2022, Vol. 43
2. 中国科学技术大学生命科学学院, 合肥 230026;
3. 江西省科学院能源研究所, 南昌 330096;
4. 河北省安平县弘嘉环保技术有限公司, 衡水 053600
2. College of Life Science, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China;
3. Institute of Energy, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, China;
4. Anping Hongjia Environmental Protection Technology Co., Ltd., Hengshui 053600, China
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)作为一种新型生物脱氮技术, 相较于传统的硝化反硝化工艺, 具有无需外加碳源、曝气能耗低、环境友好等优点[1].厌氧氨氧化是以NO2--N为电子受体, 氧化NH4+-N生成N2的过程, 处理城市污水时常和部分亚硝化(PN)组成部分亚硝化-厌氧氨氧化(combined partial nitritation and anammox process, CPNA)工艺[2].相较于分体式CPNA工艺, 一体式CPNA工艺具有占地面积小、性价比高等优点.目前全世界已经有100多座PNA工艺投入实际应用, 然而有50%都遭遇了污泥膨胀问题[3].
污泥膨胀是活性污泥法经常面临的问题, 它会使污泥沉降性能恶化, 导致出水水质难以达标[4].污泥膨胀通常由丝状菌引起, 传统方法一般是通过形态学鉴定膨胀污泥中的丝状菌, 根据丝状菌类型制定特异性控制策略[5].然而, 根据形态学鉴定常常会低估丝状菌的多样性, 而16S rRNA高通量测序技术则能更好地识别和描述膨胀污泥中丝状菌的多样性[6].16S rRNA高通量测序技术已经用于CPNA微生物群落分析, 16S rRNA高通量测序结果表明, CPNA工艺主要菌门组成是变形菌门(Proteobacteria)、装甲菌门(Armatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、Ignavibacteriae和浮霉菌门(Planctomycetes)[1, 7, 8].然而, 污泥膨胀对CPNA工艺中微生物群落组成结构及其演替造成的影响目前还尚未可知.
理论上, 一体式CPNA工艺中处理污水时会生成11%的NO3--N, 这造成处理效率下降.因此, 针对NO3--N的生成和积累, 有研究提出投加乙酸钠等易降解有机物促进部分反硝化反应的进行, 既可生成厌氧氨氧化工艺所需的NO2--N, 又能消除NO3--N积累[9], 然而, 碳源投加也是引起污泥膨胀的因素[10].此外, 通过16S rRNA高通量测序结合PICRUSt2基因功能预测分析, 已有研究对一体式CPNA工艺中的碳、氮代谢特征进行了相关分析[11, 12].然而, 利用PICRUSt2对一体式CPNA工艺污泥膨胀和恢复过程中碳、氮代谢特征分析还处于空白.
综上, 一体式CPNA工艺污泥膨胀的微生物生态学机制仍需进一步研究.所以, 本文基于16S rRNA高通量测序技术和PICRUSt2的功能预测探讨, 对一体式CPNA工艺污泥膨胀和恢复过程中微生物群落结构演替和碳、氮代谢特征进行分析, 以期为解决一体式CPNA工艺污泥膨胀问题提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 试验装置如图 1所示, 一体式CPNA反应器为长方体池体结构(长×宽×高=5.4 m×5.4 m×4 m, 有效体积为116.6 m3), 反应器配有pH、溶解氧(DO)和温度(T)在线监测仪表, 底部装有曝气管, 采用间歇曝气方式, 其中DO浓度通过调节风机频率控制, 采用PLC自控装置运行, 反应器pH为7~8.
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1.进水泵, 2.电磁阀, 3.鼓风机, 4.穿孔通风管, 5.微孔通风管, 6.浮动污水泵, 7.pH值、DO仪表, 8.加药装置, 9.PLC自控; 引自文献[13] 图 1 一体式CPNA反应器示意 Fig. 1 Schematic diagram of the CPNA reactor |
本试验用水为衡水京安污水处理厂出水沼液中投加试剂配制而成的模拟废水, 其中出水沼液不含NO2--N和NO3--N, ρ(NH4+-N)为(146.57±39.80) mg·L-1, ρ(COD)为(95.75±52.50)mg·L-1, NH4+-N和COD以碳酸氢铵(NH4HCO3)固体和乙酸钠(CH3COONa)固体的形式按需投加, 其中CH3COONa投加仅持续80 d.
反应器试验污泥为成功启动并稳定运行半年的一体式CPNA反应器活性污泥, 混合液悬浮固体浓度(MLSS)和混合液挥发性悬浮固体浓度(MLVSS)分别为5.76 g·L-1和4.79 g·L-1, MLVSS/MLSS为0.83.
根据标准分析方法[14], NH4+-N测定采用纳氏试剂比色法; NO2--N测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N测定采用紫外分光光度法; COD测定采用重铬酸钾法; SS、VSS采用重量法.
1.3 运行方案与污泥样品采集一体式CPNA反应器采用序批式生物反应器(SBR)方式运行. SBR的运行周期为24 h, 包括进料1 h, 间歇式运行20 h, 沉淀2 h, 排水1 h.采用间歇曝气, 通过调节风机频率控制溶解氧(DO).前110 d反应器不排泥, 将污泥流失考虑在内, 估算SRT为35 d; 110 d后SRT控制为22 d.反应器运行140 d, 分为4个阶段, 各操作参数设定如表 1所示.
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表 1 各阶段操作参数 Table 1 Operating parameters of each stage |
在一体式CPNA反应器运行过程, 分别在阶段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ采集污泥样品, 具体在第12、41、70、82、100和116 d时取反应器内混合均匀的污泥混合液, 编号分别记为S-12、S-41、S-70、S-82、S-100和S-116.采集的污泥样品经离心后, 于-80℃冰箱保存待用.取样期间反应器运行性能及污泥沉降性能如表 2所示.
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表 2 取样期间CPNA反应器的运行性能及污泥沉降性能 Table 2 Operation performance and sludge settling performance of the CPNA reactor during sampling |
1.4 DNA提取及高通量测序
采用FastDNA ® SPIN Kit for soil(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, U. S)试剂盒提取污泥总DNA, 具体步骤按照操作说明书; 对提取得到的污泥样品总DNA做琼脂糖凝胶电泳进行定性检测, 采用分光光度计对DNA浓度、纯度进行检测, 将提取得到的污泥总DNA放置于-80℃冰箱保存.
针对细菌的16S rRNA基因V4区, 采用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增.PCR扩增的体系如下: 4 μL的10×FastPfu buffer, 2 μL的dNTPs(2.5mmol·L-1), 1 μL的上下游引物(5 μmol·L-1), 0.4 μL的FastPfu聚合酶, 1 μL的DNA模板, ddH2O补足至25 μL.PCR扩增程序为: 95℃预变性2 min; 95℃变性45 s; 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 共循环27次后72℃终止延伸10 min.
PCR扩增产物经过2%的琼脂糖凝胶检测、凝胶回收试剂盒纯化以及定量分析后, 构建MiSeq文库, 采用Illumina MiSeq平台进行高通量测序.本研究测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成.
1.5 数据分析高通量测序得到的原始数据经过质量控制和过滤, 去除嵌合体和非特异性扩增序列.将得到的序列与NCBI 16S rRNA数据库进行Blast对比, 采用Usearch软件将相似度在97%及以上的序列归类OTU单元.使用mothur计算Alpha多样性指数: Shannnon、Simpson、Ace、Chao和Coverage指数.采用PICRUSt2软件对16S rRNA高通量测序数据进行功能预测, 参考KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库, 得到KO(KEGG Orthology)功能的丰度预测及KEGG代谢途径(KEGG pathway)丰度.数据绘图采用Origin 2018 (OriginLab, USA)绘制门水平上物种丰度冲击堆积图, 采用hemI 1.0.1 (USA)绘制属水平相对丰度热图, 采用hiplot在线工具(https://hiplot.com.cn/)绘制氮代谢和碳代谢功能基因相对丰度热图.
2 结果与讨论 2.1 微生物群落演替特征 2.1.1 α多样性分析通过对反应器运行4个阶段的6个污泥样品进行16S rRNA高通量测序, 得到的α多样性指数如表 3所示.以最少序列数64 448进行抽平, 将相似性在97%及以上的OTU序列归类进行α多样性分析. Coverage指数都在0.994及以上说明测序深度对样品的覆盖率高, 代表了样品的真实情况. Ace、Chao和Shannon指数在阶段Ⅰ~Ⅲ逐渐升高, Simpson指数在阶段Ⅰ~Ⅲ逐渐下降, Ace指数和Chao指数代表物种丰富度, Shannon指数和Simpson指数代表物种多样性, 说明随着污泥膨胀, 物种丰富度和多样性逐渐上升, 而阶段Ⅲ的S-82污泥样品Ace指数和Chao指数下降, Simpson指数上升, 表明第81 d停止投加乙酸钠以后群落多样性略有降低. Ace、Chao和Shannon指数在阶段Ⅳ下降, Simpson指数上升, 表明随着污泥膨胀逐渐恢复, 物种丰富度以及多样性逐渐降低, 逐渐恢复成功能专一的菌群结构.在以往乙酸钠引起污泥膨胀的研究中, 微生物多样性和丰富度都是随着污泥膨胀逐渐下降[10].本研究与之不同, 主要是整个过程中MLSS没有发生明显变化, 乙酸钠的持续投加促进异养微生物繁殖, 之后经过停止投加乙酸钠(第81 d)、调整SRT(第111 d)和调整曝停比(阶段Ⅳ)等举措以后异养菌被淘洗, 微生物菌群结构调整, 逐渐恢复功能专一.
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表 3 不同污泥样品的α多样性分析 Table 3 The α diversity analysis of different sludge samples |
2.1.2 微生物群落结构演替
门水平和属水平的微生物群落结构如图 2和图 3所示.在门水平上, 优势菌门主要是变形菌门(Proteobacteria)、装甲菌门(Armatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、Ignavibacteriae、浮霉菌门(Planctomycetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、Latescibacteria、厚壁菌门(Firmicutes)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae), 它们的相对丰度总和占总丰度的87.18% ~98.41%.
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图 2 门水平上的微生物群落结构变化 Fig. 2 Change in microbial community structure at phylum level |
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图 3 属水平上的微生物群落结构变化 Fig. 3 Change in microbial community structure at genus level |
变形菌门为一体式CPNA体系中的主要优势菌门[15], 其相对丰度在阶段Ⅰ从43.57%上升到了48.44%, 在阶段Ⅱ、Ⅲ中下降到35.90%, 阶段Ⅳ其相对丰度恢复到40.67%, 说明其相对丰度随着污泥膨胀的发生而下降, 随着污泥膨胀的恢复而升高.从属水平上来看, 阶段Ⅰ变形菌门相对丰度上升主要归功于Thauera、Azoarcus和Labilithrix, Thauera、Azoarcus和Labilithrix的相对丰度从S-12的11.86%、5.35%和0.26%上升到S-41的16.34%、7.05%和1.63%, 这主要是乙酸钠作为碳源, 促进了它们在反应器中繁殖. Thauera是典型的异养反硝化菌[16], 它和Candidatus Kuenenia协同负责ANAMMOX中的碳氮代谢, 和Candidatus Kuenenia在维生素和氨基酸水平还存在交互营养共生关系.有研究发现C/N比与Azoarcus的nirS基因呈显著正相关关系[17], 高C/N有利于Azoarcus的部分反硝化反应.阶段Ⅱ和Ⅲ变形菌门相对丰度下降主要归功于AOB菌Nitrosomonas、反硝化菌Thauera和Azoarcus, Nitrosomonas、Thauera和Azoarcus相对丰度从S-41的9.08%、16.34%和7.05%分别下降到S-100的5.97%、8.30%和1.87%. AOB菌Nitrosomonas主要存在絮体污泥中, 容易随着污泥流失, 也有研究发现随着AOB菌相对丰度下降, 污泥沉降性能逐渐恶化[18], 而反硝化菌Thauera、Azoarcus相对丰度也由于污泥膨胀和停止投加乙酸钠双重原因而下降.阶段Ⅳ除了Thauera和Comamonas以外, 变形菌门其他菌属相对丰度都有所上升, Nitrosomonas、Azoarcus和Dokdonella上升幅度最大, 表明随着污泥膨胀逐渐恢复, 变形菌门及其菌属相对丰度逐渐恢复.装甲菌门的相对丰度在阶段Ⅰ~Ⅳ从12.75%下降到2.04%, 结合属水平的结果来看, 主要菌属Armatimonadetes_gp5和Armatimonadetes_gp3相对丰度从阶段Ⅰ~Ⅳ逐渐下降, 其中Armatimonadetes_gp5相对丰度从S-12的11.33%下降到S-116的2.22%.绿弯菌门作为活性污泥的支架结构, 它可以利用ANAMMOX细菌产生的有机物[19], 而且有许多丝状菌属于绿弯菌门, 例如Anaerolineaceae科的丝状菌.在阶段Ⅰ~Ⅲ, 其相对丰度从9.32%上升到24.06%, 阶段Ⅳ下降到1.32%.从属水平上分析, 主要为Ornatilinea、Aggregatilinea和Thermanaerothrix, 但它们的相对丰度总和不超过8%, 说明污泥膨胀阶段绿弯菌门下的许多低丰度菌属出现, 这些相对丰度水平很低的菌属与污泥沉降性能相关.Ignavibacteriae可以利用凋亡的ANAMMOX细菌作为碳源进行异养生长[19], 从阶段Ⅰ~Ⅲ, 其相对丰度从S-12的7.17%上升到S-70的12.74%又下降至S-100的8.39%, 阶段Ⅳ下降至1.38%.属水平上主要是Ignavibacterium, 它的相对丰度从S-12的6.69%上升到S-70的11.83%又下降到S-100的7.32%.Zhang等[20]的研究发现Ignavibacterium是ANAMMOX体系中利用乙酸钠的主要菌属.浮霉菌门相对丰度在阶段Ⅰ~Ⅲ从5.40%下降至3.58%, 阶段Ⅳ上升至7.36%.属水平上主要是ANAMMOX菌Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia, Candidatus Brocadia相对丰度从S-12的0.272%下降到S-110的0.061%, 而Candidatus Kuenenia相对丰度从S-12的0.893%下降到S-110的0.657%, 表明污泥膨胀期间Candidatus Kuenenia比Candidatus Brocadia更加稳定, 这可能是Candidatus Kuenenia和硝化菌、反硝化菌构成了负责氮、碳代谢的微生物网络[21], 这种营养交互共生策略有利于维持Candidatus Kuenenia在体系中的稳定.Nitrospirae在S-12~S-82的平均相对丰度为0.48%, 在阶段Ⅲ的S-100上升到0.91%.相应的NOB菌Nitrospira在S-100也上升到0.80%, 这主要是污泥膨胀后期出现的NO2--N积累所导致的.
2.2 各特定菌属分析 2.2.1 丝状菌属变化特征如图 4所示, 高通量测序得到的丝状菌分别是Levilinea、Longilinea、Fluviicola和Turicibacter, 而常见的污泥膨胀相关丝状菌如微丝菌Microthrix parvicella、Haliscomenobacter hydrossis[22, 23]等并没有在污泥样品中检测到.这4种丝状菌相对丰度在CPNA体系中都处于较低的水平, 其中Levilinea、Longilinea和Fluviicola都能够在厌氧条件下利用乙酸和丙酸酯等有机物[24, 25], 它们在污泥膨胀初期(S-12)都能保持一定丰度.随着污泥逐渐膨胀(S-70), Levilinea和Longilinea丰度下降, Fluviicola丰度升高, 有研究发现Fluviicola在低曝气条件下具有较强黏附性[26], 并且作为去除COD的核心微生物[27].停加乙酸钠以后, 污泥膨胀仍没有恢复, 此时(S-100)Levilinea、Longilinea和Turicibacter的丰度升高, 成为主要丝状菌, Fluviicola丰度下降.其中Levilinea还能进行部分反硝化反应[28], Longilinea在有机负荷波动下具有一定的复原性和稳定性[29].污泥膨胀恢复以后(S-116), Fluviicola丰度升高, 而Levilinea、Longilinea和Turicibacter丰度下降.结果表明Levilinea、Longilinea和Turicibacter是此次污泥膨胀的主要丝状菌.
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红箭头表示相对丰度升高, 黑箭头代表相对丰度下降 图 4 丝状菌属相对丰度变化 Fig. 4 Relative abundance of filamentous bacteria |
图 5是对一体式CPNA反应器中主要的氮素转化菌属进行分析, 主要列举了15种参与生物脱氮的菌属, 根据功能将其分为AOB菌、NOB菌、ANAMMOX菌和反硝化菌, 其中AOB菌是Nitrosomonas, NOB菌是Nitrospira, ANAMMOX菌有Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia[30, 31], 其余都属于反硝化菌.
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1. Nitrosomonas, 2. Nitrospira, 3. Candidatus Kuenenia, 4. Candidatus Brocadia, 5. Comamonas, 6. Denitratisoma, 7. Thauera, 8. Devosia, 9. Hydrogenophaga, 10. Hyphomicrobium, 11. Mesorhizobium, 12. Nitratireductor, 13. Novosphingobium, 14. Acinetobacter; 红箭头表示相对丰度升高, 黑箭头代表相对丰度下降 图 5 氮素转化功能菌相对丰度变化 Fig. 5 Relative abundance of nitrogen-transforming bacteria |
Nitrosomonas相对丰度最高, 在污泥膨胀阶段(S-12~S-70), 相对丰度发生明显下降; 停加碳源后(S-100), 相对丰度仅轻微下降; 污泥膨胀恢复后(S-116), 相对丰度上升. Nitrospira和Vicingus在污泥膨胀过程中相对丰度变化不明显, 并没有随着污泥膨胀而在系统中发生变化. Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia随着污泥膨胀的发生相对丰度下降, Candidatus Brocadia下降更为明显, ANAMMOX菌中Candidatus Kuenenia逐渐占据优势[32], 其中停加乙酸钠后(S-100)Candidatus Brocadia相对丰度有一定的上升, 最后污泥膨胀恢复后, 相对丰度下降.反硝化菌中Thauera和Comamonas相对丰度最高, 其他都处于较低的丰度水平, 在污泥膨胀初期, 有4种反硝化菌属相对丰度升高, 5种反硝化菌属相对丰度下降, 一种保持不变.其中Thauera在整个过程中相对丰度下降, 而反硝化菌Comamonas、Acinetobacter和Novosphingobium相对丰度却与之相反, 有所上升.
可以看到, 氮素转化功能菌群AOB菌Nitrosomonas和Candidatus Brocadia的相对丰度由于污泥膨胀而下降, NOB菌和Candidatus Kuenenia的相对丰度并没有受到明显影响, 反硝化菌Thauera的相对丰度下降; 污泥膨胀恢复后Nitrosomonas、Acinetobacter和Novosphingobium的相对丰度上升.
2.2.3 其他菌胶团菌变化特征图 6所列是相对丰度排名前20的菌胶团菌属, 它们分别属于变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、装甲菌门(Armatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、Chlorobi、Latescibacteria和Spirochaetes, 前6个菌门是厌氧氨氧化体系常见菌门[7].
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1. Azohydromonas, 2. Aggregicoccus, 3. Labilithrix, 4. Dokdonella, 5. Aetherobacter, 6. Gp3, 7. Gp10, 8. Gp4, 9. Gp6, 10. Stenotrophobacter, 11. Subdivision3_genera_incertae_sedis, 12. Spartobacteria_genera_incertae_sedis, 13. Terrimicrobium, 14. Armatimonadetes_gp3, 15. Armatimonadetes_gp5, 16. Aggregatilinea, 17. Ornatilinea, 18. Ignavibacterium, 19. Latescibacteria_genera_incertae_sedis, 20. Turneriella; A. Proteobacteria, B. Acidobacteria, C. Verrucomicrobia, D. Armatimonadetes, E. Chloroflexi, F. Chlorobi, G. Latescibacteria, H. Spirochaetes; 红箭头表示相对丰度升高, 黑箭头代表相对丰度下降 图 6 菌胶团菌属相对丰度变化 Fig. 6 Relative of floc-forming bacteria |
首先是变形菌门(Proteobacteria)中除了Labilithrix以外, 其他4个菌胶团菌的相对丰度都随着污泥膨胀而下降, 随着污泥膨胀恢复而升高.酸杆菌门(Acidobacteria)与变形菌门(Proteobacteria)一致, 除了Gp3以外, 其他4个菌胶团属都随着污泥膨胀而下降.疣微菌门(Verrucomicrobia)中, Spartobacteria_genera_incertae_sedis受到污泥膨胀的影响最强, 相对丰度发生大幅度地下降.而Subdivision3_genera_incertae_sedis相对丰度在整个过程却呈上升趋势.装甲菌门(Armatimonadetes)中, Armatimonadetes_gp5丰度随污泥膨胀下降, 有研究发现Armatimonadetes_gp5在CPNA工艺也能发挥硝化和反硝化作用[33], 而Armatimonadetes_gp3丰度随污泥膨胀上升.绿弯菌门(Chloroflexi)中, Aggregatilinea相对丰度上升, Ornatilinea相对丰度下降.而在Chlorobi中, Ignavibacterium相对丰度上升.值得注意的是, Ornatilinea、Ignavibacterium和Gp4与Candidatus Kuenenia存在显著正相关关系[34], 它们直接或间接与Candidatus Kuenenia作用, 使得Candidatus Kuenenia并没有随着污泥膨胀而发生大幅度地下降.
2.3 PICRUSt2功能预测分析 2.3.1 氮代谢分析为了揭示一体式CPNA反应器污泥膨胀和恢复过程中氮代谢生物机制, 利用KEGG数据库, 通过PICRUSt2预测筛选出与氮代谢相关的功能酶基因, 其相对丰度热图如图 7所示, 一共找到了47个参与氮代谢的功能酶基因, 其中有26个功能酶基因参与5个氮转化过程, 包括硝化、反硝化、异化性硝酸盐还原(DNRA)、同化硝酸盐还原(ANRA)和固氮反应.硝化反应主要功能酶基因包括氨单加氧酶基因(pmoABC-amoABC)、羟胺脱氢酶基因hao、羟胺还原酶基因hcp和亚硝酸盐氧化酶基因narGH.氨单加氧酶基因(pmoABC-amoABC)和羟胺脱氢酶基因hao相对丰度从阶段Ⅰ到Ⅲ呈下降趋势, 阶段Ⅳ上升, S-82略有升高, 与AOB菌Nitrosomonas的相对丰度变化相似.羟胺脱氢酶基因hao的相对丰度是羟胺还原酶基因hcp的5.6~15.6倍, 说明羟胺脱氢酶基因hao占主要地位, 但hao/hcp比值在S-100的时候最低, 说明污泥膨胀对hao有明显影响.亚硝酸盐氧化酶基因narGH相对丰度在阶段Ⅰ升高, 在阶段Ⅱ~Ⅳ一直呈下降趋势, hao相对丰度是narGH的1.1~8.39倍, 且随着污泥膨胀hao/narGH比值降到了1.1, 污泥膨胀恢复后, hao/narGH比值升高到8.39, 污泥膨胀对部分亚硝化反应具有明显影响.
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图 7 氮代谢相关KO基因相对丰度热图 Fig. 7 Heat map of relative abundance of KO genes related to nitrogen metabolism |
参与NO3--N还原的则有ANRA、DNRA和反硝化反应. ANRA主要功能酶基因为nasAB和nirA, nasA相对丰度高出nirA两个数量级, 说明ANRA中主要是进行NO3--N还原成NO2--N这一步. nasA相对丰度在阶段Ⅰ升高, 阶段Ⅱ~Ⅳ逐渐下降. DNRA主要功能酶基因为narI、napAB、nirBD和nrfAH, nrfAH相对丰度比narI、napAB和nirBD都低很多, 所以主要由narI、napAB和nirBD负责将NO3--N还原成NH4+-N, 它们的相对丰度阶段Ⅰ升高, 从阶段Ⅱ到Ⅳ逐渐下降.反硝化反应主要功能酶基因为nirK、nirS、norBC和nosZ, nirS的相对丰度是nirK的2.2~4倍, 所以nirS占主要地位, nirS、norBC和nosZ相对丰度阶段Ⅰ升高, 阶段Ⅱ~Ⅳ逐渐下降.综上, 污泥膨胀初期硝酸盐还原在反应器内增强, 主要是通过ANRA、DNRA和反硝化这3种途径; 之后, 从污泥膨胀到恢复过程, 硝酸盐还原反应逐渐减弱, 这种变化与反应器内反硝化菌Thauera、Comamonas的相对丰度变化趋势一致.
NH4+-N和L-谷氨酸(L-Glu)还存在相互转化关系, 参与NH4+-N转化成L-Glu的主要功能酶基因glnA、gltD和GLU相对丰度在阶段Ⅰ~Ⅲ中呈上升趋势, 表明污泥膨胀阶段L-Glu生物合成活跃, 这也印证了污泥膨胀期间α多样性呈增加变化.
综上, 随着污泥逐渐膨胀, 部分亚硝化功能基因相对丰度呈下降趋势, 部分亚硝化反应逐渐减弱, NO3--N还原功能基因相对丰度呈先上升后下降趋势, 说明乙酸钠在初期对NO3--N还原具有一定促进作用, 随着污泥膨胀严重, NO3--N还原反应也逐渐减弱, NH4+-N转化成L-Glu代谢路径活跃, 细菌蛋白生成活跃.污泥膨胀恢复以后, 相应的部分亚硝化功能基因相对丰度上升, 部分亚硝化反应得到恢复.
2.3.2 碳代谢分析由于一体式CPNA反应器运行前80 d持续投加乙酸钠, 为了研究该反应器污泥膨胀及恢复过程中碳代谢生物机制的变化, 基于KEGG数据库, 通过PICRUSt2功能预测筛选与乙酸钠代谢相关的功能酶基因, 如图 8所示.
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(a)乙酸钠代谢路径, (b)功能酶基因相对丰度热图 图 8 碳代谢相关KO基因相对丰度热图 Fig. 8 Heat map of relative abundance of KO genes related to carbon metabolism |
ANAMMOX细菌以无机碳为碳源并且通过Wood-Ljungdahl pathway(WLP)固定CO2[35]. 检测发现参与CO2固定的相关酶[EC: 1.2.7.4]和[EC: 2.3.1.169]的相对丰度在阶段Ⅰ从0.003%下降到0.001%, 从阶段Ⅱ~Ⅳ逐渐恢复至0.003%和0.002%.相反的, 负责将乙酸钠转化成乙酰CoA的乙酰CoA合成酶[EC: 6.2.1.1](0.082% ~0.09%)的相对丰度从S-12~S-82逐渐升高, 之后呈下降趋势, 说明是乙酸钠的存在抑制了反应器中的自养生长, 促进了异养生长.乙酰CoA是三羧酸循环(TCA cycle)和葡萄糖生成通路的关键中间物, 相应的代谢功能酶基因都已通过筛选找到.TCA循环中柠檬酸合酶[EC: 2.3.3.1](0.076% ~0.085%)相对丰度从阶段Ⅰ~Ⅲ逐渐升高, 阶段Ⅳ下降.负责将异柠檬酸转化成α-酮戊二酸的异柠檬酸脱氢酶[EC: 1.1.1.42](0.074% ~0.086%)相对丰度在阶段Ⅰ~Ⅳ一直呈下降趋势, 该过程产生1分子的NADH+H+共计3分子ATP, 而[EC: 1.2.7.3](0.055% ~0.065%)、[EC: 6.2.1.5](0.065% ~0.074%)和[EC: 1.1.1.37](0.053% ~0.070%)负责的过程共产生2分子NADH+H+和一分子GTP共计7分子ATP, 它们的相对丰度在阶段Ⅰ降低, 阶段Ⅱ~Ⅳ逐渐升高, 而[EC: 1.3.5.4](0.002% ~0.012%)负责的过程中产生1分子FADH2计2分子ATP, 它的相对丰度阶段Ⅰ升高, 随后逐渐降低.综合来看, 阶段Ⅰ产生的ATP减少, 阶段Ⅱ到Ⅳ由于ATP产生上升和下降相互抵消, 没有明显变化, 说明随着污泥膨胀, CPNA中能量产生逐渐减少.葡萄糖生成通路中, 将乙酰CoA转化成3P-甘油酸的相关酶功能基因[EC: 1.2.7.1]、[EC: 2.7.1.40]和[EC: 5.4.2.12]在阶段Ⅰ~Ⅳ呈下降趋势, 说明该过程中葡萄糖合成通路并不活跃.
综上所述, 随着乙酸钠的投加, 虽然将乙酸钠转化成乙酰CoA的功能酶基因表达上调, 相应的参与CO2固定的酶基因表达下调, 但TCA循环途径以及葡萄糖生成通路相关酶基因表达下调, 表明乙酸钠的投加对系统的能量代谢以及葡萄糖生成没有产生促进作用.
3 结论(1) 16S rRNA高通量测序结果表明, 随着污泥膨胀, 微生物多样性逐渐上升, 主要归功于绿弯菌门, 其相对丰度从9.32%上升到24.06%, 而CPNA工艺中其他菌门、菌属相对丰度主要呈下降趋势.
(2) 引起污泥膨胀的主要丝状菌是Levilinea、Longilinea和Turicibacter, 主要脱氮功能菌AOB菌Nitrosomonas、ANAMMOX菌Candidatus Brocadia、反硝化菌Thauera相对丰度都随着污泥膨胀呈下降趋势, 大多数菌胶团菌属相对丰度都随着污泥膨胀而逐渐下降.
(3) 随着污泥逐渐膨胀, 部分亚硝化功能基因相对丰度逐渐下降, NO3--N还原功能基因相对丰度在膨胀初期由于乙酸钠而上升, 之后逐渐下降, 而L-谷氨酸生物合成活跃.
(4) 随着乙酸钠的投加, 细菌的异养生长活跃, 自养生长受到抑制.而乙酸钠的能量代谢和葡萄糖合成却处于不活跃状态.
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