2022, Vol. 43
2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 亚热带农业生态过程重点实验室, 长沙 410125;
3. 南宁师范大学北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室, 南宁 530001
, WEI Ju-xian1,2 , CHEN Dan3 , WANG Cong1,2
, SHEN Jian-lin2 , LI Yong2 , WU Jin-shui2
2. Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. Key Laboratory of Environment Change and Resources Use in Beibu Gulf Ministry of Education and Guangxi Key Laboratory of Earth Surface Processes and Intelligent Simulation, Nanning Normal University, Nanning 530001, China
水稻是世界上最重要的谷类作物之一, 全球种植面积超过1.62亿hm2, 是全球50%以上人口的主食[1, 2].中国是世界上最大的水稻生产国, 耕地面积约3 000万hm2[1].为了满足快速发展的社会和不断增加的人口对粮食日益增长的需求, 中国已成为世界上最大的化肥消费国, 2002~2019年, 合成氮(N)、磷(P)和钾(K)肥料使用量分别占全球农业总量的29%、30%和26%[1].然而, 长期过度使用化肥会导致温室气体排放增加[3~5], 氮磷水污染[6, 7], 土壤退化(例如, pH值、土壤有机质和微生物多样性降低)[6, 8, 9], 化肥使用效率和作物产量的降低[10, 11], 严重威胁农业的可持续发展.在当前我国大力倡导节肥增效的新形势下, 如何化肥减施并保持土壤肥力已成为农业生产的热点问题.
我国秸秆资源丰富, 2015年全国农作物秸秆总产量达10.4亿t, 其中可收集资源量为9亿t, 秸秆肥料化利用率为43.2%[12].因为秸秆富含碳(C)、N、P和K等养分元素[13, 14], 所以秸秆还田可补充土壤养分元素, 提高土壤肥力.化肥减量配施秸秆对土壤肥力的影响已有不少研究[15, 16].吴立鹏等[15]的研究发现, 与常规施化肥相比, 秸秆还田配施减量氮肥使单季稻土壤有机碳(SOC)、可溶性有机碳(DOC)、土壤微生物量碳(MBC)和微生物量氮(MBN)含量显著增加.王学敏等[16]的研究发现, 与常规施化肥相比, 秸秆还田配施减量化肥对玉米产量没有影响, 对土壤pH值和SOC均有一定幅度的提升.吴玉红等[17]的研究发现, 与常规施化肥相比, 秸秆还田配施减量化肥处理对小麦产量无负面影响.因此, 化肥减量配施秸秆是实现农业生产中减少化肥施用量的有效措施.
生物固氮通过固氮微生物体内的固氮酶系统, 将大气中的氮气(N2)催化转化为植物可利用的形式, 每年可为农田生态系统提供氮素40~70 Tg, 是农业生态系统中氮素的重要来源之一[18~21].Herridge等[21]的研究发现, 生物固氮可为水稻贡献高达22~30 kg·(hm2·a)-1的氮素, 是水稻生长的重要且持续的氮源.固氮微生物体内存在一种具有催化功能的固氮酶, 编码固氮酶中结构基因的nifH基因具有高度保守性, 已被广泛用作证明环境中固氮菌群落结构的标记基因[22].Kanungo等[23]的研究发现, 水稻土壤在较低的土壤氧化还原电位(Eh值)条件下, 更有利于固氮微生物生长. 靳振江等[24]的研究发现, 在油菜-水稻轮作土壤中长期施用化肥降低了固氮菌群落多样性.这可能是因为土壤中施用氮肥后, 充足的可利用氮[如铵态氮(NH4+)和硝态氮(NO3-)]抑制了部分固氮微生物生长所致[25, 26].Tang等[27]利用末端限制性片段长度多样性技术研究了长期秸秆还田配施化肥对双季稻土壤固氮菌群落结构的影响, 发现秸秆还田增加了固氮菌多样性指数.杨滨娟等[28]利用平板稀释涂布法, 研究了秸秆还田配施不同比例化肥对单季稻土壤根际微生物的影响, 发现秸秆还田处理能够增加固氮菌的数量.这可能是因为秸秆还田处理带来大量的有机碳源和能量, 提高了SOC含量, 其能为固氮微生物生长提供必要的碳源[29, 30].李旭等[31]采用室内培养试验, 通过高通量测序法分析不同秸秆添加量对土壤固氮微生物群落结构的影响, 发现添加4.0 mg·g-1较2.0 mg·g-1秸秆增加了慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)的相对丰度.这可能是因为秸秆添加降低了土壤NO3-含量, 低NO3-含量的环境更有利于Bradyrhizobium生长.因此, NH4+、NO3-、SOC含量和土壤Eh值等土壤理化性质是影响固氮微生物群落结构的重要因素.
虽然秸秆还田对土壤固氮微生物群落结构影响的研究已有不少, 但双季稻田土壤固氮微生物群落结构对化肥减量配施秸秆的响应却鲜有报道.由于双季稻田化肥减量配施秸秆可能会增加SOC含量、减少NH4+及NO3-含量和降低土壤Eh值.因此, 双季稻田化肥减量配施秸秆可能会增加土壤固氮菌多样性, 并改善其群落组成结构.为了验证该假设, 本研究运用高通量测序技术研究了化肥减量配施不同比例秸秆下双季稻田土壤固氮菌群落结构特征及其与土壤理化性质间的关系, 以期为稻田合理施肥提供科学依据, 从而使水稻生产可持续发展.
1 材料与方法 1.1 试验田概况本试验田位于湖南省长沙县中国科学院亚热带农业生态研究所长沙农业环境观测研究站(28.55°N, 113.33°E), 海拔80 m.本研究区域属于亚热带湿润季风气候, 年均降雨量为1 330 mm, 年均气温为17.5℃, 无霜期约300 d.土壤为花岗岩发育的铁聚水耕人为土.供试土壤基本理化性质见表 1.
|
表 1 土壤基本理化性质 Table 1 Basic properties of soil in the experimental field |
1.2 试验设置
本田间定位试验始于2012年, 采用随机区组设计, 小区面积为35 m2(5 m×7 m).设置3个处理, 每个处理3个重复.处理设置为：①常规施肥, CF; ②化肥减量配施3 t·hm-2(干重)秸秆, CFLS; ③化肥减量配施6 t·hm-2(干重)秸秆, CFHS.常规施肥处理施肥用量为：氮肥(尿素, 以N计), 早稻120 kg·hm-2, 晚稻150 kg·hm-2, 按基肥∶分蘖肥∶穗肥比例5∶3∶2施用; 磷肥(过磷酸钙, 以P2O5计)和钾肥(氯化钾, 以K2O计)在早晚稻季施用量相同, 分别为40 kg·hm-2和100 kg·hm-2, 以基肥形式一次性施入.还田秸秆来自上一水稻季的水稻.施用基肥时, 通过翻耕机将切为3~5 cm的水稻秸秆均匀混入土壤.通过施用化肥来补充施用秸秆处理不足的养分(表 2).秸秆处理氮肥按照基肥∶分蘖肥∶穗肥比例5∶3∶2施用, 磷钾肥以基肥形式一次性施入.病虫害杂草防治及其他田间管理措施采用当地常规管理方式.
|
|
表 2 化肥减量配施秸秆处理化肥和秸秆施用量及秸秆养分含量1) Table 2 Application amounts of mineral fertilizers, straw (dry matter) and its nutrient input, and the basic properties of straw for the straw plus reduced mineral fertilizer treatment |
1.3 植物和土壤样品的采集
在施用秸秆后第3 a(2014年)早稻和晚稻收获期, 每个小区中采集长势中等的5个1 m2水稻植株样品用于测定水稻产量.于施用秸秆后第3 a(2014年)早稻季分蘖期采集各小区鲜土样.使用灭菌土钻按照“S”形在每个小区采集5钻0~20 cm土壤于塑料封口袋中, 挑出肉眼可见的动植物残体和砂粒, 充分混匀成一个土样, 每个土样分成两份：①一份用于土壤性质的测定, 将土壤样品迅速带回实验室, 保存在4℃冷库中, 于一周之内测定土壤DOC、NH4+、NO3-、MBC和MBN含量.剩余土壤样品自然风干后用于SOC含量和pH值的测定.②另一份样品迅速用锡箔纸包好, 放入纤维袋子, 投入到液氮中, 运送至实验室, -80℃冰箱保存, 用于分子生物学试验.
1.4 水稻产量与土壤样品肥力属性的测定将采集的5 m2植物样品先统一风干, 然后采用烘箱烘干至恒重测定其含水量, 进而换算每个小区水稻籽粒产量(13.5%水分含量).耕层5 cm深度氧化还原电位使用Eh计(RM-30P, DKK-TOA, 日本)测定.土壤含水量采用烘箱105℃烘干称重法测定[32].使用K2SO4溶液浸提, 滤液使用连续流动测定仪(Fiastar 5000, 瑞典)测定NH4+和NO3-含量, 使用TOC仪(TOC-VWP, Shimadzu Corporation, 日本)测定土壤中的DOC含量.SOC采用重铬酸钾容量法(外加热法)测定.使用pH计(Metro-pH320, Mettler-Toledo Instruments Ltd. 瑞士)测定土壤pH值[32].采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法测定MBC和MBN[33].
1.5 土壤DNA的提取与PCR扩增采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals, USA)提取土壤DNA, 操作步骤按照说明书进行.提取的土壤总DNA采用微量紫外分光光度计(NanoDrop 1000, Wilmington, DE, USA)测定DNA质量和浓度, DNA样品存放于-20℃保存待用.采用nifH基因的引物PolF(TGCGAYCCSAA RGCBGACTC)/PolR(ATSGCCATCATYTCRCCGG A)[34]对DNA样品进行扩增.在设计PolF/PolR测序引物时, 在引物序列5′端添加6个碱基的barcode序列以在测序数据中区分各个样品数据.PCR产物用2% 琼脂糖凝胶电泳检测.PCR产物的纯化按照纯化试剂盒(GeneJET, Thermo Scientific)操作说明, 纯化产物由微量紫外分光光度计(NanoDrop 1000, Wilmington, DE, USA)测定浓度.
1.6 高通量测序和生物信息分析各样品纯化后的DNA等浓度混合, 混合液由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行Illumina-HiSeq测序.序列数据处理通过QIIME2软件实现, 采用高标准的Illumina-HiSeq数据质量条件(每个碱基质量Q值>30)对所有序列进行过滤质控.然后采用Framebot软件将测序核酸序列翻译为蛋白序列来除去非nifH基因序列和可能存在的错误拼装序列.再去除嵌合体及出现频率低于两次的序列后, 使用QIIME2软件DADA2插件产生扩增序列变体(amplicon sequence variant, ASV).选取DADA2产生的核酸代表序列通过MEGAN软件在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对, 鉴定出代表序列相应的微生物分类.为保证各样品数据的可比性, 后续数据分析均采用所有样中测序深度最低的数据量, 即每个样本6 691条序列.本研究所用原始序列数据已上传NCBI数据库(编号：PRJNA648668).
1.7 统计分析所有数据统计分析与作图均采用R软件[35].处理间的多重比较(统计显著水平为P＜0.05)采用邓肯法.使用FastTree软件[36]对固氮菌进行建树.采用香农(Shannon)指数[37]、系统发育多样性(Phylogenetic diversity, PD)指数[38]、群落均匀度(Evenness)指数来表征固氮菌的α多样性.采用基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)和相似性分析(analysis of similarities, ANOSIM)对各处理固氮菌群落结构差异进行分析.运用Pearson相关分析来分析固氮微生物群落与土壤性质间的关系.图表数据为平均值±标准误.
2 结果与分析 2.1 水稻产量与土壤肥力属性在化肥减量配施秸秆后第3 a, 如图 1所示, CF、CFLS和CFHS处理间水稻籽粒产量没有显著差异(P＞0.05).与CF处理相比, CFLS和CFHS处理分别显著增加了19.5%和16.4%的DOC含量, 13.8%和14.7%的SOC, 5.2%和11.4%的pH值, 15.9%和15.2%的MBC含量, 20.0%和16.8%的MBN含量(P＜0.05).CFHS处理较CFLS处理显著增加了6.0%的pH值.然而, 与CF处理相比, CFLS和CFHS处理分别显著减少了41.1%和33.7%的NH4+含量, 28.7%和22.2%的NO3-含量, 20.1%和25.4%的土壤Eh值(P＜0.05).
|
不同小写字母表示处理间在P＜0.05水平差异显著 图 1 水稻产量和土壤肥力属性 Fig. 1 Rice grain yields and soil fertility properties for the three treatments |
施用秸秆后第3 a各处理固氮菌Shannon、PD和Evenness指数如表 3所示.在3个处理中, CFHS处理的Shannon和PD指数最高, CFLS处理次之, 而CF处理的Shannon和PD指数最低.CFLS和CFHS处理的固氮菌Shannon、PD和Evenness指数均较CF处理显著增加(P＜0.05).
|
|
表 3 各处理稻田土壤固氮菌群落α多样性指数1) Table 3 The α diversity index of the three treatments for diazotrophic community in the rice paddy soils |
各处理的土壤固氮菌群落主坐标分析表明, 施用秸秆后第3 a, 各处理间土壤固氮菌群落结构存在巨大差异, 尤其是在CF和化肥减量配施秸秆处理之间(P＜0.05, 图 2).第一主坐标解释量为51.0%, 第二主坐标解释量为13.5%, 两个轴总解释量为64.5%.该结果被ANOSIM分析所验证(R=0.827; P＜0.01).
|
圆环：95%置信区间 图 2 稻田固氮菌ASV群落结构主坐标分析(PCoA) Fig. 2 Principal coordinates analysis(PCoA) of diazotrophic communities in the paddy field |
如图 3所示, 在纲水平, 施用秸秆后第3 a所有处理土壤固氮菌的优势种群为：α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)、蓝藻纲(Cyanophyceae)、Negativicutes、梭菌纲(Clostridia)、放线菌纲(Actinobacteria)、甲烷微菌纲(Methanomicrobia)和杆菌纲(Bacilli), 占据88.6% ~92.1%. α-Proteobacteria的相对丰度最大, 占据59.7% ~68.7%.与CF处理相比, CFLS和CFHS处理的α-Proteobacteria分别显著减少了6%和13%(P＜0.05).与CFLS处理相比, CFHS处理的α-Proteobacteria显著减少了7%(P＜0.05).与CF处理相比, CFLS和CFHS处理分别显著增加了32%和42%的β-Proteobacteria、87%和108%的γ-Proteobacteria、465%和430%的Cyanophyceae以及358%和270%的Negativicutes(P＜0.05).与CF处理相比, CFLS和CFHS处理的Methanomicrobia分别显著增加了420%和800%(P＜0.05).与CFLS处理相比, CFHS处理的Methanomicrobia显著增加了73%(P＜0.05).
|
图 3 各处理稻田土壤固氮菌纲水平上前10的菌种相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of the ten most abundant diazotrophic class under the three treatment regimes |
在属水平上, 去除一些未被归类和相对丰度较小的序列, 各处理不同固氮菌属的相对丰度见图 4.施用秸秆后第3 a, Bradyrhizobium是所有处理土壤中最优势的属, 其次为铁氧化菌属(Sideroxydans)、固氮螺菌属(Azospirillum)、Ferrigenium、Citrifermentans、硫氧化菌属(Sulfurivermis)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、Methylovulum、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira)和念珠藻属(Nostoc), 占据77.8% ~80.9%.与CF处理相比, CFLS和CFHS处理分别显著减少了55%和56%的Azospirillum相对丰度(P＜0.05).CFLS和CFHS处理较CF处理分别显著增加了158%和137%的Ferrigenium、232%和193%的Sulfurivermis、192%和400%的Methylomonas、1736%和2045%的Methylovulum、86%和89%的Ectothiorhodospira以及367%和331%的Nostoc相对丰度(P＜0.05).与CFLS处理相比, CFHS处理显著增加了71%的Methylomonas相对丰度(P＜0.05).
|
1. 念珠藻属(Nostoc), 2. 外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira), 3. Methylovulum, 4. 甲基单胞菌属(Methylomonas), 5. 硫氧化菌属(Sulfurivermis), 6. Citrifermentans, 7. Ferrigenium, 8. 铁氧化菌属(Sideroxydans), 9.固氮螺菌属(Azospirillum), 10. 慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium); 不同小写字母表示处理间在P＜0.05水平差异显著 图 4 各处理稻田土壤固氮菌属水平上前10的菌种相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of the ten most abundant diazotrophic genera under the three treatment regimes |
如图 5所示, 运用皮尔逊相关性分析发现, 土壤Eh值、NH4+浓度和NO3-浓度与Azospirillum和Citrifermentans显著正相关(P＜0.05), 与Ferrigenium、Sulfurivermis、Methylovulum、Ectothiorhodospira、Nostoc、Shannon指数、PD指数和Evenness指数显著负相关(P＜0.05).Eh值与Methylomonas显著负相关(P＜0.05).土壤DOC浓度与Ferrigenium和Sulfurivermis显著正相关(P＜0.05), 与Azospirillum显著负相关(P＜0.01). pH值与Sideroxydans和Ferrigenium显著正相关, 与Azospirillum和Citrifermentans显著负相关(P＜0.05).土壤DOC浓度和pH值与Methylomonas、Methylovulum、Ectothiorhodospira、Nostoc、Shannon指数、PD指数和Evenness指数显著正相关(P＜0.05).SOC含量与Ferrigenium、Sulfurivermis、Methylomonas、Methylovulum、Ectothiorhodospira、Nostoc、PD指数和Evenness指数显著正相关, 与Azospirillum显著负相关(P＜0.05). MBC含量与Methylovulum和Nostoc显著正相关(P＜0.05).MBN含量与Ferrigenium、Shannon指数、PD指数和Evenness指数显著正相关(P＜0.05).MBC含量和MBN含量与Azospirillum属显著负相关(P＜0.05).
|
1. Bradyrhizobium, 2. Azospirillum, 3. Sideroxydans, 4. Ferrigenium, 5. Citrifermentans, 6. Sulfurivermis, 7. Methylomonas, 8. Methylovulum, 9. Ectothiorhodospira, 10. Nostoc, 11. Shannon指数, 12. PD指数, 13. Evenness指数; ×表示P ≥ 0.05, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01, ***表示P＜0.001 图 5 稻田土壤肥力属性和固氮菌群落间的皮尔逊相关性分析矩阵 Fig. 5 Matrix of Pearson's correlation analysis of soil fertility property and diazotrophic community in the paddy field |
有研究表明秸秆还田配施化肥对水稻产量没有不良影响[39, 40].曾研华等[41]的研究发现, 与稻草不还田和单施化肥相比, 稻草还田减施化肥(早稻稻草还田替代部分化肥)可稳定晚稻产量.徐云连等[42]的研究发现, 减少50%磷肥或减少30%氮肥配施秸秆后第10 a对水稻产量有增产作用, 但增产不显著.与已有的研究结果相似, 本研究结果表明, 在化肥减量配施秸秆后第3 a, 各处理间水稻籽粒产量没有显著差异(P＞0.05).因为秸秆还田后在土壤中会腐解释放养分[13, 14], 所以化肥减量配施低量和高量秸秆处理能够在不影响水稻产量的前提下减少化肥用量(图 1).
秸秆还田配施化肥措施可以改善土壤养分循环[43, 44].化肥减量配施秸秆降低了土壤Eh值(图 1), 可能是由于水稻秸秆在稻田土壤中腐解, 消耗了大量的氧化性物质, 进而使土壤Eh值下降[45].与CF处理相比, CFLS和CFHS处理分别使土壤pH值、DOC和SOC含量增加(图 1), 该结果与吴立鹏等[15]和王学敏等[16]的研究结果一致.由于秸秆含有大量的碳(约50%)[13]和盐基离子, 且减少了化肥施用量, 减弱了化肥对土壤酸化的作用, 因此秸秆还田处理增加了DOC、SOC含量和pH值.与CF处理相比, CFLS和CFHS处理分别显著增加了MBC和MBN含量(图 1), 因为施用的秸秆所带入的大量有机物质为微生物提供了充足底物, 增加了微生物数量, 因此MBC和MBN含量显著增加[46].黄容等[47]的研究发现, 短期(7个月)秸秆与化肥减量配施处理较常规施肥处理显著降低菜地土壤NH4+含量.与其研究结果相似, 本研究结果表明, 化肥减量配施秸秆减少了土壤NH4+和NO3-含量(图 1).这可能是由于秸秆的高碳氮比(17~21)[48], 使微生物固定了部分矿态氮为MBN, 以及氮化肥施用量的减少所导致的(表 2).MBN是土壤中N素养分活性库, 当土壤矿态氮含量较高时, 作物首先利用矿态氮, 而当土壤矿态氮含量不足时, 植物与微生物产生竞争, 促使部分MBN通过矿化释放供作物吸收利用[49].因此, 秸秆替代部分化肥后通过增加MBN含量, 降低NH4+和NO3-含量, 增强了作物需氮与土壤供氮的同步性, 降低了氮素损失.综上所述, 双季稻田化肥减量配施3 t·hm-2和6 t·hm-2秸秆均能够在不影响产量的前提下, 减少施用化肥、有效利用秸秆和改善土壤养分循环与肥力属性.
3.2 秸秆替代化肥对土壤固氮微生物群落结构的影响目前关于双季稻田化肥减量配施秸秆如何影响土壤固氮微生物群落结构的研究较少.本研究结果表明, 秸秆还田显著增加了固氮菌α多样性指数(表 3).这可能是因为施用秸秆带入了更多的种类和数量的碳源[29, 30]、提高了土壤pH值, 降低了NH4+含量和NO3-含量, 这些土壤理化性质的改变促进了更多种类固氮菌的生长[50].以上结果在皮尔逊相关性分析中被验证：Shannon、PD和Evenness指数与DOC含量和pH值显著正相关, 与NH4+和NO3-含量显著负相关; PD指数和Evenness指数与SOC含量显著正相关(P＜0.05, 图 5).
秸秆还田后增加了SOC含量、DOC含量和pH值等, 进而改善了土壤理化性质, 增加了微生物数量(MBC含量和MBN含量增加, 图 1), 使更多微生物参与到养分循环过程, 加速了养分周转[51], 因此秸秆还田处理增加了参与大量养分循环过程的γ-Proteobacteria纲相对丰度(图 3).秸秆还田可能增加了土壤有机磷等, 为Cyanophyceae纲微生物提供了更多底物, 因此秸秆还田显著增加了Cyanophyceae纲的相对丰度; Cyanophyceae纲中大部分微生物能够固定大气中的碳和氮, 进而提高土壤肥力与产量, 是很好的绿肥[52].秸秆还田增加了土壤DOC含量和SOC含量, 降低了土壤Eh值为产甲烷菌生存提供了良好条件, 因此, 秸秆还田处理增加了Methanomicrobia纲相对丰度, 且Methanomicrobia纲的相对丰度随着秸秆还田量的增加而增加[53].
与CF处理相比, CFLS和CFHS处理使Ferrigenium、Sulfurivermis、Methylomonas、Methylovulum、Ectothiorhodospira和Nostoc属的相对丰度显著增加(P＜0.05, 图 4). Ferrigenium属一般生存在pH值约为6.0的环境[54].化肥减量配施秸秆增加了土壤pH值, 可能是导致Ferrigenium属相对丰度增加的原因.结果在皮尔逊相关性分析中被验证：Ferrigenium属与土壤pH值显著正相关(P＜0.05, 图 5). Sulfurivermis属一般适于生存在Eh较低的环境[55, 56], 秸秆还田后土壤中秸秆腐解消耗了氧化性物质, 降低了土壤Eh值, 这可能是Sulfurivermis属相对丰度增加的原因. Sulfurivermis属不仅具有固氮与硫循环作用, 也具备自养固碳能力, 有利于提高SOC含量[55].该结果在皮尔逊相关性分析中被验证：Sulfurivermis属与DOC含量和SOC含量显著正相关, 与Eh值显著负相关(P＜0.05, 图 5). Methylovulum和Methylomonas属都是好氧甲烷氧化菌, 二者以甲烷和甲醇为碳和能量基质[57]. Methylovulum属一般适于生存在pH值约为6.5的环境中[58].秸秆还田会显著增加稻田CH4排放[59]、DOC含量和pH值(图 1), 为Methylovulum和Methylomonas属提供了充足的生长基质和较为适宜的酸碱环境.因此, 化肥减量配施秸秆后第3 a, Methylovulum和Methylomonas属的相对丰度增加(图 4).该结果在皮尔逊相关性分析中被验证：Methylovulum和Methylomonas属与土壤pH值和DOC显著正相关(P＜0.05, 图 5).与之相似, Ectothiorhodospira属较喜好高有机碳含量与碱性条件, 且需要一些盐类来维持生存, 因此秸秆还田处理增加了Ectothiorhodospira属相对丰度[60]. Ectothiorhodospira属除了能够固氮外, 还能够通过光合作用来增强土壤固碳能力[60], 进而增加SOC含量.该结果在皮尔逊相关性分析中被验证：Ectothiorhodospira属与pH值、SOC和DOC含量显著正相关(P＜0.05, 图 5).化肥减量配施秸秆提高了土壤pH值, 降低了矿态氮(NH4+和NO3-)含量, 这可能使Nostoc属相对丰度增加.因为Nostoc属一般较为适应低矿态氮、高pH值的条件[61].该结果在皮尔逊相关性分析中被验证：Nostoc属与pH值正相关, 而与NH4+和NO3-负相关(P＜0.05, 图 5).其次, Nostoc属除能够固氮并促进植物生长外, 还能够通过光合作用增强土壤固碳能力[61].其中Sulfurivermis、Methylomonas、Methylovulum和Ectothiorhodospira属相对丰度的增加是导致γ-Proteobacteria纲相对丰度增加的主要原因(图 3和图 4).与CFLS和CFHS处理相比, CF处理使Azospirillum属的相对丰度显著减少(P＜0.05, 图 4), 此结果可能由于Azospirillum属与其他微生物类群形成竞争所致[62, 63].与CF处理相比, CFLS和CFHS处理Azospirillum属的相对丰度减少是导致α-Proteobacteria纲的相对丰度较少的主要原因.综上所述, 双季稻田化肥减量配施3 t·hm-2和6 t·hm-2秸秆均能够改善土壤固氮菌群落结构, 有利于双季稻田土壤肥力的提高.
4 结论(1) 双季稻田化肥减量配施3 t·hm-2和6 t·hm-2秸秆均能够在不影响产量的前提下减少氮、磷、钾化肥施用, 并且改善土壤肥力属性.
(2) 双季稻田化肥减量配施3 t·hm-2和6 t·hm-2秸秆均能够增加双季稻田固氮菌α多样性, 使: Ferrigenium、Sulfurivermis、Methylomonas、Methylovulum、Ectothiorhodospira和Nostoc属等固氮、固碳和植物促生功能类群微生物相对丰度显著提高, 改善了土壤天然固氮功能群结构.
(3) 在3 a试验中, 施用6 t·hm-2秸秆废弃物替代化肥较施用3 t·hm-2秸秆在减少化肥用量方面更具优势.
| [1] | FAO. FAO FAOSTAT[EB/OL]. https://www.fao.org/faostat/en/#home, 2021-08-15. |
| [2] | Khush G S. What it will take to feed 5.0 billion rice consumers in 2030[J]. Plant Molecular Biology, 2005, 59(1): 1-6. DOI:10.1007/s11103-005-2159-5 |
| [3] | Linquist B A, Adviento-Borbe M A, Pittelkow C M, et al. Fertilizer management practices and greenhouse gas emissions from rice systems: a quantitative review and analysis[J]. Field Crops Research, 2012, 135: 10-21. DOI:10.1016/j.fcr.2012.06.007 |
| [4] | Walkiewicz A, Brzezińska M, Bieganowski A. Methanotrophs are favored under hypoxia in ammonium-fertilized soils[J]. Biology and Fertility of Soils, 2018, 54(7): 861-870. DOI:10.1007/s00374-018-1302-9 |
| [5] | Yao Z S, Zheng X H, Dong H B, et al. A 3-year record of N2O and CH4 emissions from a sandy loam paddy during rice seasons as affected by different nitrogen application rates[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2012, 152: 1-9. |
| [6] | Liu J G, Diamond J. China's environment in a globalizing world[J]. Nature, 2005, 435(7046): 1179-1186. DOI:10.1038/4351179a |
| [7] | Liu J, Liu X L, Wang Y, et al. Landscape pattern at the class level regulates the stream water nitrogen and phosphorus levels in a Chinese subtropical agricultural catchment[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2020, 295. DOI:10.1016/j.agee.2020.106897 |
| [8] | Guo J H, Liu X J, Zhang Y, et al. Significant acidification in major Chinese croplands[J]. Science, 2010, 327(5968): 1008-1010. DOI:10.1126/science.1182570 |
| [9] | Islam M R, Chauhan P S, Kim Y, et al. Community level functional diversity and enzyme activities in paddy soils under different long-term fertilizer management practices[J]. Biology and Fertility of Soils, 2011, 47(5): 599-604. DOI:10.1007/s00374-010-0524-2 |
| [10] | Kumar A, Yadav D S. Long-term effects of fertilizers on the soil fertility and productivity of a rice-wheat system[J]. Journal of Agronomy and Crop Science, 2001, 186(1): 47-54. DOI:10.1046/j.1439-037x.2001.00452.x |
| [11] | Wu Y Y, Xi X C, Tang X, et al. Policy distortions, farm size, and the overuse of agricultural chemicals in China[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018, 115(27): 7010-7015. DOI:10.1073/pnas.1806645115 |
| [12] |
霍丽丽, 赵立欣, 孟海波, 等. 中国农作物秸秆综合利用潜力研究[J]. 农业工程学报, 2019, 35(13): 218-224. Huo L L, Zhao L X, Meng H B, et al. Study on straw multi-use potential in China[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2019, 35(13): 218-224. DOI:10.11975/j.issn.1002-6819.2019.13.026 |
| [13] | Dobermann A, Fairhurst T H. Rice straw management[J]. Better Crops International, 2002, 16(S1): 7-11. |
| [14] | Banik S, Nandi R. Effect of supplementation of rice straw with biogas residual slurry manure on the yield, protein and mineral contents of oyster mushroom[J]. Industrial Crops and Products, 2004, 20(3): 311-319. DOI:10.1016/j.indcrop.2003.11.003 |
| [15] |
吴立鹏, 张士荣, 娄金华, 等. 秸秆还田与优化施氮对稻田土壤碳氮含量及产量的影响[J]. 华北农学报, 2019, 34(4): 158-166. Wu L P, Zhang S R, Lou J H, et al. Effects of straw returning and nitrogen fertilizer on soil C and N content and yield of rice[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2019, 34(4): 158-166. |
| [16] |
王学敏, 刘兴, 郝丽英, 等. 秸秆还田结合氮肥减施对玉米产量和土壤性质的影响[J]. 生态学杂志, 2020, 39(2): 507-516. Wang X M, Liu X, Hao L Y, et al. Effects of straw returning in conjunction with different nitrogen fertilizer dosages on corn yield and soil properties[J]. Chinese Journal of Ecology, 2020, 39(2): 507-516. |
| [17] |
吴玉红, 郝兴顺, 田霄鸿, 等. 秸秆还田与化肥减量配施对稻茬麦土壤养分、酶活性及产量影响[J]. 西南农业学报, 2018, 31(5): 998-1005. Wu Y H, Hao X S, Tian X H, et al. Effects of reduction of NPK fertilizer application rates plus rice straw return on soil nutrient, enzyme activities and wheat yield in rice-wheat rotation system[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2018, 31(5): 998-1005. |
| [18] | Vitousek P M, Menge D N L, Reed S C, et al. Biological nitrogen fixation: rates, patterns and ecological controls in terrestrial ecosystems[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2013, 368(1621). DOI:10.1098/rstb.2013.0119 |
| [19] | Cleveland C C, Townsend A R, Schimel D S, et al. Global patterns of terrestrial biological nitrogen (N2) fixation in natural ecosystems[J]. Global Biogeochemical Cycles, 1999, 13(2): 623-645. DOI:10.1029/1999GB900014 |
| [20] | Galloway J N, Townsend A R, Erisman J W, et al. Transformation of the nitrogen cycle: recent trends, questions, and potential solutions[J]. Science, 2008, 320(5878): 889-892. DOI:10.1126/science.1136674 |
| [21] | Herridge D F, Peoples M B, Boddey R M. Global inputs of biological nitrogen fixation in agricultural systems[J]. Plant and Soil, 2008, 311(1-2): 1-18. DOI:10.1007/s11104-008-9668-3 |
| [22] | Yang S H, Chen W H, Wang E T, et al. Rhizobial biogeography and inoculation application to soybean in four regions across China[J]. Journal of Applied Microbiology, 2018, 125(3): 853-866. DOI:10.1111/jam.13897 |
| [23] | Kanungo P K, Ramakrishnan B, Rao V R. Placement effects of organic sources on nitrogenase activity and nitrogen-fixing bacteria in flooded rice soils[J]. Biology and Fertility of Soils, 1997, 25(2): 103-108. DOI:10.1007/s003740050288 |
| [24] |
靳振江, 潘根兴, 刘晓雨, 等. 太湖地区长期不同施肥水稻土N2和CO2固定细菌群落结构的特征与差异[J]. 植物营养与肥料学报, 2013, 19(1): 82-92. Jin Z J, Pan G X, Liu X Y, et al. Community structure characters and differences of N2-fixing and CO2-fixing bacteria under long-term fertilization in paddy soils of Taihu Lake region, China[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizers, 2013, 19(1): 82-92. |
| [25] | Halbleib C M, Ludden P W. Regulation of biological nitrogen fixation[J]. The Journal of Nutrition, 2000, 130(5): 1081-1084. DOI:10.1093/jn/130.5.1081 |
| [26] | Mirza B S, Potisap C, Nüsslein K, et al. Response of free-living nitrogen-fixing microorganisms to land use change in the Amazon rainforest[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(1): 281-288. DOI:10.1128/AEM.02362-13 |
| [27] | Tang Y F, Zhang M M, Chen A L, et al. Impact of fertilization regimes on diazotroph community compositions and N2-fixation activity in paddy soil[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2017, 247: 1-8. |
| [28] |
杨滨娟, 黄国勤, 钱海燕. 秸秆还田配施化肥对土壤温度、根际微生物及酶活性的影响[J]. 土壤学报, 2014, 51(1): 150-157. Yang B J, Huang G Q, Qian H Y. Effects of straw incorporation plus chemical fertilizer on soil temperature, root micro-organisms and enzyme activities[J]. Acta Pedologica Sinica, 2014, 51(1): 150-157. |
| [29] | Yang H J, Ma J X, Rong Z Y, et al. Wheat straw return influences nitrogen-cycling and pathogen associated soil microbiota in a wheat-soybean rotation system[J]. Frontiers in Microbiology, 2019, 10. DOI:10.3389/fmicb.2019.01811 |
| [30] |
张苗苗, 刘毅, 盛荣, 等. 稻草还田对水稻土固氮基因(nifH)组成结构和多样性的影响[J]. 应用生态学报, 2013, 24(8): 2339-2344. Zhang M M, Liu Y, Sheng R, et al. Effects of rice straw returning on the community structure and diversity of nitrogen-fixing gene (nifH) in paddy soil[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2013, 24(8): 2339-2344. |
| [31] |
李旭, 董炜灵, 宋阿琳, 等. 秸秆添加量对土壤生物固氮速率和固氮菌群落特征的影响[J]. 中国农业科学, 2021, 54(5): 980-991. Li X, Dong W L, Song A L, et al. Effects of straw addition on soil biological N2-fixation rate and diazotroph community properties[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(5): 980-991. |
| [32] | 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. (第三版). 北京: 中国农业出版社, 2000. |
| [33] | 吴金水, 林启美, 黄巧云, 等. 土壤微生物生物量测定方法及其应用[M]. 北京: 气象出版社, 2006. |
| [34] | Poly F, Monrozier L J, Bally R. Improvement in the RFLP procedure for studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers in soil[J]. Research in Microbiology, 2001, 152(1): 95-103. DOI:10.1016/S0923-2508(00)01172-4 |
| [35] | R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing[EB/OL]. https://www.gbif.org/tool/81287/r-a-language-and-environment-for-statistical-computing, 2020-01-21. |
| [36] | Price M N, Dehal P S, Arkin A P. FastTree 2-approximately maximum-likelihood trees for large alignments[J]. PLoS One, 2010, 5(3). DOI:10.1371/journal.pone.0009490 |
| [37] | Hill T C J, Walsh K A, Harris J A, et al. Using ecological diversity measures with bacterial communities[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2003, 43(1): 1-11. DOI:10.1111/j.1574-6941.2003.tb01040.x |
| [38] | Faith D P. Conservation evaluation and phylogenetic diversity[J]. Biological Conservation, 1992, 61(1): 1-10. DOI:10.1016/0006-3207(92)91201-3 |
| [39] |
石丽红, 李超, 唐海明, 等. 长期施肥方式对双季稻根系生理特性与产量的影响[J]. 中国农业大学学报, 2021, 26(9): 18-29. Shi L H, Li C, Tang H M, et al. Effects of different long-term fertilizer management on physiological characteristic of root and yield of rice in double-cropping rice paddy field[J]. Journal of China Agricultural University, 2021, 26(9): 18-29. |
| [40] |
何如海, 薛中俊, 汪玉芳, 等. 油菜秸秆还田及化肥配施的水稻经济环境效益分析[J]. 中国农业资源与区划, 2021, 42(6): 42-49. He R H, Xue Z J, Wang Y F, et al. Analysis of economic and environmental benefits of rice with the application of rapeseed straw and chemical fertilizer[J]. Chinese Journal of Agricultural Resources and Regional Planning, 2021, 42(6): 42-49. |
| [41] |
曾研华, 吴建富, 曾勇军, 等. 机收稻草全量还田减施化肥对双季晚稻养分吸收利用及产量的影响[J]. 作物学报, 2018, 44(3): 454-462. Zeng Y H, Wu J F, Zeng Y J, et al. Effects of straw incorporation with reducing chemical fertilizers on nutrient absorption and utilization and grain yield of double-cropping late rice under mechanical harvest[J]. Acta Agronomica Sinica, 2018, 44(3): 454-462. |
| [42] |
徐云连, 马友华, 吴蔚君, 等. 长期减量化施肥对水稻产量和土壤肥力的影响[J]. 水土保持学报, 2018, 32(6): 254-258. Xu Y L, Ma Y H, Wu W J, et al. Effects of long-term reducing fertilization on yield and soil fertility of rice[J]. Journal of Soil and Water Conservation, 2018, 32(6): 254-258. |
| [43] |
靳玉婷, 李先藩, 蔡影, 等. 秸秆还田配施化肥对稻-油轮作土壤酶活性及微生物群落结构的影响[J]. 环境科学, 2021, 42(8): 3985-3996. Jin Y T, Li X F, Cai Y, et al. Effects of straw returning with chemical fertilizer on soil enzyme activities and microbial community structure in rice-rape rotation[J]. Environmental Science, 2021, 42(8): 3985-3996. |
| [44] |
黄容, 高明, 万毅林, 等. 秸秆还田与化肥减量配施对稻-菜轮作下土壤养分及酶活性的影响[J]. 环境科学, 2016, 37(11): 4446-4456. Huang R, Gao M, Wan Y L, et al. Effects of straw in combination with reducing fertilization rate on soil nutrients and enzyme activity in the paddy-vegetable rotation soils[J]. Environmental Science, 2016, 37(11): 4446-4456. |
| [45] |
王红妮, 王学春, 黄晶, 等. 秸秆还田对土壤还原性和水稻根系生长及产量的影响[J]. 农业工程学报, 2017, 33(20): 116-126. Wang H N, Wang X C, Huang J, et al. Effect of straw incorporated into soil on reducibility in soil and root system and yield of rice[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2017, 33(20): 116-126. DOI:10.11975/j.issn.1002-6819.2017.20.015 |
| [46] |
何甜甜, 王静, 符云鹏, 等. 等碳量添加秸秆和生物炭对土壤呼吸及微生物生物量碳氮的影响[J]. 环境科学, 2021, 42(1): 450-458. He T T, Wang J, Fu Y P, et al. Effects of adding straw and biochar with equal carbon content on soil respiration and microbial biomass carbon and nitrogen[J]. Environmental Science, 2021, 42(1): 450-458. |
| [47] |
黄容, 高明, 王蓥燕, 等. 紫色土N2O排放及氨氧化微生物群落结构对玉米秸秆与化肥减量配施的响应[J]. 环境科学, 2019, 40(1): 401-411. Huang R, Gao M, Wang Y Y, et al. Response of the soil N2O emission and ammonia-oxidizing microorganism community to the maize straw return with reducing fertilizer in purple soil[J]. Environmental Science, 2019, 40(1): 401-411. |
| [48] |
李俊良, 韩琅丰, 江荣风, 等. 碳、氮比对有机肥料氮素释放和植物吸氮的影响[J]. 中国农业大学学报, 1996, 1(5): 57-61. Li J L, Han L F, Jiang R F, et al. Effects of C/N on the release of nitrogen from organic manures and of nitrogen absorbed by plant[J]. Journal of China Agricultural University, 1996, 1(5): 57-61. |
| [49] |
陈香碧, 胡亚军, 秦红灵, 等. 稻作系统有机肥替代部分化肥的土壤氮循环特征及增产机制[J]. 应用生态学报, 2020, 31(3): 1033-1042. Chen X B, Hu Y J, Qin H L, et al. Characteristics of soil nitrogen cycle and mechanisms underlying the increase in rice yield with partial substitution of mineral fertilizers with organic manure in a paddy ecosystem: a review[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2020, 31(3): 1033-1042. |
| [50] | Tanaka H, Kyaw K M, Toyota K, et al. Influence of application of rice straw, farmyard manure, and municipal biowastes on nitrogen fixation, soil microbial biomass N, and mineral N in a model paddy microcosm[J]. Biology and Fertility of Soils, 2006, 42(6): 501-505. DOI:10.1007/s00374-005-0043-8 |
| [51] | Weber S, Lueders T, Friedrich M W, et al. Methanogenic populations involved in the degradation of rice straw in anoxic paddy soil[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2001, 38(1): 11-20. DOI:10.1111/j.1574-6941.2001.tb00877.x |
| [52] | Salman J M, Abdul-Adel E. Potential use of cyanophyta species Oscillatoria limnetica in bioremediation of organophosphorus herbicide glyphosate[J]. Mesopotamia Environmental Journal, 2015, 1(4): 15-26. |
| [53] | Tian L, Chang J J, Shi S H, et al. Comparison of methane metabolism in the rhizomicrobiomes of wild and related cultivated rice accessions reveals a strong impact of crop domestication[J]. Science of the Total Environment, 2022, 803. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.150131 |
| [54] | Khalifa A, Nakasuji Y, Saka N, et al. Ferrigenium kumadai gen. nov., sp. nov., a microaerophilic iron-oxidizing bacterium isolated from a paddy field soil[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2018,, 68(8): 2587-2592. DOI:10.1099/ijsem.0.002882 |
| [55] | Kojima H, Watanabe M, Fukui M. Sulfurivermis fontis gen. nov., sp. nov., a sulfur-oxidizing autotroph, and proposal of Thioprofundaceae fam. nov.[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2017, 67(9): 3458-3461. DOI:10.1099/ijsem.0.002137 |
| [56] | Yin S X, Chen D, Chen L M, et al. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium and responsible microorganisms in two Chinese and Australian paddy soils[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2002, 34(8): 1131-1137. DOI:10.1016/S0038-0717(02)00049-4 |
| [57] | Bowman J P. Methylomonas[A]. In: Whitman W B, Rainey F, Kampfer P(Eds.). Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria[M]. New Jersey: John Wiley & Sons, 2015. |
| [58] | Iguchi H, Yurimoto H, Sakai Y. Methylovulum[A]. In: Whitman W B, Rainey F, Kampfer P(Eds.). Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria[M]. New Jersey: John Wiley & Sons, 2015. |
| [59] | Chen D, Wang C, Shen J L, et al. Response of CH4 emissions to straw and biochar applications in double-rice cropping systems: Insights from observations and modeling[J]. Environmental Pollution, 2018, 235: 95-103. DOI:10.1016/j.envpol.2017.12.041 |
| [60] | Imhoff J F. Ectothiorhodospira[A]. In: Whitman W B, Rainey F, Kampfer P(Eds.). Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria[M]. New Jersey: John Wiley & Sons, 2015. |
| [61] | Whitton B A, Potts M. Introduction to the cyanobacteria[A]. In: Whitton B A, Potts M (Eds.). Ecology of Cyanobacteria[M]. Dordrecht: Springer, 2012. 1-11. |
| [62] | Milcamps A, Dommelen A V, Stigter J, et al. The Azospirillum brasilense rpoN gene is involved in nitrogen fixation, nitrate assimilation, ammonium uptake, and flagellar biosynthesis[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1996, 42(5): 467-478. DOI:10.1139/m96-064 |
| [63] | Juge C, Prévost D, Bertrand A, et al. Growth and biochemical responses of soybean to double and triple microbial associations with Bradyrhizobium, Azospirillum and arbuscular mycorrhizae[J]. Applied Soil Ecology, 2012, 61: 147-157. DOI:10.1016/j.apsoil.2012.05.006 |