环境科学  2022, Vol. 43 Issue (10): 4765-4778   PDF    
土壤改良剂对再生水滴灌根际土壤菌群多样性及病原菌和抗生素抗性基因丰度的影响
崔丙健1,2, 崔二苹1,2, 刘春成1,2, 胡超1,2, 樊向阳1,2, 李中阳1,2, 高峰1,2     
1. 中国农业科学院农田灌溉研究所, 新乡 453002;
2. 中国农业科学院农业水资源高效安全利用重点开放实验室, 新乡 453002
摘要: 基于再生水农业灌溉利用引发的人体健康和环境风险,通过施用土壤改良剂揭示再生水灌溉根际土壤菌群组成与多样性变化特征,并探讨土壤改良剂对根际土壤病原菌和抗生素抗性基因丰度变化的影响规律,对于土壤改良剂的合理施用具有指导意义.采用高通量测序技术和定量PCR检测方法,研究了生物质炭、生物有机肥、腐植酸、松土精和玉米酒糟对再生水滴灌根际土壤细菌群落多样性及特定基因丰度的影响.结果表明,生物质炭处理显著增加根际土壤有机质和总氮含量;生物有机肥处理显著增加EC值和有机质含量;玉米酒糟处理显著增加EC值、总氮和总磷含量(P<0.05).除生物质炭处理外,其他各处理均能显著降低根际土壤pH(P<0.05).5种改良剂处理下根际土壤细菌群落组成与多样性在纲和属水平上较相似,但其相对丰度存在差异.α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Bacteroidia、Actinobacteria、Acidimicrobiia和Anaerolineae为所有处理中的优势菌纲,优势菌属组成包括:PseudomonasSphingobiumSphingomonasCellvibrioAllorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-RhizobiumFlavobacteriumAlgoriphagus(相对丰度>1%).环境因子关联分析表明,根际土壤细菌群落组成与pH、EC、总氮和总磷含量之间存在较强的关联.病原菌与抗生素抗性基因的检出丰度分别在103~107 copies·g-1和104~108 copies·g-1.改良剂对病原菌和抗生素抗性基因检出水平存在较大差异,生物有机肥、松土精和玉米酒糟处理均会导致部分抗生素抗性基因丰度显著增加,而腐植酸和玉米酒糟处理下丁香假单胞菌、茄科雷尔氏菌和大肠菌群丰度显著降低(P<0.05).弓形菌、蜡样芽孢杆菌、成团泛菌和粪拟杆菌与四环素类(tetAtetBtetOtetQ)、磺胺类(sul1)和红霉素类(ermBermC)抗性基因丰度存在显著相关性.研究认为监测再生水灌溉下农业环境中病原菌和抗生素抗性基因的同时,也要关注土壤改良剂的合理施用避免加剧生物污染的散播.
关键词: 再生水      土壤改良剂      细菌群落      病原菌      抗生素抗性基因     
Effects of Soil Amendments on the Bacterial Diversity and Abundances of Pathogens and Antibiotic Resistance Genes in Rhizosphere Soil Under Drip Irrigation with Reclaimed Water
CUI Bing-jian1,2 , CUI Er-ping1,2 , LIU Chun-cheng1,2 , HU Chao1,2 , FAN Xiang-yang1,2 , LI Zhong-yang1,2 , GAO Feng1,2     
1. Institute of Farmland Irrigation, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xinxiang 453002, China;
2. Key Laboratory of High-efficient and Safe Utilization of Agriculture Water Resources, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xinxiang 453002, China
Abstract: Due to reclaimed water, irrigation can cause human health and environmental risks. Soil amendments are applied to reveal the abundance of pathogens and antibiotic resistance genes in rhizosphere soil irrigated by reclaimed water and to better understand the effects of environmental factors on the rhizosphere soil bacterial composition, which has guiding significance for the reasonable use of soil amendments. In this study, the effects of biochar, bioorganic fertilizer, humic acid, loosening soil essence, and corn vinasse on bacterial community diversity and certain gene abundances in rhizosphere soil under drip irrigation with reclaimed water were studied using high-throughput assays and quantitative PCR. The results showed that biochar significantly increased pH, organic matter, and total nitrogen contents in the rhizosphere soil. The corn vinasse significantly decreased soil pH and increased the contents of total nitrogen and total phosphorus but significantly increased the soil EC value (P < 0.05). The effects of the five soil amendments on the α-diversity of rhizosphere bacteria were not significantly different. The bacterial community structure and diversity of rhizosphere bacteria were similar at different taxonomic levels, but their relative abundance was different. α-Proteobacteria, γ-Proteobacteria, Bacteroidia, Actinobacteria, Acidimicrobiia, and Anaerolineae were the dominant bacteria in all treatments. The dominant genera consisted of Pseudomonas, Sphingobium, Sphingomonas, Cellvibrio, Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium, Flavobacterium, and Algoriphagus (relative abundance>1%). Correlation analysis of environmental factors showed that the composition of the rhizosphere bacterial community was strongly correlated with pH, EC, total nitrogen, and total phosphorus content. The abundances of pathogenic bacteria and antibiotic resistance genes were 103-107 copies·g-1 and 104-108 copies·g-1, respectively. There were significant differences in the detection levels of pathogens and antibiotic resistance genes. Bioorganic fertilizer, loosening soil essence, and corn vinasse significantly increased the abundances of some antibiotic resistance genes, whereas humic acid and corn vinasse significantly decreased the abundances of Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, and total coliforms (P < 0.05). A significant correlation was found between pathogens (Arcobacter, Bacillus cereus, Pantoea agglomerans, and Fecal bacteroidetes) and antibiotic resistance genes (tetA, tetB, tetO, tetQ, sul1, ermB, and ermC). In conclusion, while monitoring pathogens and antibiotic resistance genes in the agricultural environment under reclaimed water irrigation, attention should be paid to the rational application of soil amendments to avoid exacerbating the spread of biological contamination.
Key words: reclaimed water      soil amendments      bacterial community      pathogens      antibiotic resistance genes     

再生水是缓解供水压力和补充农业灌溉用水不足的重要替代水源, 其回用已成为水资源匮乏地区发展灌溉农业的有效途径.文献[1]明确提出了将污水资源化利用作为节水开源的重要内容, 再生水纳入水资源统一配置, 实现再生水规模化利用和试点示范. 2018年, 全国再生水利用量达到73.5亿m3[2].预计到2030年, 再生水农业灌溉利用量可达16.45亿m3[3].随着污水处理工艺持续改进, 再生水水质不断提高, 有效降低了其利用的环境风险.利用再生水进行农业生产成为一种可行的选择, 但再生水除了保留部分养分外, 还含有盐分、痕量有毒有害物质和病原菌等风险因子, 易造成潜在环境风险和人体健康风险, 严重制约再生水灌溉农业的可持续发展.

再生水灌溉有利于土壤微生物生物量和酶活性的提高, 促进了土壤细菌、真菌和放线菌数量的增加, 其与土壤养分密切相关[4~6].然而, 再生水中残留病原菌和抗生素抗性基因的释放可能导致其在灌溉土壤微环境中增殖和传播.再生水灌溉土壤中作为水平基因转移潜力的指示基因整合酶基因(integrase gene, intI1)与tetGsul1sul2基因呈显著正相关, sul2intI1克隆与某些致病菌具有高度的同源性[7].施用土壤改良剂是土壤农艺调控措施的重要手段, 在改善土壤结构、提高土壤水分和养分以及降低土壤环境危害方面表现出巨大潜力.生物质炭由于其在固碳、培肥和固定污染物等方面的潜力而受到越来越多的关注.Duan等[8]报道了生物质炭可有效降低土壤和作物中人类条件致病菌的数量, 崔二苹等[9]的研究发现生物质炭对再生水灌溉根际土壤病原菌的检出水平与其种类有关.然而, 生物质炭会降低土壤中抗生素的表观分配系数使交换态或水溶态抗生素增多, 增加了抗生素迁移性和抗性基因的传播风险[10].有研究表明, 生物质炭、腐植酸和生物有机肥不仅可以改善土壤结构和提高作物产量[11~13], 还能有效抑制土壤真菌病原对作物根部的侵袭[14~16].生石灰、松土精和腐植酸配施能提高作物抗病性和根部土壤酶活性[17].酒糟是富含有机质和含氧活性基团的生物质原料, 可以促进土壤中无机磷的释放[18].综上, 在利用不同土壤农艺调控措施时, 需综合考虑改良剂的性质与可能引发的农业环境风险.

再生水灌溉下施用土壤改良剂可直接或间接通过改变土壤理化性质而影响根际土壤细菌群落结构和多样性, 合理选择土壤改良剂对阻控再生水灌溉下病原菌及抗性基因污染风险具有重要意义.目前针对再生水灌溉的环境效应研究相对较多, 而关于生物质炭、生物有机肥、腐植酸、松土精和玉米酒糟对再生水灌溉土壤理化性质和微生物群落结构及多样性影响的研究报道较少.本研究基于高通量测序技术和定量PCR方法, 综合分析了施用不同土壤改良剂处理条件下再生水灌溉根际土壤细菌菌群多样性及常见的抗生素抗性基因(四环素类、磺胺类、红霉素和氟苯尼考抗性基因)、人类条件致病菌和植物病原菌丰度水平, 并结合相关环境因子探究影响细菌群落相对丰度和关键基因丰度变化的主要因素, 以期为深入了解再生水灌溉风险、合理施用土壤改良剂提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 供试材料与试剂

本试验采用5种常见土壤改良剂:花生壳生物质炭(BC)购自河南省商丘市三利新能源有限公司; 生物有机肥(BF)、松土精(S)购自山东绿陇作物营养有限公司; 腐植酸(HA, 腐植酸≥65%、黄腐酸≥30%)购自深圳市杜高生物新技术有限公司; 玉米酒糟(V)购自新乡市先丰医药新材料有限公司.FastDNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals公司, 美国); TB GreenTM Premix Ex TaqTM、pMDTM 19-T Vector(Takara公司, 大连); 高纯质粒小量制备试剂盒(百泰克生物技术有限公司, 无锡); LB液体和固体培养基(生工生物工程股份有限公司, 上海).

1.2 试验设计

本试验于2020年6~8月在中国农业科学院新乡野外观测试验站阳光板温室进行.供试作物为矮生番茄, 购自山东禾之元种业公司.试验土壤取自周边农田, 类型为壤土, 其基本理化性质如下:pH为8.22, 电导率(EC)为314 μS·cm-1, ω[总氮(TN)]为0.48 g·kg-1, ω[总磷(TP)]为0.42 g·kg-1, ω[铜(Cu)]、ω[锌(Zn)]、ω[铅(Pb)]和ω[镉(Cd)]分别为23.17、49.73、29.32和0.074 mg·kg-1.本试验用再生水取自某城市生活污水处理厂, 采用“A2O+高效沉淀池+反硝化深床滤池”工艺, 处理后的出水水质满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A排放标准要求, 同时也符合《农田灌溉水质标准》(GB 5084-2021).试验期间污水处理厂出水池的再生水由罐车运输至试验站, 储存于地下水泥蓄水池中备用.再生水蓄水池通过潜水泵将水抽入供水压力罐, 再由管道分配输送至田间小区和温室大棚所需区域.

本试验在盛土150 kg的蔬菜种植槽(长160 cm×宽40 cm×高38 cm)中进行, 幼苗移栽前一次性施入底肥, 所有处理施肥量相同(尿素200 mg·kg-1+过磷酸钙150 mg·kg-1+氯化钾100 mg·kg-1).本试验设置7个处理, 分别为:清水灌溉(PW)、再生水灌溉(RW)、再生水灌溉+生物质炭(RBC)、再生水灌溉+生物有机肥(RBF)、再生水灌溉+腐植酸(RHA)、再生水灌溉+松土精(RS)和再生水灌溉+玉米酒糟(RV).生物有机肥、腐植酸和松土精施用量按使用说明(分别为200、100和100 mg·kg-1), 酒糟按质量比1%施用量, 生物质炭按质量比2%施用量.灌溉方式采用浅埋地表滴灌, 以清水和再生水为灌溉水源, 滴灌带滴头流量2.5 L·h-1, 每个处理重复3次.

本试验结束后, 采用抖落法将番茄根部松散的土壤去除后, 使用无菌毛刷从根部收集黏附的根际土壤, 真空冷冻干燥后过2 mm孔径尼龙筛, 置于-80℃冰箱保存, 用于后续理化性质检测与微生物多样性分析.

1.3 测定方法 1.3.1 理化测试分析与土壤DNA提取

按土水比1∶2.5混合剧烈振荡30 min后静置3 h, 利用pH计(Thermo Scientific Orion A211, 美国)与电导率仪(雷磁DDB, 上海)分别测定根际土壤pH和电导率(EC).采用低温外热重铬酸钾氧化-比色法测定有机质(OM)含量.根际土壤经酸消煮后利用连续流动分析仪(Seal-AA3, 德国)测定总氮(TN)和总磷(TP), 土壤加酸微波消解后利用原子吸收分光光度计(岛津AA-6300, 日本)测定Cu、Zn、Cd和Pb这4种重金属全量.

利用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals, 美国)从根际土壤中提取基因组DNA.利用超微量分光光度计(SpectraMax® QuickDropTM, Molecular Devices公司, 美国)检测DNA浓度及纯度.

1.3.2 高通量测序

利用16S rRNA基因V3-V4区引物338F(ACT CCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHV GGGTWTCTAAT)[19]在ABI GeneAmp 9700 PCR扩增仪上对根际土壤细菌DNA进行PCR扩增.PCR反应体系如下:FastPfu Buffer(5×TransGen)4 μL, 2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL, 5 μmol·L-1正反向引物各0.8 μL, FastPfu Polymerase 0.4 μL, 10 ng模板DNA, ddH2O补足至20 μL.PCR反应条件:95℃预变性3 min; 随后30个温度循环(95℃变性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸45 s); 最后72℃延伸10 min, 保持10℃恒温孵育.基于Illumina MiSeq PE300测序平台(Illumina Inc., 美国), 利用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit对PCR扩增产物构建PE文库进行双末端测序.

1.3.3 定量PCR检测

利用功能基因、病原菌毒力基因和抗生素抗性基因引物[33]对根际土壤DNA进行定量PCR检测, 部分引物信息详见表 1.利用TA克隆方法将扩增的基因片段插入到pMDTM 19-T Vector(Takara公司, 大连)中来分别制备相应的标准质粒, 然后将已知质粒拷贝数进行10倍稀释8个梯度作为标准模板构建标准曲线.基于美国伯乐BIO-RAD CFX ConnectTM荧光定量PCR检测系统, 利用TB GreenTM Premix Ex TaqTM染料法进行基因丰度的定量检测.反应体系包括10 μL 2×TB GreenTM Premix Ex TaqTM, 0.4 μL正反向引物, 2 μL模板, 无菌水补足至20 μL.最佳反应条件:95℃预变性30 s; 95℃变性5 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 40个循环, 每个样品重复3次, 以无菌水作为阴性对照.

表 1 用于定量PCR检测的引物 Table 1 Primers for quantitative PCR detection

1.4 数据分析

基于美吉I-Sanger生信云平台分析根际土壤细菌群落多样性与结构变化特征, 具体步骤如下:①采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学聚类, 利用mothur计算α多样性指数; ②利用R语言(version 3.3.1)工具绘制Venn图, 基于Silva(Release138 http://www.arb-silva.de)数据库比对分析各样本的群落物种组成; ③利用R语言进行环境因子关联分析和作图, 包括冗余分析(RDA)和相关性热图.

利用Hem Ⅰ热图软件对定量基因丰度进行作图, 不同处理组的差异分析采用SPSS 20.0进行单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)和LSD多重比较检验, P<0.05表示差异有统计学意义.

2 结果与分析 2.1 土壤理化性质

不同处理间根际土壤理化性质变化如表 2所示.与清水灌溉相比, 再生水灌溉显著增加了根际土壤pH、EC和Pb含量(P<0.05).添加生物有机肥、腐植酸、松土精和玉米酒糟均会导致根际土壤pH显著降低(P<0.05); 不同土壤改良剂的添加均可增加再生水灌溉根际土壤EC, 并且生物有机肥和玉米酒糟的作用效果更加显著(P<0.05); 施用生物质炭和生物有机肥显著增加土壤有机质含量, 生物质炭处理下总氮含量也显著增加(P<0.05); 玉米酒糟处理下根际土壤总氮和总磷含量显著增加(P<0.05); 各处理间重金属含量无显著变化.上述分析表明, 不同土壤改良剂对根际土壤性质的影响是由其性质差异造成的, 施用土壤改良剂可以在一定程度上改善土壤结构并提高土壤养分.

表 2 根际土壤理化性质1) Table 2 Properties of rhizosphere soil in different treatments

2.2 根际土壤细菌群落结构与多样性分析 2.2.1 根际土壤细菌群落组成与α多样性

按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类, 得到OTU的代表序列, 所有处理按最小样本序列数抽平后的有效序列数为19 146. 21个根际土壤样品共获得OTU数目4 131个, 对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学划分, 统计各样本的群落物种组成信息如下:37个门、106个纲、271个目、437个科和799个属.从表 3可以看出, 处理间细菌α多样性比较分析结果表明不同处理对Ace指数、Chao1指数和覆盖度无显著影响; 玉米酒糟处理增加了Sob指数和Shannon指数, 而降低了Simpson指数, 表明其处理的根际土壤细菌群落多样性高于其他处理.

表 3 不同处理细菌α多样性指数 Table 3 Bacterial community α diversity indices in different treatments

各处理间共有和独有OTU的Venn图分析可以直观地展现物种组成的相似性和重叠情况, 从图 1可以看出7个处理组分别有101、36、42、47、39、33和238个独有OTU, 所有处理组共有1 314个核心OTU.结果表明施用土壤改良剂可以一定程度影响根际土壤细菌群落组成, 各处理均聚集了相当数量的独有OTU数目, 其中玉米酒糟处理中独有OTU数目高于其他处理.

图 1 不同处理间根际土壤细菌OTUs组成Venn图 Fig. 1 Venn diagram of core OTUs among different treatments

在不同分类学水平上统计各样本中物种组成信息, 分析优势物种多样性及其相对丰度, 将相对丰度低于1%的物种合并为others.由图 2(a)可知, 各处理纲水平优势细菌群落组成相同, 而相对丰度存在差异. α-变形菌纲(α-Proteobacteria)和γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)属于变形菌门, 相对丰度分别为16.75% ~19.72%和19.4% ~27.14%; 拟杆菌纲(Bacteroidia)属于拟杆菌门, 相对丰度为13.87% ~19.79%; 放线菌纲(Actinobacteria)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)和酸微菌纲(Acidimicrobiia)均属于放线菌门, 相对丰度分别为4.84% ~8.88%、0.61% ~1.28%和2.49% ~5.66%; 厌氧绳菌纲(Anaerolineae)和绿弯菌纲(Chloroflexia)属于绿弯菌门, 相对丰度分别为5.76% ~8.86%和1.08% ~1.79%; Vicinamibacteria纲与Blastocatellia纲属于酸杆菌门, 相对丰度分别为1.86% ~5.18%和1.15% ~1.83%; 此外, 还有酸杆菌纲(Acidobacteriae)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)、多伊卡菌纲(Dojkabacteria)、Saccharimonadia纲、Phycisphaerae纲和疣微菌纲(Verrucomicrobiae)等一些相对丰度较低的物种类群, 在细菌种群数量中的相对丰度均低于2%.变形菌门(Proteobacteria, 36.15% ~46.44%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 13.87% ~19.79%)、放线菌门(Actinobacteria, 7.93% ~15.77%)、绿弯菌门(Chloroflexi, 7.38% ~10.23%)和酸杆菌门(Acidobacteria, 4.26% ~9.02%)均是各处理中最优势的5个类群, 在每个样本中物种相对丰度均达到85%以上.再生水灌溉较清水灌溉增加了变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)相对丰度, 降低了绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度.土壤改良剂影响再生水灌溉根际土壤主要菌群相对丰度, 其中玉米酒糟处理样本的Patescibacteria门、芽单胞菌门(Gemmatimonadota)和厚壁菌门(Firmicutes)在菌群中的相对丰度显著高于其他处理.

(a)纲水平; (b)属水平 图 2 纲水平和属水平根际土壤细菌群落组成相对丰度 Fig. 2 Bacterial community composition at the class level and genus level in rhizosphere soil

图 2(b)所示, 属水平上细菌群落结构和相对丰度呈现动态变化趋势.丰度前36的优势属占总序列的比例超过45%, 将在所有样本中相对丰度均小于1%的物种归为others.各处理细菌群落组成分析表明不同样本在属水平优势物种相同, 但相对丰度呈现差异.优势菌属的相对丰度在各处理中的分布如下:假单胞菌属(Pseudomonas, 2.04% ~7.25%)、黄杆菌属(Flavobacterium, 2.87% ~6.2%)、食冷菌属(Algoriphagus, 0.97% ~3.84%)、鞘脂菌属(Sphingobium, 1.1% ~2.75%)、纤维弧菌属(Cellvibrio, 1.18% ~4.74%)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas, 1.17% ~2.25%)、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium(0.57% ~3.82%)和类诺卡氏菌属(Nocardioides, 0.57% ~1.53%).与清水灌溉相比, 再生水灌溉显著增加假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度.生物有机肥和玉米酒糟处理能显著降低再生水灌溉根际土壤假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度.除了玉米酒糟处理, 施用土壤改良剂使再生水灌溉根际土壤中食冷菌属(Algoriphagus)的相对丰度显著提高.纤维弧菌属(Cellvibrio)和Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium在松土精处理的根际土壤中维持较高的相对丰度.与其他处理相比, 施用玉米酒糟对细菌群落组成的影响较大, 食冷菌属(Algoriphagus)、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium和鞘脂菌属(Sphingobium)显著降低, 而未分类的芽单胞菌菌科(Gemmatimonadaceae)和Microscillaceae的相对丰度显著降低.

2.2.2 β多样性与环境因子关联分析

通过主坐标分析(PCoA)发现, PC1轴和PC2轴对结果的解释度分别为29.13%和14.98%(图 3).生物质炭、生物有机肥、腐植酸和松土精处理的细菌菌群组成相似, 清水灌溉及再生水灌溉配施玉米酒糟与其他处理的群落组成差异较大.PERMANOVA进一步分析结果显示, 不同分组处理条件下根际土壤细菌组成呈现显著差异(F=3.339 8, R2=0.588 7, P=0.001 0).

图 3 不同处理样本间群落组成PCoA Fig. 3 Principal coordinates analysis (PCoA) of bacterial community composition in rhizosphere soil

细菌优势菌属与环境因子的相关性Heatmap图分析表明, 环境因子与20个优势菌属丰度呈显著正相关(P<0.05), 并与23个优势菌属丰度呈显著负相关(P<0.05)(图 4).土壤pH、EC、TN、TP和Cd与优势菌属丰度变化密切相关, pH与假单胞菌属(Pseudomonas)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)和鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)呈极显著正相关(P<0.01), 与链霉菌属(Streptomyces)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、微杆菌属(Microbacterium)和Iamia呈显著正相关(P<0.05); EC与假单胞菌属(Pseudomonas)和鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)呈极显著负相关(P<0.01), 与芽孢杆菌属及一些未分类的菌科呈显著正相关(P<0.05); 噬氢菌属(Hydrogenophaga)和未分类的微杆菌科均与TN和TP呈显著负相关(P<0.05), 未分类的Gemmatimonadaceae、Proteobacteria和Saprospiraceae与TP呈显著正相关(P<0.05); Cd与Fluviicola呈显著正相关, 而与未分类的Dojkabacteria和Proteobacteria呈显著负相关(P<0.05).Mantel test和方差分解分析(VPA)表明, 有机质(OM)、总氮(TN)和总磷(TP)对细菌群落结构有显著影响(R2=0.364 6, P=0.021 0), 土壤养分指标(贡献率30.85%)较其他指标更能影响细菌群落的变化.

*表示P≤0.05, **表示P≤0.01, ***表示P≤0.001 图 4 环境因子与物种Heatmap分析 Fig. 4 Correlation heatmap of the top fifty genera and soil properties

2.3 N功能基因、病原菌及抗生素抗性基因丰度定量结果

各处理根际土壤选定基因丰度的定量结果如图 5所示.与清水灌溉相比, 再生水灌溉使根际土壤丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和dfrA1丰度显著增加, 而显著降低了氨氧化古菌和tetO丰度(P<0.05).不同改良剂对根际土壤固氮菌、氨氧化细菌及脲酶等功能基因丰度无显著影响.与再生水灌溉相比, 施用松土精(RS)和玉米酒糟(RV)处理分别显著增加了碱性磷酸酶活性与氨氧化古菌丰度(P<0.05).选定基因的丰度变化在RW和RBC处理之间无显著差异, 土壤改良剂对病原菌和抗生素抗性基因丰度的显著影响主要体现在生物有机肥、腐植酸、松土精和玉米酒糟的施用.添加腐植酸处理显著降低了再生水滴灌根际土壤丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)丰度(P<0.05); 玉米酒糟处理下再生水灌溉根际土壤中布氏弓形菌(Arcobacter butzleri)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)丰度显著增加, 而显著降低了茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和大肠菌群的丰度(P<0.05).本文利用定量PCR技术分析了与5种抗生素有关的12种抗性基因.抗生素抗性基因在不同处理中的检出丰度存在明显的差异, 其数量级均在104~108 copies·g-1土样, 其中tetBsul1sul2intI1在根际土壤中的检出水平较高. tetQtetWcfr在各处理之间的检出丰度无显著差异.生物有机肥处理下再生水灌溉根际土壤中ermBdfrA1丰度显著增加; 腐植酸处理使tetO丰度显著降低; 添加松土精显著增加了tetAtetXsul1intI1丰度; 玉米酒糟处理导致tetAtetBtetXermBermCsul2丰度显著增加(P<0.05, P<0.01).值得注意的是玉米酒糟处理下根际土壤中多数抗生素抗性基因丰度均呈现显著增加, 表明抗生素抗性基因丰度与土壤改良剂自身性质及其调控土壤理化性质密切相关.

*表示P<0.05, **表示P<0.01; 红色星号表示显著增加, 黑色星号表示显著降低; 色柱表示基因丰度大小 图 5 不同处理条件下特定基因丰度变化 Fig. 5 Changes in certain gene abundances in different treatments

环境因子与病原菌、抗生素抗性基因之间相关性分析如表 4所示, 可以看出土壤pH与布氏弓形菌(Arcobacter butzleri)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus) 和ermC呈显著负相关, 与sul1呈显著正相关; 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、ermBermC与土壤EC呈显著正相关; TP与布氏弓形菌(Arcobacter butzleri)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、tetAtetB呈显著正相关, 而与茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum) 和大肠菌群呈显著负相关; Cd和Pb分别与大肠菌群和dfrA1呈显著正相关.弓形菌与四环素抗性基因(tetAtetBtetO)、红霉素抗性基因(ermBermC) 及磺胺类抗性基因(sul1)都存在显著的相关性; 蜡样芽孢杆菌与tetAermBermC呈显著正相关; 大肠菌群与tetBcfr呈显著负相关; 丁香假单胞菌与ermB呈显著正相关; tetQ与成团泛菌和粪拟杆菌呈显著正相关; intI 1基因丰度与四环素抗性基因(tetQtetW)和磺胺类抗性基因(sul2)丰度之间有显著相关性.综上可知, 病原菌和抗生素抗性基因普遍存在于根际土壤中, 表明抗生素抗性基因的散播可能导致某些病原菌抗生素抗性的增加.

表 4 土壤物化指标与病原菌和抗生素抗性基因的皮尔逊相关系数1) Table 4 Pearson's correlation coefficient of soil properties and pathogens and antibiotic resistance genes

3 讨论 3.1 不同土壤改良剂对再生水滴灌根际土壤理化性质的影响

有研究报道再生水灌溉使各种盐分离子在土壤中累积, 从而导致土壤EC值升高和pH降低[34, 35], 其滴灌条件下土壤有机质和有效磷含量也显著提高[36].生物质炭可以提高土壤对养分的吸持能力, 并对土壤碳具有增汇减排作用, 在农业生产和环境修复方面应用前景广阔[37].生物质炭一般呈碱性, 可提高土壤pH, 增加土壤交换性盐基阳离子含量[38].本研究中添加生物质炭处理并未显著增加土壤pH, 但显著增加了根际土壤的有机质含量, 这与已有的研究结果一致[39].生物有机肥含有的活性菌可活化土壤中的氮、磷, 改善土壤理化性质.王俊红等[40]的研究表明施用生物有机肥提高了根际土壤有机质、总氮、速效磷和速效钾含量, 这主要是由于生物有机肥中含有丰富的养分及微生物, 通过改善根际环境促进了土壤养分循环利用.松土精是一种高分子生物聚合物, 可改善土壤团粒结构, 并有效增加土壤的透气性和渗水能力.罗俊等[41]的研究发现添加松土精处理使土壤紧实度和容重降低, pH值、孔隙度和有机质含量增加.有研究表明酒糟中含有的有机酸能够中和盐碱土中的氢氧根离子而降低土壤pH值, 使其在碱性土壤改良方面具有显著的效果[42].添加酒糟处理能显著增加再生水灌溉根际土壤总氮和总磷含量.有研究发现施用酒糟增加了土壤微生物生物量, 其有机质矿化增加了土壤NO3--N含量[43].也有报道指出酒糟处理会增加土壤氮及交换性Na+、K+和有效Mn的含量[44].针对不同土壤改良剂对土壤物化性质的负面效应研究还有待进一步探讨.

3.2 土壤改良剂对根际土壤细菌群落多样性变化特征的影响

再生水灌溉对土壤、水源和公共卫生影响的严重程度不仅与水质有关, 还取决于土壤性质、植物种类、气候、灌溉类型和农业管理实践等, 应采取风险防控措施来缓解其负面影响.施用土壤改良剂是农艺调控措施的重要手段, 在改善土壤结构、提高土壤养分、增加微生物多样性以及降低土壤环境危害等方面表现出巨大潜力.施用土壤改良剂对再生水灌溉根际土壤微生物群落重塑作用缺乏系统研究, 生物信息学方法为拓展认识根际土壤微生物群落结构和多样性提供了分析手段.通过细菌群落相对丰度分析, 各处理在门水平上的核心菌群组成相似, 变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria)是共有的优势菌群.门水平上, 各处理间细菌菌群组成与相对丰度变化较小.属水平上再生水灌溉优势菌属PseudomonasAllorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-RhizobiumSphingomonasLysobacterAlgoriphagusMuricaudaNocardioides的相对丰度增加, Streptomyces和一些未分类菌群降低为非优势菌属.再生水灌溉可显著增加土壤中Acidobacteria和Planctomycetes的相对丰度, 降低Firmicutes和Tectomicrobia的相对丰度, 菌群结构主要受TN、TP、DOC和Eh影响[45].再生水灌溉可引起土壤环境因子的变化, 进而影响微生物群落结构和多样性.有研究发现, 在半干旱土壤中长期利用再生水灌溉可以促进土壤微生物群落的活性, 土壤微生物的代谢效率及总水解酶和磷酸酶的活性显著提高[46, 47].土壤改良剂处理下优势菌群的丰度变化也各有不同, 低丰度物种组成有所差异, 其中添加松土精和玉米酒糟处理的影响作用更加显著.施用生物质炭为根际土壤生境提供了足够的养分, 为微生物繁殖生长营造了适宜环境.生物质炭配施有机肥处理显著提高了土壤放线菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌相对丰度, 施用生物有机肥会提高土壤芽孢杆菌和硝化螺菌相对丰度促进土壤硝化过程[48, 49].有研究发现, 添加生物质炭对土壤细菌丰富度影响不大, 而添加酒糟处理则使土壤细菌丰富度显著增加[50].有研究发现, 添加松土精处理能提高土壤耕层细菌物种多样性和丰富度, 降低Proteobacteria和Acidobacteria的相对丰度, 增加Actinobacteria和Chloroflexi的相对丰度, 这与本研究的结果较一致[41].土壤微生物群落对土壤养分循环和土壤结构维持具有重要作用, 生物有机肥调控土壤微生物群落的稳定.生物有机肥可显著影响变形菌门和放线菌门的相对丰度, 通过调控土壤微生物群落来提高土壤的抑病能力[51].腐植酸不仅可以改善土壤结构和提高作物产量, 还能有效抑制土传病菌对作物根部的侵袭[13, 16].各处理组间的优势菌属相似, 包括潜在的病原菌属、有益菌属和功能菌属.假单胞菌属是根际土壤中重要的优势菌属, 具有促生、固氮和生物防治等功能特性, 其中的一些种类也是常见的植物病原菌.再生水灌溉导致假单胞菌属在根际显著富集, 经玉米酒糟处理后可显著降低其相对丰度.施用土壤改良剂使Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-RhizobiumCellvibrioBacillusNocardioides等有益菌属的相对丰度升高.土壤细菌群落的重塑主要取决于土壤理化性质, 而土壤理化性质又受土壤改良剂的调控.因此, 本研究中探讨的土壤性质、土壤改良剂与土壤微生物组成之间的联系, 为再生水灌溉农艺管控措施和调控策略的可行性提供了理论依据.

3.3 土壤改良剂对根际土壤特定基因丰度变化的影响

本研究在明确选用的土壤改良剂对土壤理化性质影响的基础上, 探讨再生水灌溉根际土壤功能菌群、病原菌和抗生素抗性基因丰度对施用不同土壤改良剂的响应变化.有研究发现, 添加生物质炭会增加土壤养分, 并促进碱性环境形成, 从而降低了AOA菌群丰度[52].另有研究表明施用生物有机肥可显著增加AOB丰度, 但对AOA丰度的影响并不显著[53].董莲华等[54]报道添加腐植酸可抑制土壤中AOA数量而调控其与植物竞争氨来减少氨的损失, 从而提高尿素利用率.本研究的结果显示添加松土精和玉米酒糟处理使再生水滴灌根际土壤中AOA菌群丰度及碱性磷酸酶活性显著增加, 而其他改良剂处理对功能菌群的影响并不显著.污水厂处理工艺可以有效去除大多数病原菌和抗生素抗性基因, 但是对于一些抗逆性强的种类去除效果不太理想, 因此再生水回用的潜在生物风险需要给予高度重视. 2020年5月欧盟发布了关于再生水回用最低质量要求(minimum quality requirements, MQR)的新法规, 明确再生水用于农业灌溉不仅要建立先进的消毒处理设施, 还要维护配送和储存系统[55].滴灌是再生水最适宜的灌溉方式之一, 但再生水中病原菌易在根区环境定植并累积, 对农业环境与人类健康构成潜在危害.弓形菌(Arcobacter)为变形菌门(Proteobacteria)ε-变形菌纲(ε-Proteobacteria)弯曲菌目(Campylobacterales)弯曲菌科(Campylobacteraceae)的一个新属, 其中的嗜低温弓形菌(A. cryaerophilus)、布氏弓形菌(A. butzleri)和斯氏弓形菌(A. skirrowii)被认为是人畜共患的新型食源性和水源性病原菌, 可通过水体媒介引起肠道疾病与菌血症等[56, 57].添加玉米酒糟处理下布氏弓形菌、蜡样芽孢杆菌和丁香假单胞菌在根际土壤中显著富集, 而降低了茄科雷尔氏菌和大肠菌群的丰度.植物病原可能存在于根际, 易导致作物减产和土壤传播疾病流行.腐植酸由脂肪族和芳香族有机酸组成, 添加到土壤中可以直接或间接影响植物和根际环境的生理生化过程, 已有研究证实腐植酸在控制镰孢菌引起的植物枯萎病方面作用显著[58].腐植酸处理显著降低了植物病原菌丁香假单胞菌的丰度.细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌引起的一种危害多种农作物生产的常见土传植物病害, 有文献报道生物有机肥可通过影响青枯病菌群落组成和减少其种群数量来有效抑制青枯病[59].尽管再生水灌溉没有显著增加土壤中茄科雷尔氏菌丰度, 但添加玉米酒糟处理对茄科雷尔氏菌有一定的阻控效果.再生水作为抗生素抗性基因的一个重要储库, 尤其是再生水输入点和回用点观察到ARGs再生长可能导致土壤中其丰度增加.再生水灌溉会导致ARGs持续释放到农业环境中对人类健康造成潜在风险, 这归因于与人类相关的易感致病菌可以通过获得抗性基因而产生抗性.一项长期的田间试验研究表明, 再生水灌溉土壤中没有观察到sul1sul2tetOermBermF丰度增加[60].再生水灌溉根际土壤抗生素抗性基因丰度变化随不同土壤改良剂的添加呈现较大差异.Liu等[61]首次证实溶解性生物质炭中的腐植酸类物质可以显著提高ARGs在细菌之间的转移效率, 因此生物质炭使用时应考虑其溶解的生物效应以降低生态和人类健康风险.Zhang等[62]的研究发现天然沸石可以降低污泥堆肥中ARGs的环境风险, 这可能与其多孔结构和降低重金属选择压力的能力有关.有机肥的施用增加了可移动遗传元件的丰度, 其与大多数ARGs呈显著正相关, 表明水平基因转移可能通过可移动遗传元件促进ARGs在土壤细菌中传播[63].施用土壤改良剂显著改变了土壤微生物群落, 这被认为是影响土壤ARGs分布的主要因素. intI 1基因与tetWsul2基因的检出丰度之间有显著正相关关系, 可能促进此类ARGs的水平转移.玉米酒糟对病原菌和ARGs丰度的影响尚未有研究, 研究表明添加酒糟处理显著增加了大多数病原菌和ARGs在根际土壤中的丰度, 推测可能是其营造的酸性环境及本身大量含氧官能团为污染物提供了吸附位点.添加松土精和玉米酒糟处理导致抗生素抗性基因富集的作用机制尚不清楚, 其与化肥的配施和混施还有待进一步探讨.

4 结论

(1) 再生水滴灌条件下生物有机肥、腐植酸、松土精和玉米酒糟处理能够显著降低根际土壤pH; 土壤改良剂处理下根际土壤EC值均有不同程度增加, 生物有机肥和松土精处理EC值增加显著; 生物质炭处理显著提高有机质和总氮含量; 生物有机肥显著增加了根际土壤有机质含量, 而玉米酒糟提高了总氮和总磷含量.可见, 土壤理化性质变化与土壤改良剂类型密切相关.

(2) 添加改良剂可通过改善土壤理化性质而影响土壤细菌群落结构与多样性.不同土壤改良剂处理下根际土壤细菌物种丰富度无显著变化, 玉米酒糟处理增加了细菌群落多样性.各处理间纲、属分类水平菌群组成相似, 纲水平优势菌群为: γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Anaerolineae、Acidimicrobiia和Gemmatimonadetes, 优势菌属包括: PseudomonasSphingobiumSphingomonasCellvibrioAllorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-RhizobiumStreptomycesFlavobacterium.土壤OM、TN和TP含量变化是显著影响再生水灌溉根际土壤细菌菌群组成与多样性的关键因子.相关性Heatmap图分析表明, 土壤pH、EC、TN和TP与优势菌属PseudomonasHydrogenophagaDevosiaNocardioides、StreptomycesMicrobacterium呈显著相关.

(3) 本研究表明, 添加玉米酒糟处理对功能菌群、病原菌和抗生素抗性基因丰度的影响较其他处理更显著.与其他处理相比, 添加松土精处理下tetAtetXsul1intI1丰度显著增加, 添加玉米酒糟处理能够显著提高Arcobacter butzleriBacillus cereusPseudomonas syringaetetAtetBtetXermBermCsul2丰度.土壤改良剂通过改变土壤理化性质影响根际土壤病原菌和抗生素抗性基因的丰度分布, 不当地施用土壤改良剂可能增加农业环境病原菌和抗生素抗性基因富集与传播的风险, 土壤改良剂在农业生产实践中的影响因素也还需进一步验证.

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