性, 都说明微生物的重新定植是可以复制的过程, 即确定性起主导作用[51].
将细菌、真菌和原生生物群落β多样性对比分析可知, 稀释灭绝法对三者的影响程度有所不同：真菌>细菌>原生生物.首先这可能与三者的形态差异有关, 大多数真菌的体积都比细菌大得多, 并且在土壤中受到扩散限制[52], 这可能影响梯度稀释和定植过程.其次细菌、真菌和原生生物之间复杂的相互关系也会影响微生物群落在土壤中的结构和多样性, 同时调控土壤多功能性(图 7).由图 7可知, 真菌多样性受到原生生物直接影响, 细菌多样性受到真菌和原生生物共同影响.虽然部分原生生物拥有较大的体积, 但是在土壤中原生生物大多数扮演着捕食者的角色, 比如单鞭毛虫属(Cercomonas)、Eocercomonas和Rhogostoma等[53, 54], 而细菌和真菌则作为猎物存在[55].原生生物通过捕食猎物释放营养物质, 这些营养物可供环境中的植物或其他有机体使用, 同时细菌和真菌对原生生物的捕食行为存在抵抗作用[56].这种原始复杂的捕食者-猎物关系推动着土壤微生物群落共同进化, 甚至有研究表明原生生物是细菌的主要捕食者, 也是细菌群落聚集和进化的重要驱动力[57].此外, 真菌对土壤细菌也具有选择作用.真菌菌丝与植物根系紧密相连, 形成菌根圈.菌根圈中的菌丝通常来自菌根真菌, 在此区系中植物光合作用产物可以通过真菌的菌丝网络渗出, 为圈中细菌的生长和繁殖提供养分[58].总之, 细菌、真菌和原生生物之间直接和间接的影响作用调控着土壤多功能性.
3.2 微生物多样性降低影响土壤多功能性土壤微生物功能冗余是普遍存在的现象, 当微生物多样性降低时, 这种微生物功能的重叠可以给生态系统带来缓冲, 减少损失[59, 60].事实上在本研究中也的确观察到一些土壤功能对微生物多样性的降低不敏感, 比如DON含量和CO2矿化速率(表 1和图 3).已有研究报道有机质的分解和CO2矿化是由大量微生物物种共同作用完成的, 因此它们对土壤微生物多样性降低并不敏感, 或者具有一定弹性和抵抗性[61].但是, 这只局限于单一的土壤功能, 当将多个功能变量标准化之后, 发现微生物功能冗余的影响并不存在, 微生物多样性降低显著影响土壤多功能性.与许多研究结果相反[16, 23, 26, 27], 在本研究中随着土壤微生物多样性降低, 土壤多功能性显著增加(P < 0.01, 图 4).
土壤细菌、真菌和原生生物多样降低导致土壤多功能性增加, 可能要归因于更低的物种竞争与资源利用[62].土壤DOC、AMn、AZn、ACa和AMg与微生物(包括细菌、真菌和原生生物)多样性显著负相关(表 1和图 3), 表明在低微生物多样性处理中拥有更多的养分和可利用资源.当微生物多样性较高时, 会导致生态位分化, 生存空间降低, 资源分配压力增加[63], 这时微生物和小麦对资源的需求也更为迫切, 可能给土壤多功能性带来负面影响.由图 5和图 6分析可知, 真菌短柄菌属(Solicoccozyma)、细菌属Rudaea、和真菌瓦湖胶珊瑚菌(Holtermanniella)相对丰度与土壤多功能性指数显著负相关(P < 0.001), 并且在高微生物多样性处理OS中显著富集.说明这些微生物类群在微生物多样性处理过程中被稀释, 并且与OS处理中土壤低多功能性密切相关.真菌短柄菌属(Solicoccozyma)和瓦湖胶珊瑚菌(Holtermanniella)都在分解土壤有机质, 促进养分循环方面发挥着重要作用[64, 65], 进一步说明在高微生物多样性处理中, 微生物与微生物, 微生物与植物之间存在激烈的资源竞争与生存压力, 降低了土壤多功能性.
除此之外, 微生物多样性降低可能影响微生物群落功能和生物活性, 进而改变土壤多功能性.在稀释过程中稀有微生物被优先损失[18], 在定植过程中优势菌群间存在强烈的负相互作用, 同时优势菌群的竞争作用也会抑制竞争力较弱的物种定植和生长, 这都会影响微生物群落功能[62].本研究发现执行碳(AG、BG、CBH和XYL)氮(NAG)循环功能的微生物在稀释过程中被保留, 并且在重新定植过程中具有竞争优势(图 3).与许多研究结果相似[15, 16], 相比执行碳功能的微生物群落而言, 参与氮(NAG)和磷(PHOS)循环的群落对微生物多样性降低响应更强烈(图 3), 即微生物多样性降低可能会影响特定的土壤功能过程.在低微生物多样性处理中, 虽然微生物多样性降低[15], 但是生物活性可能增加, 因为涉及到资源的高效利用.与未灭菌土壤相比, 低微生物多样性土壤环境中生物群落趋向高度简化[27], 土壤养分将专一供给成功定植的微生物和小麦生长, 提高利用效率, 增加了小麦生物量和土壤生物活性, 进而提高土壤多功能性.在小麦生长的过程中, 除了土壤养分外可能还涉及到植物病原菌.在被挑选出来的20个微生物类群中, 细菌属Rudaea是植物病原菌[66], 能够诱发多种植物疾病; 真菌属Acremonium大多在土壤中腐生或者寄生在植物体内, 危害植物健康[67].由图 5气泡图可知, 细菌属Rudaea和真菌属Acremonium都在OS处理中显著富集, 可能不利于小麦生长发育.总之, 本研究结果表明, 微生物功能冗余对土壤总体多功能性影响并不显著, 在单一作物体系中微生物多样性降低会增加土壤多功能性.为全面了解微生物多样性与土壤多功能性之间的关系, 在未来应该进一步关注微生物多样性降低过程中的群落遗传结构变化和土壤资源的可利用性.
4 结论本研究将生物多样性降低的维度聚焦到地下部分, 通过稀释灭绝法影响土壤微生物的重新定植过程, 降低土壤细菌、真菌和原生生物多样性, 探究对土壤多功能性的影响.结果表明, 随着土壤微生物多样性降低, 土壤多功能性呈现增加的趋势, 为土壤微生物(细菌、真菌和原生生物)多样性与土壤多功能性之间的负相关关系提供了直接证据.与前人研究相比, 进一步提出了土壤多动能性的变化可能依赖于微生物之间直接或间接的影响.同时也强调了在单一的农业生态系统中, 微生物多样性在生态系统功能上扮演的重要角色, 尤其是挖掘参与生物过程的特定微生物类群的生态功能潜力.总之, 本研究在气候变化和农业集约化生产的全球背景下, 为微生物多样性降低对生态系统多功能性的影响提供了新的见解.
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