2022, Vol. 43
2. 中煤科工重庆设计研究院(集团)有限公司新疆分公司, 乌鲁木齐 830063;
3. 同济大学环境科学与工程学院, 上海 200092
2. Xinjiang Branch of CCTEG Chongqing Engineering (Group) Co., Ltd., Urumqi 830063, China;
3. College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China
固定生物膜-活性污泥(integrated fixed-film activated sludge, IFAS)工艺是在生物处理单元投加轻质悬浮载体, 又设置了污泥回流, 因此同时具有生物膜法能培养世代较长菌群与活性污泥法处理效率高等优点[1].磁混凝技术是通过磁粉的投加而提高混凝效率及污染物去除效果的强化混凝技术[2].由于IFAS可以利用原有的生物反应池, 磁混凝处理效果好, 近几年IFAS+磁混凝工艺在我国一些已建污水处理厂的提标改造中得到应用.有研究表明细菌群落结构直接影响污水生物处理系统的高效稳定运行[3], 同时这些菌群可能携带多种抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)[4], ARGs作为一种新型的生物污染物, 对生态环境和人类健康造成潜在危害, 已经引起人们广泛关注[5].
在IFAS污水处理工艺中, 由于温度[6]、操作参数[7]和载体类型[8]的不同, 微生物群落结构是多种多样的.温度是影响微生物活性的重要环境因素之一, 在各类温度条件下, 低温条件是不利的[9].有研究表明IFAS具有更好的低温适应性, 对氨氮的去除率可以达到99.7%[10].在低温季节, 悬浮载体的存在可以强化硝化菌属Nitrospira的富集, 提升系统的总氮去除效果[11].微生物群落结构会影响污水处理厂中ARGs的传播[12].悬浮活性污泥中广泛多样的细菌为ARGs的传播提供了条件[13], 附着生物膜的紧密性使得细菌可以更高效地通过群体感应和水平基因转移促进信息交换[14].有研究表明单独采用活性污泥法或生物膜法的污水厂对ARGs的去除效率不同[15, 16].新疆地处中纬度亚欧大陆腹地, 冬季气温最低可达-40~-20℃, 非常寒冷, 且冬季长达6个月.IFAS系统同时存在悬浮活性污泥和附着生物膜, 该工艺在寒冷地区污水厂中菌群结构和ARGs变化的研究报道很少.
为此, 本文通过16S rRNA基因测序和宏基因组测序的方法, 对乌鲁木齐某污水厂进水、生物处理单元中悬浮活性污泥和附着生物膜以及出水的细菌群落及其携带的ARGs进行了研究, 以期为污水厂的优化运行及ARGs的控制提供理论基础.
1 材料与方法 1.1 样本采集与预处理乌鲁木齐某城市污水厂采用SPR-Ⅱ型高密度聚乙烯(PEAD)载体, 2018年8月将原氧化沟工艺提标改造成IFAS工艺, 同时, 在二沉池后增加磁混凝深度处理, 出水由《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)二级标准提高至一级A标准.污水厂工艺流程如图 1所示, 污水厂稳定运行后, 采集了该厂进水(Q1)、IFAS生物池内的前缺氧段活性污泥(Q2)、好氧段活性污泥(Q3)、好氧段悬浮载体生物膜(Q4)、后缺氧段活性污泥(Q5)和出水(Q6)共6个样本(平均温度为13℃).
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图 1 污水厂工艺流程示意 Fig. 1 Flow chart of wastewater treatment plant process |
进水样本(Q1)5 000 r·min-1离心15 min后收集离心管沉淀物.活性污泥样本(Q2、Q3和Q5)静置30 min沉淀后倾倒出上清液, 收集活性污泥混合液至50 mL离心管.载体生物膜样本(Q4)使用纯水缓流冲洗后, 用灭菌接种环取载体上的生物膜.出水样本(Q6)经0.22 μm无菌微孔滤膜真空抽滤, 收集滤膜上固体物质.所有样本置于-80℃超低温冰箱保存.
1.2 水质分析项目及方法DO和温度(t)均采用多参数水质仪(HACH, 美国)测定, COD采用快速消解分光光度法测定, BOD5采用稀释与接种法测定, SS采用重量法测定, NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法测定, TN采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法测定, TP采用钼酸铵分光光度法测定.
1.3 细菌群落结构分析所有样本的总DNA提取依照E.Z.N.A. Soil DNA Kit(Omega Bio-tek, 美国)试剂盒说明进行.对细菌16S rRNA基因的V4-V5高变区域进行PCR扩增, 引物为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)[17].利用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序, 按97%的相似度将序列进行OTU聚类, 选取各OTU的代表序列与SILVA数据库进行比较, 以获得物种注释信息.原始测序数据已上传至NCBI序列读取归档(SRA)数据库, 登录号为SRP332775.
1.4 ARGs生物信息学分析利用Illumina NovaSeq测序平台进行宏基因组测序, 使用fastp对适配序列的3′端和5′端进行质量剪切[18], 获得优化序列(reads).使用MEGAHIT对优化序列拼接组装, 并筛选≥300 bp的重叠群(contigs)作为最终拼装结果[19], 然后用MetaGene对筛出的contigs进行ORF预测, 选择核酸长度≥100 bp的基因, 并将其翻译为氨基酸序列[20].采用CD-HIT构建非冗余基因集[21], 采用SOA Paligner将保留的clean reads与非冗余基因集进行比对, 统计基因在对应样品中的丰度信息[22].将非冗余基因集与CARD数据库进行比对, BLASTP比对参数为比对结果期望值(e-value)≤10-5, 比对一致性百分比(identity)≥80%, 比对长度(alignment length)≥25个氨基酸(amino acids)[23], 获得基因对应的抗生素抗性功能注释信息.ARGs的丰度采用每百万条reads中ARGs的reads数量进行标准化[24].原始测序数据已上传至NCBI序列读取归档(SRA)数据库, 登录号为SRP337894.
1.5 数据分析与可视化在R(v 4.0.3)环境下使用vegan、igraph和hmisc软件包[25], 计算细菌类群与ARGs亚型之间的Spearman相关系数, 并用于构建它们的共生网络.数据可视化及模块化分析通过Cytoscape(v 3.8.2)软件实现[26].
2 结果与讨论 2.1 污水厂运行效果该污水厂进水和出水水质变化如图 2所示.COD、BOD5、SS、NH4+-N、TN和TP的去除率平均值由改造前的94.23%、93.19%、93.36%、91.89%、66.76%和76.62%提高至改造后的98.48%、98.66%、97.59%、97.71%、91.90%和98.30%, 出水浓度优于一级A标准.目前我国污水厂提标改造的难点主要是出水中TN不能稳定达标排放[27], 改造后该厂对NH4+-N和TN的去除效果显著提升, 出水中NH4+-N和TN浓度能分别稳定在1.02mg·L-1和6.62mg·L-1以下, 表明IFAS有效增强了寒冷地区污水厂生物脱氮的能力.
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图 2 污水厂水质变化 Fig. 2 Water quality changes in wastewater treatment plant |
由表 1可知, 所有样本的Coverage指数均大于0.99, 表明样本中绝大部分细菌被检测出.Shannon、Chao和Heip指数分别用来衡量群落多样性、物种丰富度和群落均匀度, 且指数值越大, 分别表示群落多样性越高, 物种越丰富, 群落越均匀[28].从Shannon指数可以看出生物膜细菌群落多样性明显高于活性污泥, Chao指数和Heip指数表明生物膜细菌物种丰富度和细菌群落均匀度均高于活性污泥.
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表 1 细菌群落多样性分析 Table 1 Analysis of bacterial community diversity |
2.3 细菌门水平群落结构
所有样本共检测出35个细菌门, 至少在一个样本中相对丰度大于1%的细菌门共有10个, 相对丰度变化见图 3.变形菌门(Proteobacteria)自进水至出水始终为优势菌门.据报道, 变形菌门(Proteobacteria)通过去除有机污染物和反硝化作用在污水厂中发挥了重要作用[29].进水中厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的占比达89.99%, 这些菌门是人类肠道菌群的主要组成部分[30], 体现了以生活污水为主的污水厂进水中细菌群落的特征.活性污泥中的优势菌门为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门, 相对丰度之和达81.11%~83.21%.由于该IFAS系统基于氧化沟工艺改造且采用了污泥回流系统, 微生物在生物处理段内循环, 因此活性污泥样本在门水平上的菌群结构具有相似性.据报道, 在乌鲁木齐采用氧化沟工艺的污水厂中, 绿弯菌门(Chloroflexi)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)在活性污泥中的相对丰度平均值分别为2.70%和0.01%[31], 而该厂绿弯菌门(Chloroflexi)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)在活性污泥中的相对丰度平均值分别为3.50%和0.03%, 在生物膜中的相对丰度分别达到10.02%和2.12%.有研究表明绿弯菌门参与了硝化作用的第二步, 即NO2-的氧化[32], 而硝化螺旋菌门是硝化作用的主要贡献者, 这表明IFAS工艺有更多的生物脱氮菌参与到脱氮过程中.
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图 3 细菌群落门水平相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of bacteria at phylum level |
所有样本共检测出391个细菌属, 至少在一个样本中相对丰度大于1%的细菌属共有33个, 相对丰度变化见图 4.毛球菌属(Trichococcus)、微丝菌属(Candidatus_Microthrix)和不动杆菌属(Acinetobacter)为进水中的优势菌属, 相对丰度分别为16.65%、8.99%和5.24%.研究表明, 毛球菌属(Trichococcus)由于高代谢多样性而能够适应各类环境条件[33].微丝菌属(Candidatus_Microthrix)、Comamonadaceae_unclassified、Ferruginibacter、Saprospiraceae_norank和红育菌属(Rhodoferax)为活性污泥中的优势菌属, 相对丰度分别为13.40%~17.93%、8.19%~10.79%、5.79%~6.31%、5.05%~5.70%和3.83%~5.20%.相比活性污泥, 生物膜中部分菌属有所富集, 如Caldilineaceae_norank的相对丰度由1.25%~1.40%增至2.92%, 毛球菌属(Trichococcus)的相对丰度由3.62%~4.51%增至5.69%.该厂整个生物处理段内Ferruginibacter和红育菌属(Rhodoferax)的相对丰度平均值分别达到5.24%和3.72%, 这与新疆寒冷地区其他污水厂生物处理段菌群结构不同[34].有研究表明, Ferruginibacter是一种异养反硝化细菌[35], 且与铁代谢密切相关, 可促进Fe2+与Fe3+的转化, 微金属颗粒增加时更有利于此类菌属的生长[36].红育菌属(Rhodoferax)也能够进行Fe2+氧化和Fe3+还原, 可以循环利用铁作为电子供体和受体[37].在该厂的深度处理段采用了磁混凝高效沉淀池, 受限于磁分离技术, 铁磁粉回收率不能达到100%, 所产生的化学污泥会携带部分磁粉[38], 这些含磁粉的化学污泥与二沉池产生的剩余生物污泥都进入储泥池, 再进入污泥浓缩池处理.推测储泥池中部分含磁粉混合污泥经溢流管路回流至进水系统是生物处理段内出现较高丰度Ferruginibacter的原因.生物处理段Ferruginibacter进行反硝化过程, 这是对生物脱氮有利的一面, 但生物处理段存在铁磁粉颗粒将加剧载体的摩擦耗损, 会影响载体使用寿命.经磁混凝高效沉淀池后的最终出水中, 红育菌属(Rhodoferax)的相对丰度高达9.48%, 也体现出磁混凝对菌群的影响.
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图 4 细菌群落属水平相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of bacteria at genus level |
生物处理段脱氮除磷功能菌属的丰度变化如图 5所示.亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和硝化螺旋菌属(Nitrospira)分别是常见的氨氧化菌(ammonia oxidizing bacteria, AOB)和亚硝酸盐氧化菌(nitrite oxidizing bacteria, NOB), AOB和NOB在硝化去除NH4+-N过程中起着重要作用, 反硝化菌(denitrifying bacterias, DNBs)则在反硝化去除TN过程中起着重要作用[39].亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)在活性污泥中的相对丰度为0.08%~0.23%, 在生物膜中的相对丰度为0.48%, 硝化螺旋菌属(Nitrospira)的相对丰度在活性污泥中为0.03%~0.04%, 在生物膜中为2.12%.AOB和NOB在生物膜中的相对丰度均高于活性污泥, 表明载体增强了生长缓慢的硝化细菌的富集, 增强了该污水厂对NH4+-N的去除能力.DNBs在活性污泥中的相对丰度为16.18%~16.96%, 在生物膜中的相对丰度为8.02%. DNBs在生物膜中的相对丰度低于活性污泥, 这可能由于PEAD载体的比表面积较高, 有研究表明比表面积较高的载体会影响DNBs的生长[40].低温会影响脱氮功能细菌的活性, 但与脱氮功能细菌相比, 普通异养菌受低温的影响更大[41].该污水厂在低温时期, 进水中BOD5浓度较高, 有更多的有机物被生物脱氮细菌利用以实现高效脱氮.聚磷菌(phosphate accumulating organisms, PAOs)在活性污泥中的相对丰度为0.44%~0.50%, 在生物膜中的相对丰度为0.43%, 系统中聚磷菌相对丰度较低, 该厂磷的达标排放主要依靠化学除磷.
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AOB表示氨氧化菌, NOB表示亚硝酸盐氧化菌, DNBs表示反硝化菌, PAOs表示聚磷菌 图 5 活性污泥和生物膜样本功能菌属分布 Fig. 5 Distribution of functional bacteria in activated sludge and biofilm samples |
各样本中ARGs种类和相对丰度情况如图 6(a)所示.从中可知, ARGs相对丰度由进水中的191.08×10-3‰逐渐降至出水中的32.58×10-3‰, 除氟喹诺酮类(fluoroquinolone)ARGs去除率为48.6%外, 其余类型ARGs去除率均在70.0%以上.活性污泥中ARGs相对丰度为63.25×10-3‰~72.38×10-3‰, 明显高于生物膜中的41.31%×10-3‰.进水共检出16种ARGs类型, 其中多重耐药类(multidrug, 38.73×10-3‰)、大环内酯类林肯酰胺类链阳性菌素B类(MLSB, 38.43×10-3‰)、氨基糖苷类(aminoglycoside, 32.62×10-3‰)、四环素类(tetracycline, 32.09×10-3‰)和磺胺类(sulfonamide, 18.89×10-3‰)为主要的ARGs类型, 相对丰度占比达84.12%.有研究显示MLSB类、四环素类(tetracycline)、氨基糖苷类(aminoglycoside)、β-内酰胺类(beta-lactam)和磺胺类(sulfonamide)ARGs在世界60个国家的未经处理废水中丰度居前[42], 这与本研究的结果相似.
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(a) ARGs种类和相对丰度变化; (b) ARGs优势亚型和相对丰度变化 图 6 各样本中ARGs种类和优势亚型相对丰度变化 Fig. 6 Changes in the relative abundance of ARG types and dominant subtypes in each sample |
ARGs主要亚型如图 6(b)所示.从中可知, sul2、floR和rpoB2在生物膜中的相对丰度分别为5.77×10-3‰、2.52×10-3‰和2.03×10-3‰, 高于活性污泥中的3.15×10-3‰~3.57×10-3‰、1.73×10-3‰~2.24×10-3‰和1.28×10-3‰~1.76×10-3‰, 而其他ARGs亚型在生物膜中的相对丰度均低于活性污泥.在活性污泥中, sul1的相对丰度最高, 其次是msrE、mphE和ANT(3″)-Ⅱa.方差分析显示活性污泥样本中的主要ARGs亚型无显著差异(P＞0.05).有研究表明, 微生物群落的变化直接导致ARGs的变化[43], 在该IFAS系统中, 活性污泥在门水平和属水平上的菌群结构均相似, 是活性污泥中ARGs相似的原因.ARGs的减少与微生物群落的减少呈正相关[44], 而本研究中生物膜比活性污泥具有更丰富的细菌群落, 但生物膜中ARGs的相对丰度并没有高于活性污泥, 这表明载体富集更多世代时间较长细菌时未促进生物膜中ARGs的升高.
2.6 菌群与ARGs间的关系各样本中属水平细菌群落和ARGs之间的共现网络分析如图 7所示.连接线表示节点与节点之间具有显著相关性(Spearman相关系数r＞0.8, 显著性P＜0.01)[45], 红线代表节点相关度最高, 绿线代表节点相关度最低.节点的大小与节点间的显著相关性成正比, 不同着色的节点代表着不同抗药类别的模块.
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图 7 菌属与ARGs的网络分析 Fig. 7 Network analysis between microbial communities at genus level and ARGs |
由图 7可知, 污水厂中相对丰度较高的ARGs如ermB与毛球菌属(Trichococcus), msrE与肠球菌属(Enterococcus), sul1与布劳特氏菌属(Blautia), mphE与嗜酸菌属(Acidovorax)等呈显著正相关关系.当ARGs和菌属之间呈现显著正相关关系时, 一般认为这些菌属可能是ARGs的潜在宿主[46].生物膜富集的Caldilineaceae_norank与sul2显著正相关(r＝0.943, P＜0.01), 毛球菌属(Trichococcus)与floR显著正相关(r＝0.885, P＜0.01), 毛球菌属(Trichococcus)与rpoB2显著正相关(r＝0.828, P＜0.01), 表明生物膜中毛球菌属(Trichococcus)和Caldilineaceae_norank的富集可能促进了sul2、floR和rpoB2等ARGs的相对丰度升高.
3 结论(1) 载体生物膜中绿弯菌门(Chloroflexi)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度达到10.02%和2.12%, NH4+-N和TN的去除率平均值分别由改造前的91.89%和66.76%提升至改造后的97.71%和91.90%, 表明IFAS增强了寒冷地区污水厂的生物脱氮能力.
(2) Ferruginibacter和红育菌属(Rhodoferax)在生物处理段内的相对丰度平均值分别达到5.24%和3.72%, 出水中红育菌属(Rhodoferax)的相对丰度达9.48%, 表明磁粉对污水厂菌群的影响.
(3) ARGs相对丰度由进水中的191.08×10-3‰逐渐降至出水中的32.58×10-3‰, 除氟喹诺酮类(fluoroquinolone)ARGs去除率为48.6%外, 其余类型ARGs去除率均在70.0%以上.活性污泥中ARGs相对丰度为63.25×10-3‰~72.38×10-3‰, 明显高于生物膜中的41.31×10-3‰, 但sul2、floR和rpoB2等ARGs优势亚型在生物膜中相对丰度高于活性污泥.
(4) 网络分析结果表明, Caldilineaceae_norank与sul2呈显著正相关, 毛球菌属(Trichococcus)与floR呈显著正相关, 毛球菌属(Trichococcus)与rpoB2呈显著正相关.
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