2022, Vol. 43
好氧颗粒污泥(AGS)是微生物在一定条件下的自絮凝过程[1].和传统活性污泥法相比, 它具有沉速快, 微生物量大, 耐冲击负荷高以及对毒物的强耐受力等优势[2, 3], 但是, AGS培养时间长和不稳定性制约了颗粒污泥在污水处理中的大规模应用[4].
加快AGS培养策略主要通过向良好絮状污泥中投加絮凝剂和惰性载体、添加钙铁金属离子、接种成熟AGS和投加特殊菌种等方法[5].宋志伟等[6]的研究通过向系统投加生物絮凝剂, 加快污泥颗粒化过程.Kong等[7]的研究采用在良好絮状污泥中添加铁离子来培养AGS.Pijuan等[8]的研究采用絮状污泥和破碎的AGS混合进行颗粒化培养, 18 d完成颗粒化.尹志文等[9]的研究为了加快AGS的培养, 将黄孢原毛平革菌(Phanerodontia chrysosporium)菌丝球作为诱导凝结核投入活性污泥中, 力求缩短AGS培养时间.
近年来, 随着研究的不断深入, 丝状菌结构在AGS培养过程中逐渐受到关注.丝状菌作为污水生物处理中的常见菌种, 对AGS的良好运行起到重要作用[10].有研究证明, 丝状细菌可以促进大粒径AGS的形成[11]. De Graaff等[12]的研究通过硫酸盐和硫代硫酸盐培养硫丝菌为主体的AGS, 实现长期稳定运行.Zou等[13]的研究通过向AGS中添加BAS, 促进AGS的形成.
丝状菌膨胀污泥含有丰富的丝状菌种类, 对其接种进行颗粒化培养, 探究丝状菌和AGS形成的相互作用的研究屈指可数.关于影响AGS稳定运行方面的因素, 主要集中于运行条件的变化, 比如碳氮比、溶解氧、有机负荷、温度和水力剪切力等方面[14].膨胀污泥和絮状污泥在相同运行条件下, 两者对于维持稳定性是否有差别, 需要深入研究.
因此, 本研究将分别接种膨胀污泥和絮状污泥作为试验种泥, 对比两种类型污泥的颗粒化过程及稳定性; 利用具有低成本、速度快、灵敏度高、准确度高[15]且可全面分析环境中绝大部分微生物特点的高通量测序技术对微生物群落结构及多样性进行分析; 探究不同条件下污染物去除效果, 旨在为AGS的实际稳定运行提供参考.
1 材料与方法 1.1 试验装置与运行本试验采用两个完全相同的序批式(SBR)反应器, 装置如图 1. SBR反应器由双层有机玻璃构成, 配有曝气盘, 转子流量计和空气压缩机等.WTW-3420型溶氧仪实时监测反应器内DO和pH值.反应器有效容积(V)6 L, 高(H)90 cm, 高径比(H/D)10, 出水口距底部24 cm.进水、曝气、沉淀和排水时间均由智能控制装置进行控制, 恒温装置维持反应器运行温度在25℃左右.
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1.搅拌桨; 2. DO探头; 3.pH探头; 4. WTW3420探测仪; 5.恒温控制器; 6.出水阀; 7.曝气盘; 8.转子流量计; 9.空气压缩机; 10.进水箱; 11.进水阀; 12.蠕动泵; 13.电动搅拌器; 14.电动机 图 1 SBR反应器示意 Fig. 1 Hint of SBR reactor |
本试验每天运行4个周期, 每个周期为6 h, 体积交换率为67%.反应器表观气速为5.24×10-3m·s-1, DO>5 mg·L-1, 各阶段运行方式见表 1.
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表 1 反应各阶段运行方式 Table 1 Operation mode of each reaction stage |
1.2 种泥来源及试验水质
SBR1接种的膨胀污泥取自某水厂序批式反应器, MLSS为2 608 mg·L-1, SVI为241.56 mL·g-1. SBR2接种的絮状污泥取自二沉池回流污泥, MLSS为3 737 mg·L-1, SVI为64.22 mL·g-1.革兰氏染色如图 2.观察到SBR1污泥絮体结构松散, 大量丝状菌伸出絮体外部, 发生丝状菌污泥膨胀; SBR2污泥絮体结构紧致, 存在极少丝状菌.
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图 2 革兰氏染色 Fig. 2 Gram staining |
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表 2 人工配水水质 Table 2 Quality of artificial water distribution |
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表 3 微量元素配方 Table 3 Formula of trace elements |
1.3 常规分析项目与方法
SV测定采用体积沉降比法; MLSS和MLVSS测定分别采用重量法和马弗炉燃烧减重法; NH4+-N、NO2--N、NO3--N和PO43--P的测定参照文献[16]的方法. COD采用连华科技5B-3COD快速测定仪器测定.pH、DO和温度采用WTW-3420型测定仪测定.
EPS提取采用NaCl热提法[17], 其中的蛋白质(PN)和多糖(PS)分别采用酚试剂法(Lowry)和蒽酮硫酸法测定.好氧颗粒污泥粒度分布采用激光粒度仪(MASTERSIZER S3500)分析测定.Olympus BX61荧光显微镜进行常规镜检; AGS形态结构采用扫描电镜(SEM S-3400N)测定.
1.4 高通量测序高通量测序方法如下: 首先采用土壤DNA提取试剂盒完成泥样DNA提取, 并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测.之后按指定测序区域(本文中细菌: 16S rRNA V3-V4区域; 真菌: ITS1区域), 合成特异引物.其中PCR采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase; PCR仪: ABI Geneamp@9700型.每个样品扩增3次并将PCR产物混合, 混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 并使用AxyprepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物.最后PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行检测定量, 并按照每个样品的测序量要求, 进行相应比例混合, 后建库上机测序.
测序后得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接, 同时对序列质量进行质控和过滤, 均一化处理后, 按照相似度(一般为97%)进行OUT聚类.借助美吉生物云平台进行α多样性分析和物种组成分析, 借助Excel对相对丰度数据整理汇总, 采用Origin软件进行绘图.
2 结果与讨论 2.1 污泥颗粒化进程及颗粒形态分析通常将粒径大于0.3 mm的污泥称为颗粒污泥.如图 3, SBR1和SBR2分别在20 d和40 d出现颗粒, SBR1颗粒化时间更短, 可能是SBR1接种污泥来源于水厂序批式反应器, 较大的高径比和表观气速对颗粒生长的贡献作用[18], 污泥初始粒径较大; 其次污泥处于膨胀状态, 存在部分疏水性丝状细菌加速颗粒化.Wilén等[19]的研究表明, 种泥存在一定数量的疏水性细菌可以导致更快的颗粒化速度.
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累积分布为N的颗粒粒径 图 3 颗粒粒径分布 Fig. 3 Particle size distribution |
阶段Ⅰ, 两反应器污泥粒径都不断增大, SBR1和SBR2颗粒成熟后粒径分别为650 μm和700 μm.如图 4(a1)~4(a3)所示, SBR1成熟颗粒污泥形状规则, 表面光滑, 大量的杆菌和球菌紧密结合在一起, 丝状菌作为骨架支撑颗粒结构.此外, 观察到有少量缝隙存在, 这些缝隙可作为物质间的交换通道.如图 4(b1)~4(b3))所示, SBR2成熟颗粒污泥形状不规则, 表面粗糙, 存在绒毛, 并伴随大量累枝虫出现, 整个颗粒结构疏松.
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(a)SBR1, (b) SBR2 图 4 颗粒形态观察 Fig. 4 Particle morphology observation |
阶段Ⅱ, SBR1粒径明显下降, 从650 μm降到400 μm, 但15 d内得到快速恢复, 最终稳定在600 μm左右.如图 4(a4)所示, SBR1出现少量絮状污泥, 但整体颗粒状态未受到影响. SBR2粒径轻微增长到800 μm.如图 4(b4)所示, SBR2观察到丝状真菌从颗粒内部延伸出来, 干扰颗粒状态.
2.2 污泥沉降性能及稳定性分析如图 5所示, 阶段Ⅰ, SBR1和SBR2污泥浓度分别从2 608 mg·L-1和3 737 mg·L-1上升至成熟颗粒5 200 mg·L-1和4 500 mg·L-1.逐渐减少沉淀时间的颗粒培养方式使SBR1和SBR2污泥浓度都反复出现上升下降.成熟颗粒SVI30都稳定在30 mL·g-1左右, 保持着良好的沉降性.此外, SV30/SV5还反映污泥颗粒化程度, 成熟颗粒SV30/SV5为1, 污泥颗粒化完整.
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图 5 SBR1和SBR2颗粒化过程的MLSS、SVI30和SV30/SV5变化 Fig. 5 Changes in MLSS, SVI30, and SV30/SV5 during granulation of SBR1 and SBR2 |
阶段Ⅱ, SBR1颗粒破碎为絮体, MLSS轻微下降并稳定在4 000 mg·L-1, SVI30在40 mL·g-1左右. SV30/SV5下降, 但很快重新得到恢复. SBR2污泥流失严重, MLSS下降至1 000 mg·L-1, SVI30迅速上升, 颗粒污泥发生真菌膨胀, SV30/SV5值持续波动, 颗粒完整性遭到破坏.
2.3 污泥EPS含量及三维荧光分析如图 6所示, 阶段Ⅰ, SBR1和SBR2的EPS含量(以VSS计)分别从108.10 mg·g-1和126.83 mg·g-1增加至成熟颗粒220.87 mg·g-1和174.39 mg·g-1.EPS是由特定微生物分泌的黏性物质, 有利于细菌絮凝和颗粒化进程[20].阶段Ⅱ, SBR1和SBR2的EPS含量下降.
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图 6 EPS含量和PN/PS变化 Fig. 6 EPS content and PN/PS values |
蛋白质(PN)和多糖(PS)是EPS的主要组成成分, 且PN/PS对颗粒化及稳定性具有指示作用[21].阶段Ⅰ, SBR1和SBR2中PN/PS分别从2.41和3.0上升为成熟颗粒污泥4.34和4.15.整体来看, PN/PS在SBR1中增速较快, 且最终PN/PS大于SBR2中.阶段Ⅱ, PN/PS都有不同程度下降.推测SBR1中较快的PN/PS增值和高EPS含量可能也是SBR1颗粒化速度比SBR2快的原因.
分别对SBR1和SBR2种泥及成熟颗粒污泥进行三维荧光分析, 如图 7所示, 出现的激发/发射(Ex/Em)荧光峰如下: 芳香族蛋白类荧光峰A[22](Ex为280~290 nm, Em为335~345 nm), 荧光峰B(Ex为225~230 nm, Em为305~335 nm); 类腐殖酸荧光峰C[23](Ex为350~365 nm, Em为440~445 nm), 荧光峰D(Ex为275 nm, Em为440 nm).
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(a)SBR1, (b)SBR2 图 7 不同状态下AGS的3D-EEM光谱 Fig. 7 3D-EEM spectra of AGS in different states |
蛋白类荧光峰A和B出现在SBR1和SBR2成熟颗粒中, 说明PN对AGS的形成至关重要.有研究证明蛋白质可以增强污泥的疏水性[24], 有利于污泥颗粒化. SBR1成熟颗粒污泥荧光峰A和B的荧光强度与膨胀污泥基本相同, 是因为膨胀污泥在颗粒化过程中, SV30下降导致污泥微生物种类变化, PN含量也随之变化, PN/PS先下降后上升.而SBR2成熟颗粒污泥荧光峰A和B的荧光强度要高于接种的絮状污泥, 说明在SBR2颗粒化过程中, 蛋白类物质的含量在增加.Lurie等[25]的研究发现腐殖质成分中包含的羧基等官能团, 氢离子可解离与溶液中阳离子进行置换, 具有高负电荷, 不利于污泥颗粒化.但类腐殖酸荧光峰C和D在两反应器中荧光强度弱, 未对污泥颗粒化及絮凝能力产生负影响.
2.4 污染物去除效果如图 8所示, 阶段Ⅰ末期颗粒成熟后, SBR1和SBR2系统的COD、NH4+-N、TN去除率分别为94%、99%、35%和92%、97%、30%, 去除效果接近, 两系统的脱氮产物都是NO3--N.阶段Ⅱ缺氧区添加后, SBR1和SBR2系统的COD和NH4+-N去除效果基本保持不变.但值得注意的是SBR1脱氮产物NO3--N含量明显减少, TN去除率上升至55%, 提高了系统的反硝化能力. SBR2系统出现NO2--N累积, TN去除率上升为60%, 比SBR1反硝化效果稍好.分析原因可能是SBR2平均粒径比SBR1大, 同步硝化反硝化效果强, TN去除效果好.
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图 8 COD、NH4+-N、NO2--N和NO3--N变化情况 Fig. 8 Changes in COD, NH4+-N, NO2--N, and NO3--N |
两反应器除磷效果如图 9.阶段Ⅰ初期, SBR1和SBR2随着沉降时间缩短, 沉降性能差的污泥排出反应器, 系统除磷效果良好.末期, 好氧颗粒逐渐成为主体, 为保证系统的正常运行, 设定污泥龄在10 d左右. SBR1和SBR2磷去除率分别是65%和20%, SBR2除磷效果差是因为系统中大量丝状真菌繁殖, 与聚磷菌间形成竞争.阶段Ⅱ, SBR1磷去除率轻微下降至60%, SBR2磷去除率上升至30%.缺氧区对部分丝状真菌抑制和SBR2粒径持续增大, 为聚磷菌提供生存空间, SBR2磷去除率上升.
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图 9 PO43--P变化情况 Fig. 9 Change in PO43--P |
为探究污泥颗粒化过程中的微生物群落结构, 分别取种泥(第1 d), 絮状-颗粒状混合污泥(SBR1: 15 d; SBR2: 25 d), 成熟颗粒污泥(SBR1: 80 d; SBR2: 90 d)进行高通量测序分析, SBR1命名为Y1、Y2和Y3, SBR2命名为Z1、Z2和Z3.
Ace和Chao指数用来表征微生物群落丰度.由表 4可知, SBR1和SBR2随着颗粒化进行, Ace和Chao指数不断下降, 表明微生物群落丰度不断下降.
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表 4 细菌群落多样性指数1) Table 4 Bacterial community diversity index |
Shannon和Simpson指数用来衡量微生物多样性. SBR1中Shannon指数先上升后减少, Simpson指数先减少后上升, 说明细菌群落多样性先增加后减少, 最终成熟颗粒细菌多样性大于膨胀种泥.而SBR2中Shannon指数先减少后上升, Simpson指数持续增长, 最终成熟颗粒细菌多样性小于絮状种泥.有研究发现, 在颗粒化过程中, 细菌群落多样性降低可能与沉降时间缩短的生物选择机制有关[26], 这与在SBR2中的研究结果一致.但在SBR1中, 生物淘洗作用似乎不明显, 可能是种泥中丝状菌为微生物生长提供附着点, 加速颗粒形成, 颗粒污泥占据主体后不断增长繁殖, 细菌群落多样性增加.
2.5.2 细菌群落结构分析图 10分别为SBR1和SBR2颗粒化阶段细菌优势门(相对丰度>1%)的相对丰度.在SBR1(Y3)和SBR2(Z3)中, 第一优势门为放线菌门(Actinobacteria), 相对丰度分别为51.63%和41.97%; 第二优势门为变形菌门(Proteobacteria), 相对丰度分别为28.13%和36.20%.Li等[27]的研究发现, 在颗粒化过程中, 缩短沉降时间可能导致Actinobacteria数量减少.但在本试验中, 缩短沉降时间, Actinobacteria相对丰度却呈上升趋势, 表明其在参与颗粒化进程中有重要意义.Proteobacteria主要参与EPS分泌, 对AGS形成有贡献作用[28].
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图 10 门水平微生物群落结构组成 Fig. 10 Composition of microbial community structure at phylum level |
在SBR1(Y3)和SBR2(Z3)中, 第三优势门分别为髌骨菌门(Patescibacetria)和拟杆菌门(Bacteroidetes), 相对丰度为14.44%和10.56%, 有研究指出, Patescibacetria与氮循环的相关基因(nifH和amaA)间有协同作用[29], Patescibacetria的存在可能与良好的氮去除效果有关.Bacteroidetes属于异养菌, 可参与有机碳和蛋白物质的循环[30].
为更深入了解颗粒化进程中的相关特定菌株, 对相对丰度>1%的优势属变化情况进行分析.如图 11所示, SBR1(Y3)中生物脱氮菌属主要有副球菌属(Paracoccus, 7.85%)、博斯氏菌属(Bosea, 2.5%)、unclassified_f_Comamonadaceae (0.83%)、黄杆菌属(Flavobacterium, 0.35%)等异养硝化菌属和部分自养硝化菌属. SBR2(Z3)生物脱氮菌属主要有Plasticicumulans(8.94%)、黄杆菌属(Flavobacterium, 1.59%)、unclassified_f_Comamonadaceae (1.40%)和自养硝化菌属(Nitrospira, 0.97%)等.
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(a)SBR1; (b)SBR2 图 11 属水平微生物群落结构组成 Fig. 11 Composition of microbial community structure at genus level |
Paracoccus可分泌EPS, 促进颗粒稳定性[31]. Flavobacterium是AGS中常见且稳定存在的菌属, 对EPS产生和有机物去除有重要作用, 其存在还可作为AGS丝状骨架[32]. Plasticicumulans是活性污泥法中的主要菌属, 能利用多种有机化合物作为碳和能源, 例如醋酸盐, 乙酸等[33, 34]. 在SBR1(Y3)和SBR2(Z3)中承担硝化功能的主要是异养硝化菌, 这可能与本试验中高氨氮负荷[0.28 kg·(m3·d)-1]有关.Zhao等[35]的研究表明, 在高COD负荷及高NH4+-N负荷下培养的AGS, 硝化作用也主要依靠异养硝化菌, 但是氮去除机制仍需要进一步研究.
SBR1(Y3)中除磷菌属主要有小月菌属(Microlunatus, 5.57%)、Amaricoccus(4.91%)、微白霜菌属(Micropruina, 3.85%)和部分放线菌属, 相对丰度随颗粒化上升, 提升系统除磷效果. Microlunatus在污水处理中普遍存在. Amaricoccus和磷的去除效果联系紧密[36]. Micropruina属于放线菌门, 可以利用多种碳水化合物[37]和诱导良好沉降性[38]. SBR2(Z3)中微白霜菌属(Micropruina, 13.21%)、norank_f_Saprospiraceae(0.20%)和脱氯菌属(Dechloromonas, 0.03%)是主要除磷菌属, 除Micropruina相对丰度随颗粒化增加, 其余除磷菌属丰度都不断减少甚至消失, 导致SBR2除磷效果差. norank_f_Saprospiraceae和Dechloromonas兼具反硝化与除磷功能[39, 40].
值得注意的是, norank_o_Saccharimonadales、unclassified_o_Saccharimonadales和unclassified_f_Saccharimonadaceae在SBR1和SBR2颗粒化过程中均有出现. Chen等[38]的研究指出, 这类疏水性细菌的累积可以促进成熟AGS形成. SBR1(Y3)中, norank_o_Saccharimonadales、unclassified_o_Saccharimonadales和unclassified_f_Saccharimonadaceae的相对丰度为4.09%、3.15%和1.12%, 而SBR2(Z3)中, 此类疏水性细菌相对丰度之和不足2%, 这可能是SBR1颗粒化时间较短的原因.
2.5.3 真菌群落多样性分析由表 5可知, SBR1和SBR2系统Ace和Chao指数不断下降, 表明系统内真菌丰度在减少.此外, 两反应器Shannon指数下降, Simpson指数上升, 说明真菌群落多样性在下降, 且SBR2中真菌多样性更丰富.
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表 5 真菌群落多样性指数 Table 5 Fungal community diversity index |
2.5.4 真菌群落结构分析
图 12分别为SBR1和SBR2颗粒化阶段真菌优势门(相对丰度>1%)的相对丰度.在SBR1(Y3)中, 第一, 二优势门为担子菌门(Basidiomycota)和unclassified_k_Fungi, 相对丰度分别为97.1%和1.69%.在SBR2(Z3)中, 第一, 二优势门为Rozellomycota和子囊菌门(Ascomycota), 相对丰度分别为62.9%和22.5%.Basidiomycota在环境中很常见, 参与生态系统养分循环. Ascomycota为好氧真菌, 是真菌类中最大的菌群. Sharaf等[41]对好氧颗粒污泥丝状真菌(Ascomycota)过度生长研究发现, 此类菌对COD及氨氮去除效果影响微弱, 主要是造成系统除磷效果差.Rozellomycota倾向存在于缺氧环境中, 喜食有机碎片, 具有几丁质孢子, 但是否通过几丁质孢子吸收营养物质, 尚不清楚[42].
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(a)SBR1; (b)SBR2 图 12 门水平微生物群落结构组成 Fig. 12 Composition of microbial community structure at phylum level |
为更深入了解颗粒化进程中的相关特定菌株, 对相对丰度>1%的优势属变化情况进行分析, 如图 13所示.在SBR1中, Cutaneotrichosporon一直是颗粒化过程中的优势属, 其相对丰度从66%(Y1)上升到96%(Y3).该菌非丝状结构, 因此不是SBR1中的丝状骨架.而种泥中的优势属假丝酵母菌属(Candida)、Apiotrichum和unclassified_k_Fungi相对丰度分别从7%、7%和7%下降至0%、1%和2%. Candida是公认的病原体, 可能会对水生态环境造成严重威胁[43, 44].
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图 13 属水平微生物群落结构组成 Fig. 13 Composition of microbial community structure at genus level |
在SBR2中, unclassified_p_Rozellomycota的相对丰度从接种泥样13.39%(Z1)增加到62.92%(Z3)成为主要优势菌.Rozellomycota属寄生真菌, 其菌丝体由寄主产生, 内寄生细胞分化为多刺且呈褐色的孢子囊.本试验中真菌unclassified_p_Rozellomycota的相对丰度增加是SBR2沉降性能恶化的因素.此外, Jiang等[45]和Tedersoo等[46]在对环境因素与微生物多样性之间关系的研究中发现, Rozellomycota丰度和总磷的浓度呈正相关, 此类真菌吸收磷用于生长. Sharaf等[41]的研究也发现, 好氧颗粒污泥中Rozellomycota生长对碳、氮去除效果影响微弱, 主要是对磷去除效果产生影响, 这与本试验的结果一致.其他菌如Fusicolla和Cutaneotrichosporon相对丰度从种泥0.34%和2.04%增加到7.94%和8.70%.
3 结论(1) 活性污泥中丝状菌的大量存在能显著缩短污泥颗粒的形成时间.分别接种膨胀和絮状污泥进行颗粒化培养, 膨胀污泥和絮状污泥颗粒出现时间分别为20 d和40 d, 膨胀污泥颗粒化时间更短, 且成熟颗粒形态规则, 表面光滑, 丝状菌作为骨架支撑颗粒结构.
(2) 丝状菌膨胀污泥培养形成的颗粒污泥稳定性更强更易维持.缺氧区添加后, 膨胀污泥培养的成熟颗粒虽受搅拌破碎出现絮体, 但SVI30稳定在40 mL·g-1, SV30/SV5值短期波动后迅速恢复至1.
(3) 微生物群落结构分析表明, norank_o_Saccharimonadales、unclassified_o_Saccharimonadales和unclassified_f_Saccharimonadaceae等疏水性细菌促进成熟AGS的形成.真菌unclassified_p_Rozellomycota大量增殖是絮状污泥培养颗粒运行恶化的原因, 可能与缺氧区添加及流量计失调有关.
(4) 污染物去除效果表明, 膨胀污泥培养的成熟颗粒COD、NH4+-N和TN去除效果与絮状污泥相差不大, 但除磷效果要更好.
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