2022, Vol. 43
土壤是一个结构复杂的非均质系统, 具有复杂的营养相互作用, 为微生物种群提供了巨大的多样性的可能[1].土壤中的微生物包括细菌、古菌和真菌等, 种类繁多, 数量巨大, 据估算1 g土壤中就有超过千万种微生物, 数量达到几亿到几十亿个[2~4].它们之间相互作用, 共同主导土壤中的物质和养分循环, 是土壤生态系统的核心[5, 6].土壤微生物被认为是生物地球化学循环的引擎[7], 对于维持土壤生态系统功能不可或缺, 同时它也在有机物分解、植物生长和土壤污染物的生物修复等过程中扮演着重要的角色[8~10].研究土壤微生物群落结构及其功能特征对于更好地优化土壤微生物功能以服务于农业生产是至关重要的.
以往在多种不同尺度下的研究都表明, 土壤pH是影响土壤微生物群落结构多样性的主要因子[11~13].在2009年, Lauber等[14]首次使用高通量测序法对美国从北到南88个土壤样品细菌群落结构进行了研究, 发现土壤pH与土壤细菌的群落结构多样性和系统发育多样性之间存在显著相关性, 相关系数分别达到0.79和0.71.在对极端环境条件下的土壤微生物群落结构的研究中也证实了土壤pH值可以预测土壤微生物群落结构[15].已有研究指出微生物群落多样性及结构是影响生态系统功能的主要因子[16~18].但是, 以往的研究主要通过分析16S rRNA基因或18S rRNA基因来研究微生物的群落结构, 而无法提供重要的功能信息, 故pH对于土壤微生物群落生态功能的影响还有待进一步的研究.宏基因组测序技术直接从环境样品中提取的总DNA, 能覆盖在数量上占少数的微生物群落, 相比于扩增子测序, 其不仅能够更加全面、真实和精确地反映微生物群落的结构变化, 还能提供微生物功能信息, 进一步提高对微生物群落及其在环境中功能的认识[19~22], 因此成为了环境微生物学的重要研究手段.
紫色土矿质元素丰富, 肥力较高, 广泛分布于我国四川盆地, 是该地区重要的农业土壤资源[23].本试验所用土壤样品采自川渝地区3种由相近母质发育而来但pH经长期环境或人为因素影响差异显著的紫色土, 前期基于这3种不同pH紫色土的研究已经发现, 长期的pH改变对土壤硝化功能微生物有明显影响, 如pH的长期改变显著影响土壤的硝化活性, 改变了土壤中氨氧化微生物的数量和组成[24, 25], 但目前尚不清楚pH对微生物群体水平上各种功能代谢的影响.本试验选取相同土壤样品, 提取微生物总DNA, 进行宏基因组测序, 然后通过生物信息学分析, 来探究pH对土壤中微生物的整体群落结构及功能特征的影响, 旨在为揭示紫色土中微生物的群落功能和生态机制提供理论参考.
1 材料与方法 1.1 研究区域概况酸性和中性紫色土采集于重庆永川, 碱性紫色土采集于中国科学院盐亭紫色土农业生态试验站.3种不同pH紫色土的种植制度相同, 均为传统三熟模式——小麦/玉米/红薯间套作.研究区域属亚热带湿润季风气候区, 具体的采样地区域气候类型和土壤基本理化性质等参照文献[26].
1.2 土壤样品采集和性质测定土壤样品采集于2014年10月, 在每个采样地取0~20 cm表层耕作土混合样3个, 放入冰盒中尽快带回实验室.一部分新鲜土样过2 mm筛后置于4℃冰箱中保存用于DNA的提取; 一部分土样自然风干后过1 mm筛用于土壤基本性质的测定, 具体测定方法参照文献[26].
1.3 土壤微生物总DNA的提取和宏基因组测序采用FastDNA® SPIN Kit for Soil(安倍医疗有限公司, 美国)试剂盒提取新鲜土样总DNA, 按照试剂盒说明进行具体操作.对提取的土壤总DNA进行质量检测后送样测序, 宏基因组测序部分由上海美吉生物医药科技有限公司完成.
1.4 数据处理采用Seqprep和Sickle对原始测序数据进行去接头、质量剪切和去除污染等优化处理, 然后使用软件SOAPdenovo对优质reads进行拼接组装, 筛选大于300 bp的contigs用于下一步分析.使用MetaGene[27]对组装出的contig进行开放型阅读框预测, 再采用CD-HIT[28]对所有基因序列进行聚类, 构建非冗余基因集, 最后使用SOAPaligner软件, 分别将每个样品的优质reads与非冗余基因集进行比对, 统计基因在对应样品中的丰度信息.使用BLASTP将非冗余基因集与NR数据库进行比对获得物种在各个分类学水平上的注释信息, 使用物种对应的基因丰度总和计算该物种的相对丰度[29].使用BLASTP将非冗余基因集与COG/KEGG数据库和氮循环功能数据库进行比对, 计算对应功能类别的相对丰度.采用Canoco 5.0软件对土壤因子与微生物群落结构进行冗余分析(redundancy analysis, RDA).采用SPSS 18.0进行统计分析, 单因素方差分析检验处理间均值差异的显著性(显著水平P＜0.05)并用Turkey法进行多重比较.
2 结果与分析 2.1 土壤宏基因组测序基本结果宏基因组测序总共发现89门、222纲、527目、1 009科、2 769属和14 354种微生物. 3种不同pH紫色土微生物单元总数见表 1, 3种紫色土中细菌都是占绝对的主导地位, 所占总体微生物群落的90%以上, 甚至在酸性和碱性土中达到98%, 而古菌和真菌的占比仅仅在0.13%~8.33%之间.在酸性和碱性紫色土中细菌和真菌的占比显著高于中性紫色土(P < 0.05); 而中性紫色土中的古菌占比(8.33%)显著高于酸性紫色土和碱性紫色土, 分别为1.57%和0.26%(P < 0.05).此外, 通过宏基因组测序还检测到了源于病毒的基因信息, 在酸性、中性和碱性紫色土中病毒占总体微生物群落的比例分别为0.08%、0.05%和1.37%.酸性和中性紫色土中病毒的占比没有显著差异(P>0.05), 但其都显著低于碱性紫色土中病毒的占比(P < 0.05).
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表 1 高通量测序技术检测到的3种不同pH紫色土微生物单元总数1) Table 1 Microbial taxon number of three purple soils with different pH via high-throughput sequencing |
2.2 不同pH紫色土微生物群落结构特征
在门水平上各样品微生物群落结构如图 1, 其中只展示相对丰度>0.7%的优势门类群, 低于0.7%的合并为others.酸性、中性和碱性紫色土分别发现了12、13和11个优势菌门, 分别占土壤微生物总量的98%、96%和95.5%.虽然3种紫色土中的优势菌门基本都相同, 但各个优势菌门在不同pH土壤中的相对丰度有显著差异.例如, Proteobacteria(变形菌门)和Acidobacteria(酸杆菌门)在酸性、中性及碱性紫色土中的相对丰度分别为35.37%和20.49%、37.71%和5.18%及67.42%和1.50%.本研究结果表明变形菌门与土壤pH呈显著正相关, 而酸杆菌门与土壤pH呈显著负相关, 表明变形菌门更适宜在高pH值的土壤中生长, 而酸杆菌门更适宜在酸性条件下生长.某些土壤中还有特殊的优势菌群, 如中性紫色土中Nitrospirae(硝化螺菌门)是优势菌门, 相对丰度为1.71%, 而在酸性和碱性紫色土中其相对丰度分别只有0.37%和0.15%.
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1~3表示酸性紫色土, 4~6表示中性紫色土, 7~9表示碱性紫色土 图 1 3种不同pH紫色土微生物在门分类水平上的群落结构 Fig. 1 Microbial community structure at phylum level in three purple soils with different pH |
在属水平上各样本微生物群落结构如图 2, 其中只展示相对丰度>2%的优势属类群, 低于2%的合并为others.酸性、中性和碱性紫色土分别发现了9、5和8个优势菌属, 分别占土壤总微生物的27.93%、20.94%和24.28%.相对于门水平, 3种不同pH土壤微生物群落在属水平上的差异更显著, 3种土壤中的相对丰度前三的微生物属完全不同: 酸性紫色土中Acidobacteriaceae_norank属最多, 其次是嗜酸类群Candidatus Koribacter属和Bradyrhizobium属, 相对丰度依次为6.32%、3.53%和3.16%; 中性紫色土中Nitrososphaera属最多, 其次是Solirubrobacter属和Betaproteobacteria_norank属, 相对丰度依次为5.50%、4.63%和4.38%; 而在碱性紫色土中Massilia属最多, 其次是Ramlibacter属和Hyalangium属, 相对丰度依次为5.23%、3.54%和3.13%.中性紫色土中发现了高丰度的Nitrososphaera属, 该属是被人们熟知的氨氧化古菌, 并被证实在大多数农业土壤硝化作用中起主导作用[30, 31], 由此推测Nitrososphaera属在此中性紫色土中生长繁盛并可能主导土壤氨氧化过程.
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1~3表示酸性紫色土, 4~6表示中性紫色土, 7~9表示碱性紫色土 图 2 3种不同pH紫色土微生物在属分类水平上的群落结构 Fig. 2 Microbial community structure at genus level in three purple soils with different pH |
3种不同pH紫色土共注释到24种COG功能类型, 图 3(a)中仅展示相对丰度前20的功能类型.3种不同pH紫色土中都是注释到功能未知和功能预测的ORFs最多, 这两类功能的相对丰度加起来约为31.90%.其次是氨基酸转运与代谢、能量产生与转化和转录, 这3个功能的相对丰度在6.51%~9.04%之间.除氨基酸转运与代谢和胞间运输、分泌和包膜运输这两类功能, 其他功能类型在3种不同pH紫色土中均无显著差异(P>0.05).
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*表示在0.05水平上差异显著 图 3 3种不同pH紫色土COG和KEGG(二级)数据库比对相对丰度 Fig. 3 Relative abundances of COG and KEGG (level 2) function in metagenomes of three purple soils with different pH |
3种不同pH紫色土共注释到42条KEGG生物学通路, 图 3(b)中仅展示相对丰度前20的功能通路.3种紫色土中注释到最多的KEGG功能分类都是全局和总览, 平均约占所有功能通路的27.76%.其次是氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢, 这3类功能的相对丰度在7.24%~9.57%之间.不同pH紫色土中的微生物功能代谢均非常一致, 几乎所有通路的相对丰度均无显著差异, 仅能量代谢、膜运输和糖的生物合成与代谢这3类功能在3种不同pH紫色土中差异显著: 能量代谢和膜运输功能在碱性土中的相对丰度显著大于酸性和中性土(P < 0.05); 糖的生物合成与代谢功能在酸性土中的相对丰度显著大于中性和碱性土(P < 0.05).
通过和氮循环功能数据库进行比对, 获得涉及氮循环的途径6条(图 4), 3种土壤中均未比对到涉及厌氧氨氧化途径的功能基因.3种紫色土中注释到最多的氮循环途径是氨同化, 其次是硝酸盐异化还原和硝酸盐同化还原, 固氮途径是6条氮循环途径中占比最少的, 不同pH紫色土中的微生物氮循环途径特征相同.不同pH紫色土中的微生物氮循环功能途径相对丰度除硝化作用有显著差异(P < 0.05), 其他5条氮循环途径的相对丰度在不同pH紫色土中均无显著差异(P>0.05).
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AA: 氨同化, DNR: 硝酸盐异化还原, ANR: 硝酸盐同化还原, D: 反硝化, N: 硝化, NF: 固氮; 不同小写字母表示在0.05水平上差异显著 图 4 3种不同pH紫色土中氮循环途径相对丰度 Fig. 4 Relative abundances of N cycling pathways in metagenomes of three purple soils with different pH |
Venn图被用来展示不同pH紫色土中微生物群落之间的重叠情况[图 5(a)].结果发现所有样本共有的微生物有7 704种, 占总微生物的50%, 说明大多数微生物都能在不同pH环境条件下生存, 具有较宽泛的生态位.在酸性紫色土中, 有877种微生物和碱性紫色土共享, 而在中性紫色土中没有被检测到, 比酸性土和中性土及中性土和碱性土的特有共享微生物多(分别为696和380), 这个结果说明酸性土和碱性土更具有相似性, 而它们与中性土有显著差异, 这与上述的结果是一致的.
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(a)不同颜色圆圈表示3种不同pH土壤样品; (b)1~3表示酸性紫色土, 4~6表示中性紫色土, 7~9表示碱性紫色土, 箭头表示土壤性质 图 5 微生物种分类水平维恩图和微生物群落结构与土壤性质的冗余分析 Fig. 5 Venn map of microbial community structure at species level and RDA between microbial community structure and soil properties |
RDA分析结果显示第一和第二排序轴分别解释了48.66%和40.32%的微生物群落结构变异[图 5(b)], 说明本研究所选取的环境因子具有一定的代表性, 一共解释了接近90%的微生物群落结构的差异.从3种不同pH土壤样点在图 5(b)中的分布可知, 3种不同pH紫色土微生物群落结构差异显著, 酸性和碱性紫色土样点分布在距离相对较近的位置, 说明两者微生物群落结构较为相似, 与维恩图的结果一致.本研究所选取的6个理化因子对于土壤微生物群落结构都有显著影响, 且各不相同.其中, 铵态氮和持水量对酸性紫色土微生物群落结构影响最大, pH和硝态氮对碱性紫色土微生物群落结构影响最大.环境因子对微生物群落结构的相关性分析也表明, 土壤的6个理化因子与土壤微生物的群落结构都具有显著的相关性(表 2), 且土壤pH与微生物群落结构的相关性最大(R2=0.998 5, P=0.001).
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表 2 土壤因子与微生物群落结构的相关性1) Table 2 Correlations between soil properties and microbial communities |
3 讨论
本研究对发育于相同母质但pH不同的3种紫色旱地土壤进行shotgun宏基因组测序, 共发现89门、222纲、527目、1 009科、2 769属和14 354种微生物.3种不同pH紫色土中都是细菌占绝对的主导地位, 占总体微生物群落的90%以上, 而古菌和真菌的占比仅仅在0.13%~8.33%之间, 这与以往对各种生境如土壤、沉积物和工程系统中微生物的研究结果是一致的[32~34].3种不同pH紫色土中都有Proteobacteria(变形菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Actinobacteria(放线菌门)和Chloroflexi(绿弯菌门)等优势微生物, 这与笔者之前通过16S rRNA扩增子测序的结果是一致的[25].由于16S rRNA扩增子测序时PCR扩增可能存在偏差[35], 两种不同测序方法所获得的相对比例存在一定的差异, 但优势微生物菌门在不同土壤中的丰度排序并没有很大的差异.变形菌门在所有土壤中占比都是最多的, 其次是酸杆菌门和放线菌门, 这与以往的很多研究结果是相同的[11, 33].虽然3种紫色土中的优势菌门基本都相同, 但各个优势菌门在不同pH土壤中的相对丰度却有显著差异.本研究结果表明变形菌门与土壤pH呈显著正相关, 而酸杆菌门与土壤pH呈显著负相关, 表明变形菌门更适宜在高pH值的土壤中生长, 而酸杆菌门更适宜在酸性条件下生长.Zhalnina等[36]对英国公园草地土壤的研究也发现pH显著影响土壤微生物群落, 其中变形菌门的相对丰度随着pH的增加而增多.酸杆菌门作为土壤中仅次于变形菌门的第二大微生物类群, 其广泛分布于各种土壤环境中[37, 38], 已有研究证明其丰度和组成受pH值影响较大[39]. M nnist等[40]对芬兰土壤细菌群落的研究结果表明酸杆菌丰度与pH呈显著负相关, 这与本研究的结果一致.3种不同pH紫色土微生物群落在属水平上差异更显著, 3种土壤的优势菌属完全不同.本研究结果表明, 不管是在门分类水平还是属分类水平, 3种不同pH紫色土中的微生物群落结构均有极显著的差异.
RDA结果佐证了3种不同pH紫色土中微生物群落结构的显著差异, 土壤因子对土壤微生物的群落结构都具有显著的影响, 且土壤pH的影响是最大的, 这与许多以往的研究结果是相符的[14, 33, 36].Bahram等[33]的研究通过对全球189个不同地点的7 560余份土壤样本的宏基因组和扩增子测序数据进行分析, 结果发现细菌和真菌都表现出全球性的生态位分化, 且与土壤pH和降水量密切相关, pH是影响细菌群落结构和多样性的最主要的因素.虽然pH被认为是解释土壤中微生物群落变化的最重要因素, 但pH以外的其他因素也会影响微生物的结构, 如有机质含量、水分、养分有效性和土地利用方式等[16, 41, 42].在本研究中, 除了pH外, 土壤有机质、氮素和水分也都对微生物群落结构有一定影响.在美国不同土地利用方式土壤中, 利用鸟枪法测序也发现微生物群落结构与土壤某些性质密切相关, 如在森林土壤中, 微生物群落结构与土壤有机质和土壤潜在酸度(H+Al)显著相关; 而在农业土壤和牧场土壤中, 微生物群落结构与pH、Cu、硝态氮含量和碱基饱和度显著相关[16].
由于微生物群落内部存在高度的功能冗余, 因此群落结构并不一定决定了微生物群落的功能[43], 应同时进行微生物分类学和功能分析, 以便更好地理解土壤微生物这个“黑匣子”.于是, 本研究通过与COG/KEGG和氮循环功能数据库进行比对, 将功能基因进行分类注释, 来确定微生物群落组成差异是否会影响微生物群落水平的功能变化.令人意外的是, 尽管这3种数据库的分类原则和分类层次不尽相同, 但分析结果都表明: 即使3种理化性质迥异的紫色土中微生物群落结构差异显著, 但微生物群落的总体功能代谢特征是一致的, 说明微生物的总体功能相对保守, 不容易受环境因子的影响.已有研究获得了与此相似的结果, 如对草地土壤微生物的宏基因组测序发现, 土壤微生物的功能几乎不受季节和土壤深度的影响[44]; 同样地, 在一项对密西西比河进行宏基因组测序的研究中发现, 微生物的“核心功能特性(core functional traits) ”是保守的[45].田美等[46]对两个不同的活性污泥宏基因组进行研究, 发现存在巨大差异的两个微生物群落居然具有相似的功能分配, 甚至在两个理化性质存在极大差异的生态系统中, 如海洋和人类消化道, 也有超过73%的功能是这两个系统微生物菌群共有的[47], 所以在同一生态系统中微生物群落功能没有显著差异也不足为奇.Ye等[34]的研究也表明不同反应器中微生物整体功能代谢途径相似, 但特定代谢途径中的基因序列是不同的, 说明在不同的环境条件下, 可能是由不同的微生物种类来执行特定代谢途径, 从而维持生态系统功能的稳定.本研究中土壤微生物群落结构随土壤性质发生显著变化, 但是功能代谢却相对保守, 说明本研究所用的3种农业土壤中微生物多样性较高, 并且具有较高的功能冗余性, 所以其在环境扰动的情况下仍能维持生态系统的功能稳定.
4 结论(1) 应用宏基因组测序, 在3种不同pH紫色土中共发现89门、222纲、527目、1 009科、2 769属和14 354种微生物, 初探土壤pH对紫色土微生物群落结构和功能特征的影响.
(2) 不管是从门分类水平还是属分类水平, 3种不同pH紫色土的微生物群落结构都有显著差异, 通过冗余分析发现土壤pH对微生物群落结构的影响最大.
(3) 不管是COG/KEGG功能分类数据库还是氮循环功能途径, 3种不同pH紫色土微生物群落的功能特征一致, 土壤微生物群落的总体功能是相对保守的, 不容易受环境因子的影响.
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